Yöntem makalesi

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi

12.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54620

⸱

9 Ekim 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology (MTC), Karolinska Institutet

Bu makalede

Özet

Farelerde, deriden boşaltılan lenf noduna hücre göçünü izlemek için yapılan ve Bacille Calmette-Guérin ile ayak pedi enfeksiyonundan sonra lenf noduna mobilize edilen cilt Dendritik hücrelerinin karakterizasyonunu sağlayan bir test tanımlanmıştır.

Özet

Dendritik hücreler (DC) lenf düğümü (DLN) kendi elde yeteneği ve mekik antijen ile kısmen, bağışıklık karşılıklarının başlatılması için önemlidir. DLN için DC'lerin seferberlik karmaşıktır ve tam olarak enfeksiyon sırasında tam olarak açıklığa kavuşmuş. Burada C57BL Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG) ile ayak tabanı enfeksiyonu sırasında DClerin taşıma izlemek için florokrom 5- ve 6-karboksiflüoresein diasetat süksinimidil ester (CFSE) dayanan bir yenilikçi basit bir deney kullanılması da tarif / 6 fareleri. Bu tahlil aktif BCG cevaben drenaj popliteal LN taşınmaya cilt DC alt popülasyonlarının karakterizasyonu sağlar. Bu protokol göçmen cilt DH'ler flow sitometri ile tespit edilmiştir BCG modelinden kaynaklanmaktadır. Tahlil DC'lerin veya diğer hücrelerin çalışma ve tanımlama sevimli olduğunu eve Popliteal LN mikropların, metabolitleri veya enflamatuar diğer aşılama sonrasıBu hücrelerin göçünü düzenleyen faktörleri incelemek için sonuç Kapkaççı uyaranlara ve.

Giriş

Vücut yüzeylerinde lokalize DCler mikrop ya da ürünlerini duygusu, ve bunu yaparken tahliye LN (DLN) 1,2 lenf damarları yoluyla harekete. Bu yer değiştirme DLN istilacı mikrop karşı immun yanıtların sonucu prime mikrobiyal antijen taşınması için gereklidir. DLN T-hücre yanıtı 3-5 kısar için Nitekim, DC'lerin blokajı veya başarısızlık enfekte doku göç. Bu duruma göre, tek hücre düzeyinde taşıma izlemek için tasarlanmış tahliller, belirli bir DC alt kümesine atfeden göç yardım fonksiyonu yararlıdır.

DLN cilt DC'lere seferber verilerin büyük bir gövde var. Iltihaplı veya enfekte sitelerden 2 DC göç konusunda bilgi çok ikincisi hesaplar. Cilt DC'lere büyük bir nüfusa ev sahipliği ve laboratuvar fare deney için son derece erişilebilir yüzey olduğundan bu şaşırtıcı değildir. Çeşitli teknikler bu şekilde değerlendirilmesi için geliştirilmiştirDLN 2 ciltten fare DC'lerin göç. FITC deri boyama arayla en yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım gereğidir. Bu deneyde, florokrom fluoresein-5-izotiyosiyanat (FITC), aseton ve bir temas tahriş ile bir karışım hazırlanmıştır. Bu kokteyl tüy dökücü krem ​​uygulanmış ve traş edilmiş derisine uygulanmış ve FITC-işaretli hücrelerin birikimi DLN analiz da bulunmaktadır. Göç aynı zamanda ciltteki floresan parçacıkları içselleştirmiş fagositik hücrelerin takibini sağlayan florokrom etiketli nano veya mikro, cildi enjekte edilerek ele alınabilir. Lenf damarları da doğrudan lenf göç DC'leri ayıklamak için kanüle edilebilir. Bu, özellikle farelerde, ancak teknik olarak zordur. sonraki analiz için elde edilen DC'lerin aynı zamanda belirli bir sınırlayıcı faktördür.

Cilt DC göç konusunda birçok önceki çalışmalarda rağmen, DLN aşağıdaki vacci cilt DC seferberlik ile ilgili bir bilgi yetersizlik kalırBacille Calmette-Guerin (BCG), Mycobacterium bovis canlı, zayıflatılmış suş ile Ulus M. karsı ası olarak kullanılabilen tüberküloz. BCG bir T yardımcı hücre tipi 1 tepkisi tetikler sınırlı enfeksiyona neden deride aşılanır. Hem bu süreçte onların göç düzenleyen BCG ile enfekte cilt DLN için harekete DC alt popülasyonları ve faktörler tam olarak anlaşılmış değildir. Florokrom 5- ve 6-karboksiflüoresein diasetat süksinimidil ester (CFSE) DLN 3'e DClerin taşıma izlemek için yerinde enjekte edilen, yukarıdaki bilgiler ışığında, basit ama yeni bir yöntem geliştirilmiştir. C57BL / 6 fareleri, BCG bir aşı ve kurban etmeden önce gün arka ayak yastığından enjekte edilir, hayvanlar CFSE yüksek konsantrasyonlu ile aynı şekilde enjekte edilir. Yirmidört saat sonra hayvanlar öldürülür ve boşaltma popliteal ln (PLN) çıkarıldı ve akış sitometrisi için hazırlanır. Bu deney, ide sağlarDLN için ayak tabanı deriden gece boyunca göç hücreleri (Şekil 1) ntification.

