Araştırma yöntemleri B. subtilis Biyofilmler

Özet

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Özet

Bu çalışma, D-amino asitler gibi küçük moleküllü biyofilm inhibitörlerinin Bacillus subtilis biyofilmlerinin gelişimi ve dayanıklılığı üzerindeki etkisini incelemek için farklı metodolojileri değerlendirmektedir. İlk olarak, küçük molekül inhibitörlerinin planktonik büyüme üzerindeki etkisini biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerinden ayırmak için biyofilme özgü hedeflere sahip küçük molekül inhibitörlerini seçen yöntemler sunulmaktadır. Daha sonra, aşılama koşullarının çok hücreli, yüzen B. subtilis kültürlerinin küçük moleküllü inhibitörlere duyarlılığını nasıl etkilediğine odaklanıyoruz. Sonuçlar, D-amino asitler gibi bu tür inhibitörlerin bildirilen etkilerindeki tutarsızlıkların, tutarsız ön kültür koşullarından kaynaklandığını göstermektedir. Ayrıca, küçük moleküllü tedavilerin antibakteriyel maddelere karşı biyofilm direncine katkısını değerlendirmek için yakın zamanda geliştirilen bir protokol tanımlanmıştır. Son olarak, taramalı elektron mikroskobu (SEM) teknikleri, bir B. subtilis biyofilminde hücrelerin ve çevrelerindeki hücre dışı matrisin üç boyutlu uzamsal düzenlemesini analiz etmek için sunulmuştur. SEM, üç boyutlu biyofilm mimarisi ve matris dokusu hakkında bilgi edinmeyi kolaylaştırır. Burada açıklanan yöntemlerin bir kombinasyonu, biyofilm inhibitörlerinin varlığında ve yokluğunda biyofilm gelişiminin incelenmesine büyük ölçüde yardımcı olabilir ve bu inhibitörlerin etki mekanizmasına ışık tutabilir.

Giriş

Çok hücresel bakteri toplulukları doğal ve antropojenik ortamlarda önemli rol oynarlar ve yararlı ya da son derece zararlı olabilir. Bu çok hücreli koloniler tek tek hücreler, kendi kendine üretilmiş hücre dışı polimerik maddeler (EPS) matrisi içinde gömülü olup, burada biyofilm, şekilde bilinmektedir. EPS kuvvetle onlar kolonize yüzeye hücreleri yapışır. Bunlar mekanik ve kimyasal güçlerine karşı bir kalkan görevi ve hücresel haberleşme ¹ kolaylaştırılması, komşu hücreler arasındaki yakın teması oluşturun. Bir biyofilm hücreleri son derece düzenlenir kullanın farklılaştırılmış topluluk olarak görülebilir, türler ^2-5 genelinde yanı sıra, toplum içinde kendi faaliyetlerini koordine etmek süreçlerini düzenledi. Bir biyofilm durumuna büyüme planktonik, serbest yaşayan modundan geçiş genellikle gelişim süreçleri ile ilişkilidir. Bunun iyi bir örneği, Gram-pozitif toprak bakterisi Bacillus subtilis, ve bu nedenle undome olansticated gerilme biyofilm oluşumuna yol açan gelişim aşamalarını incelemek için sağlam bir model organizma olarak hizmet vermektedir. Bu bakteride, hareketli hücreler özel görevleri ⁴ yürütmek göze çarpan çok hücreli yapılara kendilerini organize. Hücre bir grup, matriks-üretici eksopolisakaridleri ⁶ salgılar amiloid protein tasa ^7,8 ve yüzey hidrofobisite proteini BslA ^9,10; bütün bunlar EPS ^11-13 montajı katılırlar.

