bir Genotiplendirme<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Tarafından Ribozomal Spacer PCR (RS-PCR)

Özet

Burada, ribozomal aralayıcı PCR (RS-PCR), S. aureus'un orta maliyetlerle genotiplendirilmesi için hızlı ve yüksek çözünürlüklü bir yöntem olarak minyatür bir elektroforez sistemi ile birlikte kullanılır ve yüksek verim sağlar.

Özet

Ribozomal aralayıcı PCR (RS-PCR), S. aureus için makul maliyetlerle yüksek verim sağlayan ve bu nedenle rutin amaçlar için kullanılmaya uygun olan oldukça çözünür ve sağlam bir genotipleme yöntemidir. En iyi çözünürlük, veri değerlendirmesi ve veri yönetimi için minyatür bir elektroforez sistemi gereklidir. Böyle bir elektroforez sistemi ve şirket içinde geliştirilen yazılım (burada ücretsiz olarak mevcuttur) ile birlikte, bant modelinin bir genotipe atanması standartlaştırılır ve basittir. DNA ekstraksiyonu basittir (kaynatma hazırlığı), reaksiyonların ayarlanması kolaydır ve herhangi bir standart PCR makinesinde çalıştırılabilir. PCR döngüsü, uzun süreli rampa ve uzama süreleri dışında yaygındır. Spa tiplemesi ve Çoklu Lokus Dizi Tiplemesi (MLST) ile karşılaştırıldığında, RS-PCR, analizi önemli ölçüde basitleştiren ve yüksek bir verim sağlayan DNA dizilimi gerektirmez. Ayrıca, S. aureus'un sığır suşları için çözünürlük en az spa tiplemesi kadar iyidir ve MLST veya darbeli alan jel elektroforezinden (PFGE) daha iyidir. RS-PCR veri tabanı şu anda toplam 141 genotip ve varyant içermektedir. Yöntem, sığır mastitinde yer alan S. aureus suşlarının virülans gen paterni, bulaşıcılığı ve patojenitesi ile yüksek oranda ilişkilidir. S. aureus genotip B (GTB) bulaşıcıdır ve İsviçre ve diğer Avrupa ülkelerinde büyük maliyetlere neden olan sürü sorunlarına neden olur. İsviçre'de gözlemlenen diğer tüm genotipler, tek tek ve çeyrekleri enfekte eder. RS-PCR ile genotipleme, klinik veterinerlik tıbbı için iki temel faktör olan sığır meme içi enfeksiyonunda (IMI) yer alan S. aureus'un epidemiyolojik ve patojenik potansiyelinin güvenilir bir şekilde tahmin edilmesini sağlar. Bu faydalı özellikler, makul maliyetler ve yüksek numune verimi ile birlikte bu yayının amacı, diğer laboratuvarlarda S. aureus'un genotiplendirilmesi için RS-PCR'nin kolayca kurulması ve çalıştırılması için ayrıntılı, adım adım bir protokol vermektir.

Giriş

Staphylococcus (S. aureus) sığır ¹ meme içi enfeksiyon (IMI) dünya çapında sorumlu en önemli patojen olarak bilinir. 12 Avrupa ülkesinde bunun ineklerde Cosandey ve ark., ³ ve Boss ve diğ. ⁴ tarafından Fournier ve ark. ² İsviçre ineklerde gösterdi ve çalışmalarla çalışma S. aureus IMI genetik olarak heterojen bir grup büyükbaş izole. 16S-23S rRNA intergenik aralayıcı bölge (RS-PCR), PCR amplifikasyonu ile, 17 genotip toplam başlangıçta 101 epidemiyolojik bağımsız izolatların ² tespit edilmiştir. Diğer 15 genotipleri (GTs) her 1 tüm izolatların% 4, yapım nadiren meydana oysa Genotip B ve genotip C (GTC), (% 80) en sık görülen idi. Avrupa ^3. seviyede, GTB, GTC, GTF, GTI ve GTR tüm analiz suşları (n = 456)% 76 içeren en önemli genotipleri vardı. GTB w Orta Avrupa'da yer alıyorduhereas diğer genotip yaygın dağıtılmıştır. Suşların kalan% 24 birçoğu, ancak, sadece bir kez gözlendi 41 genotipleri dahil.