Ayrıca, gen hedefli fareler DLN için harekete geçirmek hücreler için gerekli olan faktörleri belirlemek yardımcı olmak için kullanılabilir. Bu testi kullanılarak, bu raporun yazarları, daha önce bulduk İnterlökin-1 reseptör ve hücre içi adaptörü molekül MyD88 3 tarafından düzenlenen bir süreçte DLN için EpCAM düşük CD11b yüksek göç cilt DC'ler taşıma BCG. Akış sitometri göç deri DC'ler tespit etmek ve analiz etmek için kullanıldı Bollampalli ve ark., 3 yukarıda rapor kaynaklanan Bu CFSE tabanlı geçiş deneyi için protokol, burada tarif edilmektedir. avantaj ve bu tahlilde dezavantajları tartışılmıştır.

Protokol

Not: C67BL / 6 fareleri, bu metinde gösterilen deneyler için kullanılmıştır. Bu hayvanlar MTC hayvan tesis, Karolinska Enstitüsünde, Stockholm, İsveç spesifik patojen içermeyen koşullar altında ev vardı. Hayvan deneyleri Tarım İsveç Kurulu, İsveç Hayvan Koruma Ajansı ve Karolinska Enstitüsünde direktiflerine ve kurallarına göre yapılmıştır. Deneyler Stockholm Kuzey Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

KAKE Hisse Senedi ve Depolama 1. Hazırlık

  1. dimetil sülfoksit içinde 5- ve 6-karboksiflüoresein diasetat süksinimidil ester (CFSE) içindeki bir 5 mM stok hazırlayın. Vortex. Steril içine 100 ul alikotları koyun, 0.5 ml kap mikrotüpleri vida. -80 ° C'de saklayın alikotları.

2. Fareler

  1. Yaşları 8 ile 12 hafta arasında doğuştan erkek veya dişi farelerin kullanın. Cinsiyet ve yaş uyumlu hayvanlar tercih edilir. Gerekli hayvan etik izinler ar emin olunDeneylerin başlanmasından önce yerinde örn.

İsofluranın Gaz Anestezi ile Hayvanların 3. İmmobilizasyonu

  1. izofluran ile anestezi ünitesi yerleştirin. izofluran ile 10 mi gaz geçirmez cam şırınga doldurun. hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Verilen boru ile şırınga ve sıvı girişi bağlayın ve bağlantı tüp içinde sıvı gözle görülür Buharlaştırıcı'yı girmek üzereydim kadar ileri itici hareket ettirin.
    NOT: şırıngada Kullanılmadığı zaman izofluran tutmayın.
  2. 500 ml / dakika ve% 3.5 izofluran konsantrasyonu - bir hava akışı, yaklaşık 400 muhafaza ile indüksiyon odasında izofluran hayvanların anestezisi.
    NOT: Cihaz hava akımı olmadan çalışmayacaktır.
  3. hayvanlar uykuda olduğunda, maske parçası yönlendirmek için anestezi ünitesi üzerinde izofluran gaz musluğunu açın. Maske parça gaz sızıntısını önlemek için sağlam olduğunu kontrol edin. Hava akışı, 400 ml / dakika, alterna muhafaza edilebilirnispeten / dakika, 200 ml idi. % 2.6 izofluran konsantrasyonunu azaltmak.
    Not: anestetik etki artışı ve / veya akış hızı ayarlanarak azaltılabilir.