Doğal ve insan kaynaklı nişler biyofilm bolluğu ve yol açabilir varsayılan ölümcül hasar göz önüne alındığında, onların oluşumunu önlemek için yollar bulmak için acil bir ihtiyaç vardır. Küçük molekül inhibitörleri yeni düzenleyici yollar, enzimler ve biyofilm oluşumunda rol oynayan yapısal proteinlerin keşfi yardımcı ve böylece çok hücreli topluluk montaj karmaşık süreçlerde anlayışlar teşvik edebilir. B. de subtilis bio için iyi çalışılmış bir modeldirfilm formasyonu ^14,15, çeşitli biyofilm inhibitörlerinin etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu çalışma, küçük molekül inhibitörleri ile biyofilm verilen yanıtın değerlendirilmesi için önemli olan dört temel yöntemler ele almaktadır. İlk olarak, bu inhibitörler, bir biyofilm belirli bir hedef sahip olmasını sağlamak için, biyofilm oluşumunu etkisi planktonik büyüme üzerindeki etkisinin ayrılması önemlidir. Çoğu antibakteriyel ajanlar planktonik büyüme fazında hücreleri hedef, ancak biyofilm yaşam tarzı hedef moleküller nadirdir. Planktonik büyümeyi etkilemeyen moleküller toksik değildir Buna ek olarak, antibiyotik dirençli mutantlar ¹⁶ lehine seçici basıncı azaltabilir. Biyofilmler, D-amino asitler ya da diğer bazı hücre duvarı etkileşmeyen molekülleri ile muamele edilir, örneğin, bu da rahatsız veya sökülmesi, fakat bu önleyicilerin sadece hafif planktonik büyüme ^12,17 etkiler. Bunun aksine, çok sayıda antibiyotik önemli ölçüde l, planktonik büyümesini bozanittle veya biyofilm oluşumu ¹⁷ üzerinde hiçbir etkisi.

İkincisi, küçük moleküllerin etkisini araştırmak için tutarlı ve sağlam deneysel çerçevenin oluşturulması çok önemlidir. Bu küçük moleküllü önleyicilerinin etkin bir konsantrasyon aralığı ön kültür koşulları, bu küçük molekül inhibitörlerinin etkisini incelemek için kullanılan deney düzeneği duyarlı olduğu görülmektedir. Özellikle B. okuyan çeşitli raporlar, Kayan bakteriyel biyofilm ^12,17-19 - subtilis D-amino asitler ince zarlar oluşumunu inhibe eden konsantrasyon aralığında varyasyonlar ortaya koymuştur. Burada sunulan sonuçlar, aşağıdaki faktörler aktif madde konsantrasyonu aralığı içinde farklılıkları hesaba işaret etmektedir: ön-kültür koşulları (geç durağan ²⁰ büyüme fazının karşı logaritmik ^12,17), ön-kültür durumda kullanılan büyüme ortamı (zengin, tanımlanan karşı tanımsız [Luria Broth LB] [monosodyum glutamatgliserol, MSgg]), aşılama oranı ve aşılamadan önce ön-kültür ortamı, özellikle çıkarılması. Statik zar büyüme sıcaklığı küçük molekül inhibitörü, D-lösin, bu çalışmada kullanılan Örnek D-amino asit aktivitesi aralığında daha az önemli bir rol göstermiştir.

Son olarak, bir kez biyofilm belirli bir biyofilm önleyicileri, sağlam ve bilgilendirici yöntemler biyofilm uygunluk bu inhibitörlerinin etkilerini karakterize etmek için gerekli olan ile muamele edilir. Bir biyofilm koloni ve antimikrobiyal ajanlara karşı direnç tek hücre (1) üzerine etki: Burada, bağımsız bir şekilde, küçük moleküllü inhibitörlerinin etkisini karakterize etmek için iki yöntem ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Serbest yaşayan bakteriler ^21-23 kıyasla Biyofilmlererde Hücreler genellikle daha dirençli antibiyotiklere vardır. Bu olgu çok faktörlü olmasına rağmen, antibiyotik penetrasyon azaltmak için EPS yeteneği genellikle çekici bir açıklama ²⁴ olarak kabul edildi . Bu yöntem, anti-bakteriyel maddelerin maruz kaldıktan sonra önceden belirlenmiş biyofilm hücrelerinin hayatta kalma değerlendirir. (2) küçük çapta büyük gelen biyofilm koloni mimarisi üzerindeki etkisi. Biyofilm koloniler üç boyutlu yapısı ve EPS varlığı ile karakterize edilir. taramalı elektron mikroskobu kullanarak, hücre morfolojisi, biyofilm koloni yapısı ve EPS mimari ve bolluk içinde değişiklikler küçük ölçekli (um) büyük (mm) den görüntülenebilir.