Genotipleri çok Avrupa düzeyinde olduğu Swiss'te yanı sıra, onların virülans gen modeli ile ilişkili olduğunu Fournier ve ark. ^2, Cosandey vd. ³ ve Graber vd. ⁵ ile çalışmalar daha gösterdi. Çalışmalar daha S. arasında IMI prevalansının büyük farklılıklar ortaya aureus GTB, GTC ve diğer genotipleri ^2,5: GTB dikkate alınarak, bir sürüdeki ineklerin% 87'ye kadar bu genotip ile enfekte edildi. GTC ve diğer genotiplerinin durumda, ancak, IMI sadece sürünün 1 ila 2 ineklerde tespit edildi.

IMI S. neden aureus, normal gelen meme bezlerinin iltihaplanması süt iltihaplı hücrelerin bir artış ile sonuçlanır. Bunun bir sonucu olarak, somatik hücre koSütteki unts (SCC), çoğu ülkede süt kalitesinin önemli bir göstergedir, azalan süt fiyatı ya da teslim durağına giden artar.

Fournier ve ark., ² RS-PCR yanı sıra, diğer yazma yöntemleri S. sığır suşları alt tiplerinin için tarif edilmiştir aureus ^8-11. İki ortak olanları spa yazarak ¹² ve Multi Odağı Sırası Yazma (MLST) ¹³ içerir. Ikinci bir 7 hazırlık geninin sıralama gerektirir, oysa önceki bir protein A stafilokok Spa kodlayan genin değişken aralayıcı bölgesini DNA dizilimi dayanır. Bu, bir ¹² ve yedi PCR ^13, sırasıyla özel ekipman kullanılarak amplikon saflaştırma, sıralama reaksiyonunun ve analiz, ardından yapılması gerektiği anlamına gelir. RS-PCR ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, düşük seviyede örnek ve yüksek maliyetleri ile sonuçlanan laboratuarda önemli bir ek bir çaba gerektirir.verim PFGE için özellikle düşüktür. S. sığır suşları için bu yöntemlerin çözünürlüğü göz önüne alındığında aureus, RS-PCR, en azından MLST ⁴ veya PFGE ¹⁵ den ⁴ ve daha iyi yazarak spa kadar iyidir.

İkili yazma ¹³ dahil olmak üzere tüm bu yöntemler S. neden sığır IMI patogenezinde içine daha fazla bilgi elde etkinliğini gösterdi aureus, ancak çünkü söz konusu kısıtlamalar onlar büyük klinik araştırmalar için daha az uygundur. Buna ek olarak, RS-PCR yöntemi ile genotipleme Fournier ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi. ² epidemiyolojik ve S patojenik potansiyeli güvenilir bir tahmin sağlar aureus, sığır IMI klinik veteriner hekimlikte iki anahtar değerleri çıkıyor.

Protokol

1. Staphylococcus aureus izolatları

1. S. 10 ul yayıldı aureus hazır bir kültür veya bir koloni,% 5 koyun kanı (BA) içeren Kolumbiya agar plakaları üzerinde seçici bir ortam üzerinde büyütülür.
2. 24 saat için 18 saat, 37 ° C 'de aerobik inkübe edin.

2. DNA Ekstraksiyon

1. 10 mM Tris-HCl ve 10 mM _Na2EDTA, pH 8.5 ihtiva eden TEl tamponu hazırlayın. 15 dakika boyunca 121 ° C'de alikotları ve otoklav hazırlayın.
2. 100 ul TEL steril plastik döngü veya steril ahşap kürdan ve tekrar süspansiyon kullanılarak BA 1 koloni toplayın. vidalı kapakları ile 1.5 ml tüpler kullanın.
3. 10 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, ıslak buz üzerinde hemen örnekleri yerleştirin.
4. PCR (PCR için = şablon DNA) için uygun H ₂ O 100: numuneleri 1 seyreltin. olmayan seyreltildi ve seyreltilmiş numune, 1 ay boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