4. BCG Enjeksiyonları ve Kurtarma

  1. Görme onaylamak ve enjeksiyonları gerçekleştirmeden önce izofluran maske parçası üzerinde uyurken / hareketsiz öyle ki fareler anlamak için ayak tutam refleks testi olarak testleri.
  2. 29 x g ½ inç iğne ile donatılmış bir şırınga kullanarak PBS 30 ul, bir arka ayak yastığından Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG) içinde 1 x 10 6 koloni oluşturan birimler inoküle.
    NOT: mikobakteri stokların nesil kısaca bu prosedürün 3 orijinal tarifinde tarif ve başka bir yerde 6 önemli ayrıntılarıyla edilir. BCG, aynı zamanda, ticari kaynaklardan kolayca elde edilebilir. Yazarlar kendi inoculati önce kümeleri bozmak için bir şırınga aracılığıyla BCG darbe sonike veya geçmiş olmasını öneririzfarelere üzerinde. Bir mikrobik uyaranlar bu protokol 3 orijinal açıklamasında kendi istihdamını verildi ama yazarlar kesinlikle diğer mikrobik uyaranların test teşvik olarak BCG burada yineledi edilir.
  3. Kontrol farelerine PBS enjeksiyonu için, yukarıda tarif edilen aynı prosedürü uygulayın.
  4. Anestezi başarılı o kurtarma onaylamak için enjeksiyondan sonra hayvanların izlenmesi ve hayvanlar enjekte arka ayak yastığından kendilerini destekleyebilir.

5. KAKE Enjeksiyonlar

  1. Enjeksiyonluk CFSE hazırlanması:
    1. -80 ° 5 mM CFSE stok çözeltisi, bir şişe çözülme. PBS içinde KAKE 10 kat sulandırmak. İyice enjeksiyon için hazırlık şırınga doldurmadan önce çözüm süspanse.
  2. KAKE Enjeksiyon ve Kurtarma:
    1. Daha önce BCG veya PBS alınan arka ayak yastığından bölümünde 0.5 mM KAKE 3. enjekte 20 ul hayvanlar anestezi için işlemi tekrarlayın.
      Not: KAKE enjeksiyon kurban için bir gün önce (24 saat) planlanan tarihi yapılmalıdır.

Popliteal Lenf Düğümü 6. Cerrahi Temizleme (PLN)

NOT: sterilize cerrahi aletler ve% 70 etanol onların tekrarlanan dekontaminasyon kullanılması bu adımı boyunca teşvik edilmektedir.

  1. fareler Euthanize. % 70 etanol ile hayvan püskürtün. Bir diseksiyon gemide, dorsal pozisyonda hayvan Pin.
    NOT: Yazarlar servikal dislokasyon ile ötenazi tavsiye ederim.
  2. Dikkatle arka uyluk dikey bir kesi yapmak. diz çukuru içinde, yağ kese derin bulunan PLN ortaya çıkarmak ve dolayısıyla tüketim için makas ve cımbız kullanarak net kas ve yağ.
  3. buz üzerinde, 0.5 ml steril PBS PLN aktarın.

PLN Tek hücreli Süspansiyon 7. Nesil

  1. 70 mikron hücre süzgecinden plac yoluyla PLN homojenizeEd ihtiva eden bir 6 kuyu-plakasının 5 ml PBS veya floresan-aktive edilmiş hücre tasnifi (FACS) tampon maddesi (PBS içeren% 2 fetal buzağı serumu (FCS), 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 1 mM sodyum azid). 3 ml şırınga arka ucunu kullanarak Süzgecinden homojenize.
    NOT: Sodyum azid toksik ve dikkatle ele alınmalıdır.
  2. PBS veya FACS tampon başka bir 5 ml süzgeç yıkayın 15 ml bir tüp içinde malzemenin toplanması, 5 dakika, 4 ° C, 277 xg (1200 rpm, burada R = 172 mm) pelet hücreleri. Seçenek olarak ise, polipropilen homojenleştiriciler kullanılarak mikrosantrifüj tüpleri içinde, doğrudan pLNs homojenleştirin.
  3. 1000 ul - topak boyutuna bağlı olarak, örneğin PBS veya FACS tamponu, uygun bir hacim içinde 200 PlN süspansiyon yeniden süspanse edin. Her LN süspansiyon elde edilen toplam hücre sayısını ölçmek için bir sayma odasına kullanın. ölü / ölüyor hücreleri hariç tripan mavisi kullanın.

8. Hücre Boyama ve Sitometrisi

  1. Transfer 1-10 x 10 6 hücre 5 ml'lik yuvarlak dipli bir polistiren tüpler. 5 dakika, 4 ° C, 277 xg (1200 rpm, burada R = 172 mm) santrifüj ile FACS tamponu ve pelet ile yıkayın.
  2. Süpernatant atın ve 50 pelletini - 0.5 içeren antikor kokteyli 100 ul (dendritik hücre [DC] belirteçler yüzey boyama için kullanılan malzemeler Tablosuna bakınız) - anti-fare CD16 / CD32 1 ug (spesifik Fc aracılı engellemek için buz üzerinde 45 dakika, - 30 FACS tampon etkileşimler). ışıktan örnekleri koruyun.
  3. İnkübasyondan sonra, 5 dakika, 4 ° C, 277 xg (1200 rpm, burada R = 172 mm) santrifüjleme ile FACS tamponu ve pelet hücreleri yıkayın.
  4. FACS tampon 100 ul - 50 hücrelerinin yeniden süspanse. 7-10 bir akış sitometresinde veri elde.
    NOT: akış mükemmel yorum sitometri bu yöntem üzerinde hem teorik hem de pratik bilgiler röle aşağıdaki yayınlara okuyucu bakın.