Protokol

1. zar ve Biyofilm Colony Oluşumu Üzerine Küçük Molekül İnhibitörlerinin Etkisi Değerlendirilmesi

1. Kalsiyum klorür ve demir (III) klorür heksahidrat olmayan tanımlanan biyofilm uyaran MSgg ortamı ²⁵ 2x çözeltisi hazırlayın. filtre sterilizasyonu sonra, kalsiyum klorür ilave edin. ortamı, doğrudan kullanıma hazır ya da karanlıkta 4 ° C'de saklanabilir.
2. Deney gününde 1 MSgg seyreltme hazırlayın.
   1. (Steril damıtılmış su (ince zarlar) ya da steril% 3, sıcak (80 ° C) agarı (biyofilm) 1x 50 uM (ince zarlar) ya da 250 uM nihai konsantrasyona kadar demir (III) klorür heksahidrat ekleme 2x MSgg ortamı seyreltilmiş biyofilm). istenen konsantrasyona antibiyotik veya küçük molekül inhibitörleri ekleyin ve iyice karıştırın. Örneğin, zarlarına ya biyofilm tesis 76.3 mM (10 mg / ml) D-lösin stok çözeltisi 196.6 ul 30 ml 0.5 mM, D-lösin bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir.
      YOK HAYIRT:. Nihai 1x MSgg bileşimi Tablo 1 'de açıklanan orijinal tarifi ²⁵ ile karşılaştırıldığında, ortamı 50 ug / threonin mi ve katı MSgg ortamı üzerinde biyofilm koloniler büyümeye demir konsantrasyonu buruşuk koloni morfolojisi optimize etmek için 2.5 X yükseltildi ihtiva .
3. agar Katılaştıktan sonra, aşılama öncesinde 30-45 dakika boyunca, bir biyolojik başlık katı MSgg plakaları kurutunuz.
4. Zar oluşumu (Şekil 1) mekanizmalarına müdahale belirli inhibitörleri seçmek için, kullanılan konsantrasyonlar planktonik ve statik büyümeyi etkileyen ekarte.
   1. Stasyoner büyüme fazında kadar 600 nm'de her saat optik yoğunluk ölçülerek basit bir büyüme eğrisi planktonik büyüme (sıvı kültürde zaman optik yoğunluktaki artış) belirler.
   2. (CFU), ölçülen kültür bulanıklığı, canlı hücre sayısını temsil onaylamak koloni oluşturan birim sayısının belirlenmesiçeşitli zaman geçtikten sonra bir çalkalama kültürü planktonik büyüme fazında hücre.
   3. de, aynı koşullar altında kuluçkaya bölümlerde 1.7-1.9 tarif edildiği gibi, bir 24-yuvalı hücre-kültür, 23 ° C'de 3 günlük inkübasyon sonunda, statik pelikül büyümesi, hasat hücreleri üzerinde küçük molekül inhibitörlerinin etkisini değerlendirmek için, ve CFU belirler. Bu kontrol için, hücre dışı matris bileşenleri için kodlama operonlan yoksun bir pelikül eksikliği gerginlik kullanmak (yani, B. subtilis Δ epsH, Δ Tasa).
      NOT: Bu soy, statik koşullar altında büyüme yeteneğine sahiptir, ama bir pelikül oluşturucu vahşi tip aksine, bu büyüme, artan oksijen seviyesi ²⁶ tercih edilir, sıvı-hava ara-yüzü, yüzer yeteneği eksiktir. Böylece, bu hücre dışı matris ve zar-eksik suşu statik şartlar altında büyümeyi değerlendirmek için önerilen referans türdür.
      NOT: Belirli bir exStandart olmayan D-amino asit D-lösin bol pelikül oluşumu ^12,17 ekarte edildi müdahale konsantrasyonlarda, aşağıda planktonik ve statik büyüme üzerinde bir etkisi nitelendirdi. Planktonik ve statik büyüme belirlemek için yöntemler detaylı ¹⁷ tarif edilmiştir.

