Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma
Bu makalede
Özet
Özet
Floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS), akış sitometrisi ile tespit edilen fenotiplere dayalı olarak belirli hücre popülasyonlarını saflaştırmak için kullanılan bir tekniktir. Bu yöntem, araştırmacıların diğer hücrelerin etkisi olmadan tek bir hücre popülasyonunun özelliklerini daha iyi anlamalarını sağlar. Manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama (MCS) gibi diğer hücre zenginleştirme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, FACS, akış sitometrisi ile fenotip tespit etme yeteneği nedeniyle hücre ayırma için daha esnek ve doğrudur. Ek olarak, FACS genellikle birden fazla hücre popülasyonunu aynı anda ayırma yeteneğine sahiptir, bu da deneylerin verimliliğini ve çeşitliliğini artırır. FACS'ın bazı sınırlamaları olmasına rağmen, hem in vitro hem de in vivo ortamlarda fonksiyonel çalışmalar için hücreleri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, pDC'nin in vitro fonksiyonel çalışmaları için lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden yüksek saflıkta çok nadir bir bağışıklık hücresi popülasyonu olan plazmositoid dendritik hücreleri (pDC) izole etmek için floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasını kullanan bir protokol sunuyoruz.
Giriş
Seçilen bir hücre popülasyonunun diğer hücrelerden verimli bir şekilde ayrılması, başka türlü mümkün olmayabilecek popülasyonun incelenmesini sağlar. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS), ilginç bir hücre popülasyonunu yüksek saflıkta zenginleştirmek için bir yöntemdir. 1,2 Farklı hücre tipleri genellikle, bir hücre popülasyonunu diğerinden ayırt edebilen plazma zarı üzerindeki benzersiz molekülleri veya birkaç molekülün benzersiz bir kombinasyonunu ifade eder. Bu hücre yüzeyi moleküllerinin spesifik floresan konjuge antikorlar tarafından bağlanması üzerine, akış sitometresi / sıralayıcı adı verilen bir tespit makinesi, tek hücre düzeyinde hü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: MRL / Mp-Fas lpr lupus eğilimli fareler yetiştirilen ve Virginia Tech (Hayvan Refahı Güvencesi sayısı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) gereklerine itibaren belirli bir patojen içermeyen tesiste muhafaza edildi (MRL / lpr): A3208-01). Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri IACUC protokolü # 12-062 altında gerçekleştirilmiştir.
1. Hücre Kültürü Orta ve Sıralama Tampon
- Tüm hücre kültürü ortamı (C 10),% 10 fetal sığır serumu, 1 mM sodyum piruvat,% 1, 100 MEM temel olmayan amino asitler, 10 mM HEPES, 55 uM....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Biz yüksek saflıkta kemik iliği PDC zenginleştirmek amaçladık ve IFNa üretme kabiliyetleri konusunda pDC fonksiyonel değişiklikleri incelemek için genç ve yaşlılık hem MRL / lpr lupus eğilimli farelerin diğer hücre türleri etkisi olmadan. Kullanılan ilk arıtma stratejisi Şekil 1'de görüldüğü gibi zenginleştirme sonra sadece% 7,75 saflıkta yol açtı, MCS, oldu. MCS ile karşılaştırıldığında, FACS% 96.4 gibi yüksek saflıkta PDC zenginleştirilmiş. Yüksek saflık sağlamak i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda açıklanan protokol, IFNa üretme yeteneğini koruyan canlı pDC'nin yüksek saflıkta zenginleştirilmesi içindir. Bu protokolün uygulamaları, hücresel ve moleküler fonksiyon çalışmaları için MRL/lpr ve diğer fare suşlarının kemik iliğinden pDC ve/veya diğer mononükleer hücrelerin saflaştırılmasını içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Bu protokoldeki birkaç kritik adım, sıralanan pDC'nin yüksek canlılığını ve saflığını sağlamaktır. İlk önemli adım, kemik iliğinin kemiklerden salınmasıdır. Kemik iliği hücrelerine .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, bu makalenin yayınlanmasıyla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine'deki Flow Sitometri Laboratuvarı'na flow sitometri çekirdek tesisinin kullanımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma XML'in başlangıç fonları tarafından desteklendi. XL, Biyomedikal ve Veterinerlik Bilimleri yüksek lisans programında Stamps Fellow'dur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | yaşam teknolojileri tarafından gibco | 11875-093 | |
| Fetal sığır serumu | HyClone | SH30396.03 | |
| sodyum piruvat | gibco | 11360-070 | |
| MEM esansiyel olmayan amino asitler | yaşam teknolojileri tarafından gibco | 11140-050 | |
| HEPES yaşam teknolojileri tarafından gibco | 15630-080 | ||
| 2-Merkaptoetanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| L-glutamin & | yaşam teknolojileri tarafından gibco | 25030-164 | |
| penisilin-Streptomisin | yaşam teknolojileri tarafından gibco | 15140-122 | |
| 1x Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi | Gibco by Life Technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stok Çözümü | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Yoğunluk gradyan ortamı | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-fare CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-fare CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-fare CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-fare PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-fare B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plazmasitoid Dendritik Hücre İzolasyon Kiti II, fare | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I akış sitometresi | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva versiyon 6 | BD Biosciences |
Kaynaklar
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Sta....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