Sonuçlar

KAKE tabanlı göç tahlil (Şekil 1) ayak tabanındaki PLN BCG sonrası enfeksiyon görünür KAKE etiketli hücreleri tespit ve karakterize etmek flow sitometri ile birlikte kullanılmıştır. PLN KAKE etiketleme büyük bir kısmı cilt DLN 11 göç etmiş cilt DC'ler ile tutarlı MHC-II yüksek ve CD11c + / düşük hücreleri (Şekil 2A), bulunur. Frekans ve KAKE etiketli, MHC-II yüksek CD11c'nin toplam sayısı hem + / düşük hücreleri BCG bu tehcir artırır düşündüren, PBS enjekte kontroller (Şekil 2B-C) ile karşılaştırıldığında BCG ile enfekte farelerde pLNs artmıştır DLN için hücreleri. 24 saatlik bir süre boyunca bu deney, taşıma için, deri DH'ler halen DLN 5 gün sonra enfeksiyon (Şekil 2C) girerken kurmak mümkündü. Bu iyi başlangıç ​​activati ​​için zaman çizelgesi ötesinde şimdiki model DC göç uzanırPLN 3 Antijen spesifik CD4 + T hücrelerinin üzerine. Bundan başka, göç eden deri DCler ko-stimülatör molekülleri CD80 ve CD86 (Şekil 2B) yüksek seviyeleri ifade etmedi. Bu cilt eksplant kültürler ve FITC cilt, 11 resim göçmen DC'ler aktive hücreler olduğu kavramını destekleyen önceki gözlemlerle uyumludur. Daha önemlisi, her ikisi de LN-yerleşik DC'ler (MHC-II + CD11c'nin yüksek hücreler) ve plazmasitoid DC'ler (MHC-II düşük CD11c düşük PUKÖ-1 + hücreler), yüksek endotelyal venül aracılığıyla iltihaplı LN girmek ve afferent lenfatikler 12, negatif için KAKE (Şekil 2EF), gerçekten düşündüren KAKE etiketleme Kapkaççı ağırlıklı olarak ortaya çıktığı.

MHC-II yüksek CD11c + / düşük hücreler bir ancak birden DC alt popülasyonları 13, ek yüzey belirteçleri CD103, EpCAM (C değil temsil ettiği göz önüne alındığındaD326) ve CD11b ayrıca göç DC'lerin (Şekil 3) nüfusu karakterize etmek için akım sitometri algılama (Malzeme Tablosu) için kullanılan antikor boyama panelinde alındı. Bu şekilde, EpCAM düşük CD11b, yüksek bir hücre alt-popülasyonu BCG enfeksiyonu (Şekil 3) karşılık olarak ana göç cilt DC alt-grup olarak tanımlanmıştır.

4 lazerler (488, 532, 640 ve 405 nm) ile donatılmış sitometre burada gösterilen akış sitometrik veriler bir akış elde edildi. Veri hücre analiz yazılımı ile analiz edilmiştir. Malzeme Tablo l'de belirtilenden farklı çok renkli akış sitometre bu konuda başka hücre tipleri üzerinde, yukarıda çalışmalarda belirtilen belirteçler başarıyla tespit ya da diğer işaretlerinin tespiti için de kullanılabilir. Bu tarifnamede tarif edilen protokol için, 6 farklı fluorochromes tespiti için bir sitometrisi sahip NECE olanssary. Önemli olarak, kullanılan her bir antikor için klonlar (Malzeme Tablosu) belirtilir. florokrom konjügat tercihi Bu, mevcut akış sitometresinde lazerler ve algılama kanallarında bağlı olabilir olarak kabul edilmesi gerekir. Benzer şekilde, antikor boyama için en uygun dilüsyonları belirlemek için titre edilmesi gereklidir.