Şekil 1. sağlam bir deney düzeneği tanımlanması için Kavramsal genel biyofilm oluşumunun belirli önlenmesini değerlendirmek için. Planktonik büyüme üzerindeki belirgin etkisi olmadan biyofilm oluşumu ile özel girişime işaret küçük molekül inhibitörleri için seçme kriterleri. Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.

5. B. dışarı Streak -80 ° C stokundan subtilis (LB Cultu% 20 gliserol içinde dondurulmuştur yeniden 10 ⁹ hücre / ml), steril bir ucu veya kürdan ile LB-% 1.5 agar plakası üzerinde tek koloniler izole etmek.
6. 30 ° C'de gece boyunca büyütün.
7. KRİTİK ADIM: D-lösin gibi kurallı olmayan D-amino asidi ile güçlü bir pelikül inhibisyonu için, tek bir koloni içinde 4 saat boyunca 37 ° C 'de 3 mi LB suyu LB-% 1.5 agar plakasından aldı büyümeye inkübatör sallayarak (hızı 200 rpm sallayarak). dikkatle Süpernatan uzaklaştırılmış ve 1.5 ml ortam içinde MSgg pelet yeniden süspansiyon, 6000 x g'de, 4 dakika için 1.5 ml başlatıcı kültür santrifüjle aşılamadan önce biyofilm indükleyici MSgg ortamı ile LB suyu değiştirin. kültür geri kalanı iptal edilebilir.
   Önemli: sistemin sağlamlığı temin etmek için, yıkanmıştır başlatıcı kültür, 600 nm (OD ₆₀₀₎ de optik yoğunluk 0.6 ile 1 arasında olmalıdır.
8. Başlangıç ​​kültürünün büyüme sırasında, 12-iyi hücre kültür plakası çok kaplı containin hazırlanmasıolmayan veya küçük bir molekül inhibitörü (örneğin, 0.3, 0.5, 1 mM D-lösin ¹⁷⁾ bir konsantrasyon aralığı MSgg ortamının g 3 mi. kenar etkileri ekarte etmek, çok kaplı plaka üzerinde farklı konsantrasyonlarda yerini dağıtmak. Seçenek olarak ise, MSgg ortamın 1.5 ml ihtiva eden 24-yuvalı hücre-kültür plakaları çok kaplı kullanımı.
9. (: 1000 sulandırma 1) ile yıkandı kültürlü 3 ul 12-yuvalı hücre kültürü çok kaplı plaka boşlukların aşılanması.
   NOT: daha düşük seyrelme oranı, örneğin 1: 500 de kullanılabilir. Bu ince zarlar geliştirme süresini azaltır.
10. Üç gün boyunca statik koşullar altında, 23 ° C'de zarlarına büyütün. bu ince tabakanın nihai yüzey morfolojisini etkileyebilir olarak, bu süre içinde zarlarına hareket ettirmeyin.
11. yıldırım binoküler ve homojen pozlama ile resimler elde edin. Alternatif olarak, yüksek çözünürlüklü bir kamera ile ince zarlar bir resim çekin. inconsis kaynaklanan eserler önlemek içinçadır ışık açıları ve gölgeler, bir tripod üzerinde sabit kamera ile yukarıdan aşağıya fotoğraf çekmek ve her iki taraftan 45 ° yumuşak ve büyük ışık kaynağı kullanın.
    NOT: B. incelemek için alternatif bir yöntem subtilis multicellularity katı, biyofilm uyaran MSgg ortamında biyofilm koloni testtir. ince zarlar gibi, bu deney, uzaysal işlemler çalışma sağlar. küçük molekül inhibitörleri aktif aralığı tespit edildiğinde, biyofilm koloni oluşumu üzerindeki etkisi incelenebilir.
12. 8.5 cm çaplı bir Petri tabağı başına 4 damla - biyofilm koloniler büyümek için, simetrik yıkanmamış ön kültür, 1.5 ul bir şablon yardımıyla kurutuldu MSgg% 1.5 agar plakası üzerinde (Aşama 1.7) nokta. damla taşımadan önce plakaya adsorbe edelim.
    NOT: Şablon hücreleri yetiştirilen alan içinde biyofilm koloniler eşit dağılımını almak için yardımcı olur. şablonu hazırlamak için, orijinal ölçeklerde büyüme toplam alanı çizmek eşit mezhep bölmekors ve merkezini işaretlemek. 8.5 cm çaplı bir hafta Petri kabı, bu 14 ^cm2 bir biyofilm koloni atar.
13. Üç gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin. Bu süre boyunca, biyofilm koloniler geliştirmek ve üç boyutlu, buruşuk bir yapı oluşturur.
14. Adım 1.11 olarak fotoğraf çekmek.