3. RS-PCR

₂ O, Taq Master Mix ul 12.5, 2 ul G1 astar 10 uM, 2 ul L1 astar 10 uM ve saf yaklaşık 30 ng karşılık gelen şablon DNA 7 ul DNA, ^2.
1. Standart bir PCR döngü aşağıdaki döngü programı çalıştırmak: 15 dakika, 7 dakika boyunca 55 ° C 'de 2 dakika rampa ve tavlama takip 1 dakika için 94 ° C kapsayan 27 çevrim, ardından 95 ° C. Bir başka 2 dakika rampa sonra 2 dakika süreyle 72 ° C'de uzatma. 4 ° C'ye kadar soğutulduktan takiben 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma PCR sonlandırma.
   Not: PCR ürünleri, 5 gün boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
2. Her çalışma için, RS-PCR, yani pozitif kontrol, bilinen bir genotip (normalde GTP) bir örneği, ve bir negatif kontrolü _(H2O).

4. Elektroforez

1. Birlikte DNA (MED kiti) için bir ticari minyatür elektroforez kiti kullanınPC ve yüklü yazılım bağlı bir Bioanalyzer ile. dikkatle üreticinin gelen kılavuzları inceleyin.
2. çip astar istasyonu kurmak ve üreticinin kılavuzuna göre şırınga klibi ayarlayın.
3. üreticinin kılavuzuna göre jel boya karışımı hazırlayın.
4. (Üreticinin kılavuzuna göre) jel boya karışımı yükleniyor.
   1. kullanımdan önce, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında jel boya karışımı dengelenmesi.
   2. Çip astar istasyonunda yeni bir DNA çip koyun. iyi işaretlenmiş G. jel boya Pipet 9 ul
   3. piston 1 ml konumlandırılmış olduğundan emin olun ve sonra çip hazırlama istasyonu kapatın. Basın piston o şırınga klibi tarafından tutulan kadar. 30 sn sonra şırınga klibi yayınlayacak için tam bekleyin.
   4. 5 saniye bekleyin. Yavaşça 1 ml konumuna pistonu geri çekin.
   5. Her iki kuyularda Açık çip hazırlama istasyonu ve jel boya pipet 9 ul 'G' olarak işaretlenmiş.
5. M Yüklemearker
   1. 12 örnek kuyularda ve iyi merdivende marker Pipet 5 ul. Boş olan bu 13 kuyu herhangi bırakmayın.
6. Merdiven ve Örnekleri yükleniyor.
   1. Pipet merdiven işareti ile iyi işaretlenmiş DNA merdiveninin 1 ul.
   2. Numunenin Pipet 1 ul (kullanılan kuyular) ya da deiyonize su (kullanılmayan kuyuların) 1 ul.
   3. 2400 rpm'de 1 dakika için adaptör ve vorteks yatay çip koyun.
   4. 5 dakika içinde Bioanalyzer çipi çalıştırın.
7. Analizi Koşu
   1. Bioanalyzer ve bağlı bilgisayarınızı başlatın. yazılımını açın.
   2. Bioanalyzer kapağını açın ve (çip yalnızca bir şekilde oturabilir) yonga tutucu içine çip yerleştirin. dikkatlice kapağını kapatın.
   3. Yazılımın Enstrüman bağlamında "Elektroforez"> "dsDNA"> "DNA 7500" i seçin. Yazılımın güncel Dosya Öneki kabul edin veya değiştirin.
   4. yazılımda mevcut start düğmesine tıklayın. Yazılımın örnek adlarını girin. Çip çalışma bittiğinde (sonra yaklaşık 30 dakika) Run mesajın sonu Bioanalyzer yazılımında görünür.
   5. üreticinin talimatlarına göre Bioanalyzer elektrotları çipini çıkarın ve temizleyin.