BCG ve PBS enjekte örneklerde Nüfus frekansları grafikle ve DH'lerin tanımlanan kapılı alt gruplarının mutlak sayıları hesaplamak için toplam hücre sayısı ile birlikte kullanılmıştır. veri grubu araçlarının farklılıkların önemi p <0.05 bir kesim ile, Student testi veya ANOVA uygun hallerde tarafından analiz edilmiştir. Aykırı Aykırı için Grubblar 'ın test sonrasında analizden çıkarıldı.

figure-results-1
Şekil 1. Anahat: BCG Kapkaççı EnfeksiyonuModeli ve CFSE tabanlı bir taşıma Deneyi. BCG, C57BL / 6 farelerinin arka ayak yastığından olarak aşılanır. Farklı zaman enfeksiyon sonrası noktaları ve kurban etmeden önce 24 saat sonra, florokrom CFSE önce BCG alınan aynı şekilde enjekte edilir. Boşaltma, popliteal lenf nodu izole edilir ve sitometri. Akışı ile karakterize hücreleri KAKE etiketli bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. Göçmen Cilt DC'ler Binbaşı Nüfus DLN BCG Kapkaççı sonra Enfeksiyon Relocating vardır. C57BL / 6 fareler footpad içinde BCG 1 x 10 6 CFU ile enfekte edildi. Yirmi dört saat kurban etmeden önce, hayvanlar aynı ayak tabanı içinde 0.5 mM CFSE ile enjekte edilmiştir. Popliteal lenf nodları, hasat homojenize edilmiştirtek hücre süspansiyonları olarak ve akış sitometrisi tabi tutulmuştur. BCG 1 gün sonra yapılan ölçümler için, KAKE BCG sonra 2saat enjekte edildi. (A ve B) 3 gün sonra enfeksiyon PLN BCG-boşaltma de MHC II yüksek ve CD11c + / düşük hücreleri üzerinde KAKE baskın ifadesini gösteren Zebra araziler. BCG ve PBS ile enjekte edilmiş farelerden alınan PLN CFSE etiketli MHC II yüksek CD11c (C) sıklığı ve toplam sayısı + / düşük hücreleri farklı zaman noktalarında grafikle edildi. CD80 ve CD86 için (D) ortalama florasan yoğunluğu (MFI) CFSE + ve CFSE negatif MHC-II yüksek CD11c 3 gün BCG enfeksiyondan sonra PLN + / düşük cilt DH'ler üzerinde saptanmıştır. (E) deri DC'ler içinde KAKE ifadesi (MHC-II yüksek CD11c + / düşük), LN-yerleşik DC'ler (MHC-II + CD11c yüksek) ve (F) plazmasitoid DCler (MHC-II düşük CD11c düşük PUKÖ-1 +)3 gün sonra, BCG akış sitometrisi ile tespit edilmiştir. Her deney için, en az 5 fare PBS ile enjekte edilen kontroller için BCG ile enfekte edilmiş grup için kullanılmaktadır ve 3 edildi. Çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. Her bir alt-grup içinde CFSE-işaretli hücrelerin sayısı Bollampalli et al verilmiştir, PLoS Pathog 2015 11:. E1005206 3. * BCG enfekte ve PBS kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark belirtir. gösterilen iki bağımsız deneyin biri. Bollampalli uyarlanan Şekil ark, PLoS Pathog 2015 11:... E1005206 3, Yayıncının izni ile bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3. EpCAM düşük CD11b yüksek DC'ler Ana Cilt DC Alt Küme trafiğe vardırDLN BCG ayak tabanı sonra enfeksiyona ing. C57BL / 6 fareleri, (A), zebra araziler kullanılan strateji (üst panel) ve her birinde CFSE + hücrelerinin frekansı yolluk yok. Şekil 2'deki gibi BCG ve CFSE ile enjekte farklı alt gruplarını tanımlandı BCG enfeksiyonu (alt paneller) sonra zaman noktaları. Her bir alt-grup içinde frekanslar enfeksiyon sonrası zaman noktasında bağlı olarak değişebilir. BCG 3 gün sonra bir bütün LN hücreler arasında yaklaşık% 0.2 MHC-II yüksek CD11c + / düşük hücreleri bulmak için bekleyebilirsiniz. Bunlardan yaklaşık% 6 CD103 + hücreleridir. MHC-II yüksek CD103 negatif kapısı içinde bulunan alt kümeleri, bir yaklaşık% 42 CD11b yüksek EpCAM düşük hücreleri,% 27 CD11b düşük EpCAM düşük hücre ve% 7 LC'leri bulabilirsiniz. (B) BCG enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında CFSE + hücrelerinin her birinde, tanımlanmış bir alt toplam sayısı gösterilmektedir. Her experime içinnt, en az 5 fare BCG ile enfekte edilmiş grup ve PBS kontrolleri için 3 için kullanılmıştır. Çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. * PBS enjekte kontrollere göre istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar belirtir. gösterilen üç bağımsız deneyin biri. Şekil yeniden basılmış Bollampalli ark, PLoS Pathog 2015 11:.. E1005206 3, Yayıncının izni ile bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

noDCs mikrobiyal antijen edinme ve lenfatikler yoluyla DLN göç etmek suretiyle vücut yüzeylerinde mikrobiyal meydan cevap verebilecek uzman antijen sunan hücreler vardır. Orada DH'ler primer T-hücresi tepkilerini sağlayan bir şekilde T hücreleri, bu antijeni. DLN dokudan DC göç işlemi, verimli bir T-hücresi yanıtı başlatılır nasıl çalıştığını anlamak için, bu nedenle çok önemlidir. DC migrasyonun ölçülmesi için yöntemler sonuç olarak yukarıda açılma çok yararlıdır.