2. Etanol Direnç Deneyi

1. adımlarda 1.1-1.7 ve 1,12-1,14 açıklandığı gibi biyofilm büyütün.
2. 30 ° C'de büyüme 68 saat sonra, bir jilet şablonun yardımıyla iki eşit parçaya biyofilm koloniler kesti.

Şekil 2. Örnek sterilize ajanlara biyofilm koloni hücrelerin direncini değerlendirmek için deneysel tasarım. Petri kabı üzerinde biyofilm kolonilerinin eşit dağılımı için ve kesim için kullanılan (A) Şablon. (B)tedavi edilmemiş vahşi tür biyofilm yukarıdan aşağıya görüntüleri 30 ° C 'de katı tanımlanan biyofilm uyaran MSgg ortamı üzerinde 68 saat için büyütülmüştür. Genişlemenin biyofilm koloni iki eşit parçaya kesilerek nasıl gösterir. (C), iki eşit biyofilm yarıları aynı şekilde (kontrol, PBS) ile muamele veya PBS veya ajanın sterilize ya ile tarif edildiği gibi işlenir. Ölçek çubuğu:. 1 cm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Dikkatli bir şekilde küçük bir spatula ile agar plakasından biyofilm koloninin her yarım kaldırın ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 500 ul ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü taşıyın. Gerekirse, plakadan kalan hücrelerin kazıma ve de mikrosantrifüj tüpüne transfer edin.
   NOT: biyofilm koloninin ikinci yarısında, diferansiyel tedavi, kontrol olmasına bağlı olarak ya da STERI direnci test edilirLizing ajanlar.
4. Kontrol için, adım 2.3 olarak 500 ul PBS içinde biyofilm koloninin ikinci yarısında kuluçkaya yatmaktadır. , Sterilize edici maddelere karşı direncinin değerlendirilmesi 500 ul% 50 (h / h) etanol ile biyofilm koloni ikinci yarısını aktarın.
   NOT: sodyum hipoklorit gibi alternatif sterilize edici maddeler de kullanılabilir. Kullanılan tüm sterilizasyon maddeleri için bir hazırlık deneyinde aktif konsantrasyon ve inkübasyon süresi belirler.
5. Oda sıcaklığında tezgah üstünde 10 dakika süre ile biyofilm koloniler inkübe edin.
6. 18.000 xg'de 5 dakika boyunca biyofilm kolonilerini Santrifüj ve dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak. PBS 300 ul ekle.
7. Bir sonikatöre bir mikro uç hücreleri hafif (genlik% 10, nabız 5 sn) sonikasyon.
   NOT: Sonication enerji ayrı biyofilm agrega yeterli olmalıdır. Ancak, çok sert sonication hücreleri lize olabilir. ışık mikroskobu sonication enerjisi önceden onaylayınhücrelerin lize Kullanılan ve agregalar çözündürülür olduğu.
8. 1 ml'lik bir son hacme kadar PBS 700 ul ekle. PBS (10 ^-7) seri bir seyreltme gerçekleştirmek ve steril cam boncuklar kullanılarak, bir LB-% 1.5 agar plakası üzerinde 3 dilüsyonları 100 ul yayıldı.
   Not: Bu sterilizasyon ajana yanıt olarak ilgi ve hücrelerin hayatta kalma oranının biyofilm koloni hücre miktarına bağlıdır optimal seyreltileri kaplanacak bir ön deneyde tespit edilmelidir.
9. Gece boyunca 30 ° C'de inkübe CFU sayımı ve CFU / ml belirlemek. Her yarım biyofilm kolonilerin son CFU / ml, hayatta kalanların yüzdesi hesaplanır.
   Not: gerçekleştirilen analiz tarif edildiği gibi, simetriye veya koloni direncini doğrulama kontrol biyofilm koloninin iki yarım ve canlı hücre sayısının% 10 altında farklılıkları vermelidir muamele edilmemiş biyofilm koloni etanol ile muamele edilmiş devre karşı muamele edilmemiş, , respectively. Seçenek olarak ise, sonuçlar, toplam CFU temsil edilebilir. Kontrol ve muamele edilmemiş biyofilm koloninin hücre sayımları aynı büyüklükte kalmalıdır. Buna karşılık, küçük bir molekül ile muamele biyofilm koloni etanol ile muamele edilmiş yarım hücre sayımları sterilizasyon maddesinin artan bir duyarlılık için İstem iki büyüklük en az düşmesi beklenmektedir.