5. Elektroforez Profilinden genotip çıkarımlar yapma

1. (Yazılım yazarlardan serbestçe kullanılabilir) Mahal yazılımını yükleyin.
2. > "Import Referans Veri" "Dosya": Mahal yazılımı içine alma referans verileri
3. Bioanalyzer yazılımı Veri bağlamında çalışır elektroforez açın. Bir numunede bir elektroforez profili seçin.
4. İlgili zirveleri için kontrol edin.
   1. "Araçlar"> "Mean Floresans": İlgili zirveleri kontrol etmek için Mahal yazılımını kullanın. "Floresan" kutusuna yerleştirinfloresans değerleri, Bioanalyzer yazılımından okunabilir şekilde, floresans (FU) olarak gösterilir. artan düzende en yüksek floresan 4 (3) zirveleri takın ve virgülle ayrılmış. Örnek: 126.130.132.137.
      NOT: tüm bu zirveleri FU Bioanalyzer yazılımı ile gösterilir, bunlar komplo onları okuyarak tahmin edilmesi gerekmektedir.
5. "Hesapla" tuşuna basınız. gözlenen floresan kutusuna "Minimal pik yüksekliği" verilen değeri aştığı takdirde bir zirve geçerlidir.
6. genotip anlaması.
   1. Mahal metin kutusu "Giriş Peaks (bp)" artan sırayla ilgili tüm piklerin bp ölçü ve virgülle ayrılmış içine yerleştirin. Örnek: 440.462.519.579.637.
      NOT: Bu en yüksek boyutlarda tüm Bioanalyzer yazılımı ile gösterilir, bunlar grafiğinden onları okuyarak tahmin edilmesi gerekmektedir.
7. "Hesapla" tuşuna basınız.
8. listesindekutu, asgari kare Mahalanobis mesafe "d2m" arayın. Bu ≥0.05 sağ karşılık gelen p değeri daha sonra olasılık sıfır hipotezi H ₀ reddedilir ≥5% ise (H _0: gözlenen ve referans profili aynıdır) gözlenen profilini özdeş olduğu kabul edilmektedir, yani belirtilen genotip referans profili.
9. D2m az ancak karşılık gelen P değerinin alan boş ise, bir olasılık <% 5 ile H ₀ reddediyoruz.
   Not: Bu d2m çok az olsa da profilleri eşit olduğu anlamına gelir. Bu tür bir sonuç, sigara ortalama elektroforez koşulları kaynaklanabilir.
   1. Bu sapmaların düzeltmek için, değeri 395 "Tepe (bp) Gözlenen" metin kutusuna takın ve "Hesapla" tuşuna basınız. Minimal d2m ve karşılık gelen P değeri ≥0.05 için tekrar kontrol edin. Başarılı değilse, değerleri 405, 415, ve 425 deneyin.
      NOT: Bazen küçük adımlar bile vardırbelirtilen. Gözlenen profil Referans veri mevcut değildir başarılı de, bu yeni genotip veya varyant olabilir.
10. çeşitli Profiller
    1. Yineleyin ayrı ayrı 5.6 her elektroforez profili için 5.9 için yineleyin.

Sonuçlar

Bir genotip ve türevleri tanımı

belirlenen tüm genotipler birden fazla bant farklı bir elektroforetik profilini yeni genotip olarak kabul edilir. Yeni genotipleri adlandırılır ve genişletilmiş Fournier ve diğerlerine göre. ⁵ GTAZ genotiplerin GTAA ardından GTZ genotiplerin GTA giden ve GTBA GTBZ için ve GTCC için GTCA düzeydedir. sadece bir bant değişimin, bir genotip bir varyasyon olarak kabul edilir. Bu g...

Tartışma

RS-PCR (> 30 saf DNA / tahlil ng) 'de DNA' sının aşırı olduğunda bütün prosedürün en kritik adımdır ^2. Bunu tüm tepe başlangıçta başlangıç ​​ve bitiş Genel olarak, bir profilin çözünürlüğü en uygunudur. iki tepe birbirine çok yakın ise, çözünürlük eksik. kılavuzu tanımlama gerekli olduğu şekilde, bu koşullar altında, Bioanalyzer yazılımı olmayan pik tanımlanmasına yol açabilir.

bp veya FU olarak ifade edilen tüm gözle görülür ayrılmış ve ilgili zirveleri ileriki analizl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tris(hidroksimetil)-aminometan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III Merck		1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Madde, Na2EDTA·'a eşdeğerdir; 2H2O
Hidroklorik asit 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar +% 5 koyun kanı	bioM ve eacute; rieux	43049
Agilent DNA7500 Kiti	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Biyoanalizör	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 uzman yazılım	yazılımı Agilent Technologies
HotStarTaq ana karışımı	Qiagen	203445
Astar L1	Mikrosin		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Astar G1	Mikrosin		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'