Bir fare modeli, BCG, deri klinik olarak enjekte edilir canlı aşı ile enfeksiyondan sonra DLN deri DC taşıma çalışması için kullanılmıştır. uygun olarak, BCG aşısı, bu cilt yoluyla taklit etmek için bir arka ayak yastığından enjekte edilir. Basit bir deney geliştirdi ve dolayısıyla boşaltma PLN ayak tabanı deri BCG aşılama sitesinden cilt DC alt popülasyonlarının göç araştırmak için bu modele dahil oldu. Bu protokol, dinleriDaha önce BCG alınan aynı ayak tabanı içine florokrom KAKE enjekte ve sonra flow sitometri KAKE etiketli hücrelerin varlığını analiz etmek daha sonra tahliye PLN 24 saat tecrit es. Protokolde tarif olmasa da, bu kurulumdan LN ayrıca LN 3 göçmen hücrelerin konumlandırma olarak göç süreçlerini incelemek için, konfokal mikroskobu ile analiz için hazırlanabilir. Ayrıca, BCG tetiklenen cilt DC göç benzer sonuçlar BCG hem Pasteur 1173P2 3 ve BCG SSI 1331 14 kullanılarak elde edilmiştir.

CFSE, genellikle in vitro hücreleri etiketlemek için ve hücre transferi 15 sonra in vivo bu etiketlenmiş hücreleri izlemek için kullanılır. Ama mevcut protokol, doğrudan yerinde deri hücreleri etiketlemek için kullanıldı. CFSE etiketleme moleküler, aynı zamanda, bir amin-reaktif fluoresan boya olan FITC, benzer. o CRE olarak KAKE ancak konjugasyon için FITC tercih edilirates çok kararlı karboksamid bağlar 16. Ayrıca, CFSE yüksek membran geçirgen ve pasif olarak hücre içine girer. İçerde, hücre içi amin (floresan) etiketli hücrede 15 korunur konjugatları oluşturur.

yazarlar tarafından geliştirilen CFSE bazlı göçü deneyi BCG yanıt olarak 24 saatlik bir süre içinde cilt DLN taşındıktan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Bu nedenle belirli bir zaman aralığında, akut taşıma ölçer ve bir farklı kabiliyeti açısından araştırmak sağlar, taşıma tetiklemek için uyaranlara enjekte edilmiştir. Bu deney, bir temas hassaslaştırıcı maddenin deri, topikal uygulama tarafından tetiklenen bir kümülatif göç olayı ölçen FITC cilt resminin klasik tekniği, farklıdır. Bu nedenle, CFSE tabanlı geçiş deneyi göç deri DCS veya f mikrop, mikrobiyal ürünler veya diğer enflamatuar uyarılara enjeksiyonundan sonra PLN ev diğer hücreleri tanımlamak için kullanılabilirootpad. Gerçekten de, nötrofil ve γ hem: δ T hücreleri BCG 17,18 yanıt olarak DLN deriden taşınmaya gösterilmiştir. Aslında, deney en son bir bağırsak-lokalize Nematot enfeksiyonu DLN 14 BCG tetiklenen deri DC taşıma kapatmak olabilir olduğunu göstermek için bir ko-enfeksiyon ayarı kullanıldı.

DC göç genellikle DC'ler 19 boyadıktan sonra 4 ila 5 gün tespit edilmesi zor olan FITC işaretli beri 24 FITC cilt resim saat 72 arasında değerlendirilir. Göç analizi 24 saat ile sınırlı beri etiketli DC'lerde KAKE sinyal kaybı burada sunulan analizde bir sorun değildir; Bu yazarlar, özellikle incelemek için "bir gecede" göç olayları istediğini olmanın arkasındaki nedeni. Bu deneyde ilgilenen Diğerleri ise KAKE tabanlı izleme için daha erken veya daha geç zaman noktalarında araştırmak için teşvik edilir. KAKE enjeksiyon yoluyla tanıtıldı beri Ayrıca, tanımlanmış herhangi bir zamanda verilebilir. Bu esneklik a izinuthors BCG enfeksiyonu (Şekil 2C) 3 gün sonra 5 ve 6 arasında DC taşıma değerlendirmek. Enjekte KAKE potansiyel etiketleme reaksiyonu yerinde erişilebilir hücre tipleri sınırlayabilir. Derinin üst tabakasında bulunur DC'ler olan örnek Langerhans hücrelerinin (LCs) için, epidermis, (Şekil 3) 3 KAKE tabanlı göç deneyinde BCG cevaben kötü göç ederler. Ancak, FITC cilt boyama, dermis konumlandırılmış DC'ler sırasında, epidermis altındaki tabaka kolayca etiketli ve daha hızlı LCs 20,21 den DLN göç. Bu, hücrelerin florokrom etiketli olabilir mutlaka markalama çözeltisi uygulandığında deri tabakası lokalize gerek kalmadan göstermektedir.