Taramalı Elektron Mikroskobu için 3. Biyofilm Colony Numune Hazırlama

1. adımlarda 1.1-1.7 ve 1,12-1,14 tarif edildiği gibi biyofilm koloniler büyütün.
2. % 2 (hac / hac) glutaraldehit,% 3, 100 mM sodyum kakodilat içinde (hac / hac) paraformaldehit çözeltisi, 5 mM kalsiyum klorür tamponu, pH 7.3 yeni bir parti hazırlayın. 8.5 cm çapında her Petri çanağı için sabitleyici 5 ml hazırlayın.
   DİKKAT: Glutaraldehyde ve paraformaldehit tehlikelidir. Bir kimyasal kaput içinde güvenlik donanımları ile anlaştım. haz çözümler ve kirlenmiş malzemeleri imhatehlikeli atık.
3. Dikkatle biyofilm üstünde doğrudan dağıtım olmadan, biyofilm koloniler fiksatif ekleyin.
   NOT: biyofilm koloni hidrofobik karakteri nedeniyle, koloniler yavaş yavaş ağar ayırmak ve yüzer başlar.
4. Dikkatle Parafilm bir şerit ile plakaları mühür. Oda sıcaklığında 2 saat için bir döner sallayıcı üzerinde inkübe ve daha sonra, gece boyunca 4 ° C'de plakalar transfer.
5. Bir sonraki gün, dikkatli bir şekilde bir vakum pompasına birleştirilmiş bir Pasteur cam pipet ile sıvıyı ayırın.
6. Dikkatle biyofilm yıkama ve 5 dakika boyunca inkübasyona 10 mi, 100 mM sodyum kakodilat, 5 mM kalsiyum klorür tamponu ilave edin. Yavaşça biyofilm zarar görmesini önlemek ve nazik pipetleme taze yıkama solüsyonu eklemek için plaka köşesinden Pasteur cam pipet ile sıvı çıkarın. kez bu adımı yineleyin.
7. Biyofilm kolonilerinin dehidrasyon için, aşağıdaki adımlarla devam edin: GKD ₂ O 2x 5 dakika; 3 2 x 20 dakika0% etanol; 2 x 20 dakika% 50 etanol; 2 x 20 dakika% 70 etanol; 2 x 20 dakika% 96 etanol; 2x% 100 etanol içinde 30 dk.
   1. Her bir adımda 8.5 cm çapında her Petri çanağı için sıvı 15 ml ilave edilir ve dikkatli bir şekilde, her inkübasyondan sonra sıvıyı ayırın.
8. Etanol örnekleri kurutma için iki farklı yöntemden birini kullanın.
   1. Etanol hava-kurutma için:
      1. dörtte bir selüloz filtre kağıdı (9 cm çapında) kesin. Kısaca% 100 etanol içinde dörtte biri daldırın ve sonra dikkatlice bunun üzerine bir yüzen biyofilm koloni aktarın. bir filtre kağıdı ile kaplı bir Petri kabındaki Islak filtre kağıdı koyun. Petri kabı Kapak ve biyofilm koloniler kimyasal kaputu kuru gecede izin verin.
   2. Geçiş sıvısı olarak (CO _2), karbon dioksit kullanılarak KURUTMA FIRINI kritik nokta (CP) için:
      1. % 100 etanol ile kritik nokta kurutma makinesi bölmesinin% 75'ini doldurun. Kendi c içine bir tutucunun içine her bir örnek örnekleri aktarınhamber. Gerekirse, küçük parçalar halinde makas ile biyofilm kesti. Tüm taşıma sırasında etanol içinde batık örnekleri bırakın. Daha sonra, bölme içine tutucu transferi ve sıkı bölme kapatın.