BCG enfeksiyonu için bir model olarak, fare kulağı daha tüberküloz aşısı olarak BCG klinik yönetimi ile uyumludur aşılama iyi niyetli bir intradermal yol sağlar. foÖte yandan otpad enjeksiyonu, muhtemelen deri içi ve deri altı yollardan bir kombinasyonudur. Yani klinik pratikte her zaman gerçek intradermal verilmesi değil subkutan ya da her ikisinin kombinasyonu olmayabilir bu yüzden doğru ve tekrarlanabilir, dermis 22 BCG teslim beceri ve eğitim gerektirir, dedi. bir aşılama sitesi olarak haydut söz liyakat kulak üzerinde iki çok net avantajları var. İlk olarak, bağışıklık tepkisi, bir ayak tabanına enjekte alttaki drenaj PLN kadar konsantre edildi ve bu tepkilerin incelenmesini kolaylaştırmaktadır. Bu raporun yazarları PLN Kapkaççı 3 boşaltma ilk ve ana LN bulundu. Diğerleri Evan mavi 23 enjeksiyonundan sonra popliteal ve subiliac LN arasındaki bölünmüş drenaj öne sürmüşlerdir. Bununla birlikte, kulağa ile ilgili olarak, orada farelerde birden fazla kulak DLN olup, bu, düzenli olarak ve 24 bulmak kolay olmayabilir. İkincisi açıkça liab getirmektedirDLN yanıtları araştırmak isteyen çalışmalarda ility. kulağa göre - (50 ul 10) ikinci ve daha büyük miktarlar ayak tabanı içine inoküle edilebilir. Bu da hem lenfatik akım büyük değişiklikler tanıtmak ve mikobakteri büyük miktarlarda aşılamak için geldiğinde başlı başına bir konudur çok küçük enjeksiyon hacimleri ile çalışmak zorunda sorumluluğu en aza indirir. enjeksiyon hacimleri küçük (1-10 ul) olması kulakta, hatta 5 ul lenfatik akımı değiştirebilir ve potansiyel kontrolsüz bir şekilde doğrudan DLN enjekte malzemenin daha büyük bir miktarda kuvvet. Enjeksiyon hacimleri hesaba önemlidir. Bu LN bakteri ferrying hücrelerin katkısını ele deneylerde özellikle önemlidir. BCG ayak tabanı modelinde, bazı BCG hücresel ulaşım yokluğunda DLn ulaşmış olabilir. Bu hala ayak farelerin DLN nerede hücre göçünü BCG algılayabilir gözlemine dayanırped tamamen boğmaca toksini 3 lokal enjeksiyonu ile ablasyon. Bu BCG doğrudan lenfatikleri erişebilir ve gerçekten hücre içermeyen bir şekilde dLn ulaşabileceği bir göstergesi olup olmadığı bu göz ardı edilemez çünkü belirlenecek kaldığı enjekte hacmi zorla lenfatiklere erişim verilen bu durumda mikobakteriler.

kulak veya ayak tabanlarından immünizasyonlar için pratik bir husus enjeksiyonu doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirilebilir için hayvanların yeterli hareketsizleştirilecek olmasıdır. Isofluran gaz ayak tabanı enjeksiyonlar için hazırlık hayvanlar sınırlamaya için bir yöntem olarak mevcut protokolün açıklanmaktadır. Izofluran-aracılı anestezi için nispeten hızlı indüksiyon ve derlenme süreleri popüler bir yöntem yapmak, ancak diğer anestezik ajanların benzer deneysel sonuçlarla 25 engel olabilir fizyolojisini etkiler. Nitekim, uçucu ve enjekte iki anestezi kaldırarak lenf akışını azaltmakistemli kas hareketleri, kas tonusunu azaltarak ve lymphangion kasılmasını 26 azalan. Ayrıca, adoptif ayak tabanı transfer DClerin DLN göç bir 5 misli azalma anestezi altındaki hayvanlara 27 bildirilmiştir. Yukarıda verilen ve önceki anestezi kullanım prosedürleri yana yönetmek için, hem seri ve bir geri kazanım aşaması gerektirmeyen enjeksiyon kendisi daha hayvanlara daha fazla strese neden muhtemeldir olasılığı yeterince anestezi olmadan hayvan sınırlamaya gerektiği kabul edilebilir. Hayvan hızla 30 ila 40 saniye içinde Kapkaççı bir hareketsiz konuma getirilir ve inoküle edilebilir ayak tabanında enjeksiyonları için özelleştirilmiş bir fare süzgeç sürecindeki fizyolojisi diğer yönlerini değiştirmeden arka ayak yastığından fare enjekte ideal olacaktır ve lenfatikler yoluyla hücre göçü ele çalışmalarda son derece yararlı olacaktır.

Sonuç olarak, bu raportanımlanmış bir 24 saatlik penceresi sırasında göç izleyen bir testi kullanılarak DLN kendi seferberlik sırasında cilt DC'ler izlemek için yeni bir protokol vurgulamaktadır. Bu KAKE tabanlı göç tahlil burada ayrıntılı olarak, flow sitometri yanı sıra konfokal mikroskopi 3 ile algılama ve göçmen hücrelerin analiz sağlar. Bu enjekte uyaranlara çeşitli ve DC göçü tetikleyecek kabiliyetlerini incelemek için esnek bir platform sağlar, ve daha da önemlisi, DCler aynı zamanda farklı deneysel ayarları sırasında DLN deriden hareketli diğer popülasyonlar sadece izlemek için kullanılabilir.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, İsveç Araştırma Konseyi VR'den (Dnr 2014-2794) bir proje hibesi olan Karolinska Institutet tarafından desteklenmiştir ve Karolinska Enstitüsü'nden bir KID Doktora Bursu (Tümü AGR'ye) tarafından desteklenmiştir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İzofluranBaxter1001936060
5- ve 6-karboksifloresein diasetat süksinimidil ester
(CFSE)		InvitrogenC1157
Dimetil sülfoksit (DMSO)SigmaD2650
Fetal sığır serumu (FBS)SigmaF7524
Bacille Calmette-Gué rin (BCG)suşu Pasteur, evde
Tripan mavisi çözeltisiSigmaT8154
EDTAEvde
Sodyum azidSigmaS2002
PBSEvde
filtrelenmiş suEvde
BD Plastipak 3 ml şırıngaBD Tıbbi Cerrahi Sistemler309658alternatifi: 5 ml şırınga 
6 kuyulu plakalarTPP92006
15 ml santrifüj tüpleriTPP91015Polipropilen
5 ml yuvarlak tabanlı tüplerBD Falcon3272948Polistiren
Univentor 400 anestezi ünitesiUniventor8323001
Monojet 3/10 ml şırıngaMedicarrier888151114429 G x 1/2 inç.
Steril filtre ünitesiTPP99500PES membran 
EPPI-Pistill homojenizatörSchuett biotech3.200 512Polipropilen
Allegra X-30R santrifüjBeckman CoulterB01145
Bü rker sayma odasıVWR631-0920
0.5 ml vidalı kapaklı mikrotüp Sarstedt72.730Polipropilen
1.5 ml Eppendorf mikrosantrifüj tüpüVWR700-5239Polipropilen
70 mikron hücre süzgeçleriVWR734-0003
BD LSR-II akış sitometresi, FACSDiva yazılımıBD Biosciences ile çalıştırıldıDurduruldu. Diğer Flow sitometreleri mevcuttur, minimum 6 florokrom tespiti gerekir
FlowJo hücre analiz yazılımıTree Star
AntikorCloneCompany 
MHC-II I-A/I-E M5 / 114.15.2BD Biyolojik Bilimler
CD11bM1 / 70BD Biyolojik Bilimler
CD11cHL3BD Biyolojik Bilimler
CD16 / CD32 (Fc blok)2.4G2BD Biyolojik Bilimler
CD326 / EpCAMG8.8Biyolojik Efsane
CD1032E7Biyolojik Efsane
CD8016-10A1Biyolojik Efsane
CD86GL-1Biyoefsane

Kaynaklar

  1. Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
  2. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  3. Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206(2015).
  4. Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
  5. Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
  6. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Jr Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11(2007).
  7. Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
  8. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
  9. Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1(2002).
  10. Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3(2001).
  11. Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
  12. Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
  13. Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
  14. Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
  15. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9(2009).
  16. Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
  17. Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
  18. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
  19. Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
  20. Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
  21. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
  22. Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
  23. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
  24. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
  25. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
  26. Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
  27. Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dendritik H cre MigrasyonuCFSE AnaliziAyak Pedine EnjeksiyonPopliteal Lenf NoduAk SitometrisiBCG EnfeksiyonuH cre zlemeLenf Nodu zolasyonuAntijen Sunumu

İlgili makaleler