      2. 7 ° C'ye soğutun ve bölmeyi karıştırıldıktan başlar. Sıvı _CO2 ile bölmeyi doldurmak. 7 dakikalık inkübasyon süresi içinde, _CO2 ile etanol karışımı sağlar. Daha sonra, çözelti% 25 deşarj.
         NOT: numunenin seviyesinin altında odasına sızmasına izin vermeyin.
      3. Adımı yineleyin 3.8.2.2 dört kez.
      4. Adımı tekrar 3.8.2.2 sadece 5 dakikalık bir inkübasyon süresi ile beş kez. Son olarak, etanol tamamen CO ₂ ile değiştirilmesi gerekir.
      5. Odanın son turda, boş sadece% 5 sırasında. karıştırma ve soğutma kapatın. 42 ° C'ye kadar bölme ısıtmaya başlayın. 31.1 ° C'lik bir sıcaklıkta ve 73.9 bar bir basınçta sıvı _CO2 kritik noktaya, durumuna ulaştığı, gaz halindeki pHase Çözücü ^27, sıvı faz ile aynı yoğunluğa sahiptir. Sıcaklık 42 ° C'ye ulaştığında, 10 dakika süre ile inkübe edilir. 42 ° C 'de, bölmenin _CO2 süper kritik gaz olarak var olur.
         NOT: Sürekli odasının basıncını kontrol edin. Basınç 42 ° C'de 120 bar aşmamalıdır.
      6. yavaş yavaş sürekli ısıtma ile gazı boşaltmak için başlayın. Bu _CO2-gaz fazında örnekleri tutar ve sıvı yüzey gerilimi vasıtasıyla Örnek morfolojisi deformasyonunu önler. ince ayar ile debimetreyi kontrol ölçüm valfi 5 L / saat debi ölçer ayarlayın. odasında tüm basınç serbest bırakılıncaya kadar bekleyin. Şimdi odasına açın ve sahibinden dikkatlice örnekleri çıkarın.
9. Coat karbon bant ile bir elektron mikroskobu saplama. cımbız yardımıyla dikkatlice saplama üzerine biyofilm koloniler aktarın. arabadan ince bir köprü ekleyerek saplama her koloni bağlayınelektron ışını altında ücret ortadan kaldırılması için çok önemlidir bon bant. Onlar çok kırılgan olduğu gibi bu aşamada, dikkatli biyofilm koloniler anlaştım. En az 24 saat süreyle ya da incelemeye kadar bir kurutucuda örnekleri saklayın.
10. taramalı elektron mikroskobu ile inceleme gün, bir altın paladyum sıçramasına kaplayıcı bir 60 ° açı 2 dakika süreyle biyofilm koloni-sputter ceket. İki kez bu adımı yineleyin ve aralarında 120 ° örnekleri döndürün. Sonunda, sputter-ceket örnekleri kez üstten 3 dakika boyunca. altın paladyum 20 nm ince tabaka iletkenliği artırır ve SEM görüntüleme için örnek kontrastı artırır.
11. Tarayıcı bir elektronik mikroskopla ^29,30 görüntülemenin kadar örnek ²⁸ rehidrasyon engellemek üzere bir desikatör içinde örnekleri saklayın.

Sonuçlar

Zar tahlil B. derece düzenlenir ve dinamik süreçleri incelemek için bir yöntem olduğunu subtilis multicellularity. Bunun yanı sıra, ince tabaka deneyi bir deneyde, tek bir hücre kültürü çok kaplı plaka ön Başlangıç ​​koşullarına veya küçük molekül konsantrasyonları, ya bir dizi test etmek için çok uygundur. Bununla birlikte, B. subtilis ince tabaka oluşumu ön kültür koşullarına duyarlıdır (örneğin, ön-kültür büyüme ortamı ve büyüme fazı), aşılama oranı ve ön-kültür ortamının uzaklaştı...

Tartışma

Bacillus subtilis formları sağlam ve son derece yapılandırılmış biyofilm hem sıvıda (zarlarına) ve katı ortamda (koloni). Bu nedenle, belirli biyofilm inhibitörlerinin etki moduna karakterize için ideal bir model organizma olarak hizmet vermektedir. Katı ortam üzerinde, hücreler merkezden kenara doğru yayılan kırışıklıkları gibi ince zarlar belirgin olmayan ayırt edici özellikleri ile çok hücreli yapılar oluşturur. Bu nedenle, ince zarlar ve koloniler B çalışma tamamlayıcı sistemlerdir subtilis

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Luria Et Suyu, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
potasyum fosfat monobazik	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G
potasyum fosfat dibazik	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
3- ( N< / em>-morfolino) propansülfonik asit	Fisher Scientific, 209.27 g / mol	BP308-500
magnezyum klorür hekzahidrat	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
kalsiyum klorür susuz	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
manganez(II) klorür tetrahidrat	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
demir(III) klorür hekzahidrat	Sigma, 270.30 g/ay)	F2877-500G
çinko klorür susuz	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
tiamin hidroklorür	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-triptofan	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-fenilalanin	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-treonin	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
gliserol susuz	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamik asit monosodyum tuzları hidrat	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-lösin	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
etanol	susuz Gadot	830000054
tıraş bıçağı	Eddison	NA
dairesel selüloz filtre kağıtları	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaraldehit	EMS (Elektron Mikroskopi Bilimi), suda %25	16220
Paraformaldehit	EMS, suda %16	15710
sodyum kakodilat	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
kalsiyum klorür 2-hidrat	Merck, 147.02 g/mol
saplama-alüminyum montajlı	EMS, oluklu kafa	75230
karbon yapışkan bant	EMS	77825-12
Çalkalayıcı 37 ve derece; C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Santrifüj	Eppendorf masa üstü santrifüj 5424	NA
Dijital Sonifier, Model 250, Çift Adımlı	Microtip Branson	NA
İnkübatör 30 & derece ile kullanılır; C	Bağlayıcı	NA
İnkübatör 23 & derece; C	Binder	NA
Filtre Sistemi, 500 ml, polistiren	Cornig Incorporated	NA
Döner Çalkalayıcı - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Püskürtme Kaplayıcı	Edwards	NA
CPD 030 Kritik Nokta Kurutucu	BAL-TEC	NA
Çevresel Taramalı Elektron Mikroskobu	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA