Bu el yazması, Escherichia coli'nin renal pelvise doğrudan intrarenal enfeksiyonu kullanan bir sıçan cerrahi piyelonefrit modelini tanımlamaktadır. Deneysel prosedür, piyelonefritin patogenezinin yanı sıra ilişkili inflamasyon ve fibrozisin patogenezini incelemek için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Intrarenal enjeksiyon Escherichia coli Piyelonefritli Sıçan Modelinde
Bu makalede
Özet
Özet
Piyelonefrit, böbreğin bakteriyel bir enfeksiyonudur ve en sık Escherichia coli'den kaynaklanır. Tekrarlayan enfeksiyonlar, sonuçta böbrek fonksiyonunun azalmasına neden olan önemli böbrek iltihabına ve fibroza neden olabilir. Piyelonefritin daha iyi klinik yönetimi ve önlenmesi başlatılmadan önce, ilerleme, nüks ve terapötik etkinlik mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir hayvan modeli oluşturulmalıdır. Transüretral enfeksiyon modeli, insan piyelonefritini yakından taklit eder, ancak bakterileri böbreğe taşımak için üretral reflüye dayanması nedeniyle önemli farklılıklar gösterir. Burada, sıçan renal pelvisine bakteri enjeksiyonları yapmak için ayrıntılı bir cerrahi protokol sağlanmış ve non-invaziv Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG) ile onaylanmıştır. Bu protokolü kullanarak, hayvanlar istenen bir E. coli bakteri konsantrasyonuna doğrudan maruz kalır ve yeterli ameliyat sonrası bakım ile cerrahi prosedürden tamamen iyileşebilir. Bu, salin (sahte) kontrolleriyle karşılaştırma için deney hayvanı modellerinin müteakip boylamsal MRG değerlendirmelerini kolaylaştırır. Bu doğrudan uygulama yaklaşımını kullanarak, enfeksiyonun şiddeti kontrol edilebilir ve ilerlemenin mekanik çalışmaları ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için uygulanabilir.
Giriş
Kemirgen modelleri, piyelonefrit ve idrar yolu enfeksiyonları (UYE) de dahil olmak üzere çok sayıda insan hastalık bulgusu üzerinde çalışmak için kullanılmıştır. İYE'ler küresel bir sağlık sorunudur ve her yaştan çocukları, erkekleri ve kadınları etkileyebilir. 1 , 2 , 3 ĐYE'lerin başlangıç tezahürü sistit içerir ve infüzyon üretere yükselirse böbrek enfeksiyonu (pyelonefrit) izlenebilir. Aynı zamanda, diyabet prevalansı dünya çapında 400 milyon kişiye yaklaşıyor. 4 , 5 Obezite olan veya tip 2 diabetes mellitus olan hastalarda İYE insidansı, 4 kez daha yüksek olabilir ve bu da tekrarlayan İYE enfeksiyonu (rUTI), sepsis, piyelonefritten renal fibrozis ve mesane disfonksiyonu riskinde artışa neden olur. 6 , 7 , 8 KemirgenModeller, ĐYE'lerin incelenmesinde önemlidir, çünkü mevcut antibiyotik terapileri sadece ĐY
Hayvan modellerini geliştirmenin amacı, hastalık ilerlemesinin ve terapötik müdahalelerin daha doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan teknikler geliştirmektir. Sıçanlarda ve / veya farelerde böbrek hasarının patofizyolojisini, antibiyotik tedavisinin etkilerini ve diğer ĐYE'lerin doğal seyrini incelemek için pyelonefriti indüklemek için çeşitli farklı yaklaşımlar kullanılmıştır. Retrograd İYE'nin kurulması için ortak bir yaklaşım, transüretral kateterizasyondur. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Bu yöntem, bakterileri üretra yoluyla anestezi altındaki hayvanlardaki idrar torbasına sokar. Bu teknik insan pyelonefritini yakından taklit ederken, pyelonefrit enfeksiyonunun asıl insidansı ve büyüklüğü, aşılama sırasında veya hemen sonrasında spontan üreterik reflü eksikliği veya üriner boşalma dahil olmak üzere çok faktör nedeniyle aşırı değişkenlik gösterebilir. 11 Sonuç olarak, yükselen pyelonefrit enfeksiyonunu indüklemedeki deneysel değişkenlik böbrek enfeksiyonlarını ve terapötik stratejileri incelemek için bu modelin faydasını kısıtlayabilir.
Bu rapor, E. coli'nin sıçan böbreğine doğrudan enjekte edildiği cerrahi bir pyelonefrit fare modelini tanımlamaktadır. Bu sıçan modelinin invaziv olmasına rağmen, böbreklere verilen E. coli miktarı, etkili bir şekilde kontrol edilerek sağlam bir böbrek enfeksiyonu ve enflamasyon sağlar. 14 Bu prosedür dahilinde ayrıca,In vivo Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI) ile bu indüklenen renal enfeksiyonların boylamsal olarak izlenebileceği.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan çalışmaları, Case Western Reserve Üniversitesi'nde onaylanmış Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokollerine göre gerçekleştirildi. Aşağıda tarif edilen cerrahi işlemin süresi yaklaşık 45-60 dk'dır. MR işlemi her zaman noktası için yaklaşık 15 dakika sürer.
1. Anestezi
- İntra-peritoneal enjekte edilebilir anestezi uygulamadan önce hayvanın taşınmasını ve kısıtlanmasını kolaylaştırmak için oksijen ile karıştırılmış% 2 izofluran seti olan izofluran bölmesindeki sıçana anestezi uygulayın.
- İzofluran'a maruz bırakıldıktan 3-5 dakika sonra, hayvanın anestezi altında olup olmadığını kontrol edin ve parmak sıkışmasına tepki göstermeyin.
- İntra peritoneal bir ksilazin ve ketamin karışımı ile sedat sıçanı: 75 mg / kg ketamin / 10 mg / kg xylazin. İntra peritoneal enjeksiyon yaparken, bağırsağın veya diğer hayati organların parçalarının delinmediğinden emin olmak için iğneyi geri çekin.
- benTopikal ağrı kesici sağlamak için insizyon alanına subkutanöz olarak 2 mg / kg bupivakain konulmalıdır.
2. Cerrahi Alanın Hazırlanması
- Ameliyat için kullanılmadan önce cerrahi aletleri ve malzemeleri sterilize edin ve sterilite için cerrahi yastığa yerleştirin. Çoğu araç ve gereç otoklavlanabilir ve tekrar kullanılabilir.
- Tüm cerrahi işlemler için steril eldiven kullanın.
- Hayvanın sağ tarafındaki kürkü tıraş etmek için elektrikli tıraş bıçağı kullanın. Hayvanı kaburga kafesinin altından arka bacağın üst kısmına traş için büyük saçsız alan sağlayacak şekilde tıraş edin.
- Hayvanı, steril bir cerrahi yastığa yerleştirerek dezenfekte edilen bölgeyi çevredeki alanlardan ayırın.
- Cildinizi povidon iyot veya betadin gibi bir dezenfektan ile ovun. Cerrahi alanın merkezinde ovma işlemine başlayın ve dairesel bir şekilde dışarıya doğru hareket ettirin. Yeni bir povidon iyot veya betadin silinerek en az üç kez tekrarlayın.
- İyot emilirse toksik olabilir, cilt berrak oluncaya kadar cerrahi alanı% 70 alkollü çubuk ile ovun.
3. Cerrahi İşlem
- Bu işlemi aseptik koşullar altında koruyun.
- Anestezi altındaki hayvanı sağ yan yüzü yukarı bakacak şekilde sol yanal dekübitüs pozisyonunda sıcak bir ısıtma yatağına yerleştirin.
NOT: Hipotermiyi önlemek için hayvanın çekirdek vücut ısısını 35-37 ° C'de tutmak için özen gösterilmelidir. Bu ısıtma yatağı, aseptik koşulları korumak için gerektiğinde sterilize edilmelidir. - Kaburga kafesini hissedin ve kaburga kafesinin altından başlayan steril bir boy 10 kestane bıçağı kullanarak küçük 2-3 cm sağ dorsal retroperitoneal kesi yapın.
- İnsizyonun her iki yanında uzunlamasına steril gazlı bez koyun.
- Karın boşluğunu görselleştirmek ve erişmek için subkutanöz dokuyu, yağ ve kasları parçalayın. Daha derinlere nüfuz edebilmek için kıvrımlı bıçaklı Mayo makas kullanınRasyonunu yara haline getirin ve kalın dokuları kesin.
- Karaciğer açıkça görünür ve erişilebilir olduğunda, karaciğeri yukarıya doğru geri çekmek için künt forseps kullanın.
- Öte yandan başka bir çift künt forseps kullanmak, sağ böbrekleri ortaya çıkararak karın boşluğunun hemen dışına oturur.
- Böbrek yerlerine tutturmak için işaretçisiyle parmağınızı ve sol elinizin başparmağını kullanın. Sağ elle, steril bir şırınga ile böbrek leğene (beyaz bir kabarcık olarak görülen) 15 ° C'de 0.1 ml UTI89 E. coli solüsyonu (1 x 10 8 -1 x 10 9 arasında konsantrasyon) enjekte edin 15 .
NOT: Bakteriyel titreyi referans 15'de açıklandığı gibi hazırlayın. - İnokulumun periton içerisine akmasını önlemek için iğne üzerine emilebilir bir hemostat şerit yerleştirin. İğneyi yavaşça böbrek pelvisinden çekin.
NOT: Çevredeki dokuları delmemeye veya enfekte etmemeye özen gösterilmeli ve bu da hedef dışı enfeksiyona neden olmaktadır.Ons ve / veya komplikasyonlar. - Karın boşluğuna geri koymadan önce böbrekleri normal tuzlu su ile iyice durulamak için daha büyük bir şırınga kullanın.
4. Sütürler
Not: Dokularda gömülecek sütür, absorpsiyon yapılmayan 4-0 örgülü dikiş olmalıdır. Emilebilir veya monofilament sütürler vücut yüzeyleri için kullanılabilir.
- Kan akışının engellenmesini önlemek için dikişleri eşit ve doku kenarına mümkün olduğunca yakın yerleştirin; Tipik olarak kenardan en fazla 0,3 cm uzaklıkta olmalıdır.
- Deriyi tutun ve bir çift güzel dişli forseps kullanarak hafifçe döndürün ve cildi delmek için hazırlıklı olarak iğne tutucusunu öne eğik bir konuma çevirin.
- İğneyi döndürmek ve deriden geçirmek için bilekleri sarkıtarak iğneyi cildin tam kalınlığına doğru itin.
- İşlemi yapan kişiye en yakın cilt kenarı için bu işlemi tekrarlayın.
- sıkmakDoku kenarlarına karşı koyacak kadar sütürler. Herhangi bir sıkılaştırma kan dolaşımını engelleyecek, yavaş yara iyileşmesi ve çatlamaya neden olabilir.
- Dikdörtgen düğümleri kullanarak sütürü sanki basit bir kesilen dikişmiş gibi sıkın, ancak kısa şerit kesilir, yaklaşık 3-4 mm'lik bir kuyruk bırakılır.
- İlk dikiş bağlandıktan sonra, ilk dikiş yaklaşık 3 mm uzaklıkta ikinci bir dikiş yerleştirmeye hazırlanın ve devam eden dikişe devam edin.
- İnsizyonun sonuna gelindiğinde, son dikişi tamamen içeri doğru çekmeyin. Bunun yerine, dikiş kapağının distal ucunu birbirine bağlamak için iğne tutacağı ile burada tutulan ilmek kısa şerit olarak kullanın.
- Bağlama kravatlarını kullanarak dikiş ipliğini kare düğümlerle birbirine bağlayın. Bu, 3 ucun tamamlanmış düğümden uzak uca yapışmasına neden olur.
5. Hayvan Kurtarma
- Anestezi tersine çevirmek için ameliyattan sonra intra-peritoneal olarak 2.1 mg / kg Yohimbine enjekte edin. bir3-5 saat sonra nimalslerin cerrahi prosedürden tamamen iyileşmesi bekleniyor.
- Hayvanı ısıtma yastığı (hipotermiden kaçınmak için) ve ameliyat sonrası emici yumuşak yatak takımı üzerinde tutun.
- Normal beslemeye geri dönene kadar oral veya parenteral sıvılar ile rehidrasyon sağlayın (24 saat içinde). Dehidrasyon etkilerini sınırlandırmak için ameliyattan hemen sonra yaklaşık 0.6 ml normal salin solüsyonunu peritoneal olarak enjekte edin.
- IACUC tarafından onaylanmış Hayvan Bakımı ve Kullanım Protokolünde tarif edildiği gibi analjezi sağlayın. Ağrı tedavisi için subkütan 5 mg / kg karprofen enjekte edin.
- İnsizyonları düzenli olarak şişlik, eksüda, ağrı veya delinme için izleyin.
Manyetik Rezonans Görüntüleme yoluyla 6. Doğrulama
- Yüksek alanlı küçük hayvan MRI tarayıcılarında i n vivo MRI deneyleri yapın.
- Oksijen içinde% 3 izofluran ile anestezi indükleyin ve izobasöre doğru böbrek ile yerleştirin.Radyofrekans bobini yedi. Bir nosekondan görüntüleme prosedürü boyunca sürekli olarak% 1-2 izofluran anestezi uygulanan hayvanlara sağlayın.
NOT: Şekil l'de gösterilen in vivo MR görüntüleri için sıçan boyutunda hacim bobini (iç çap = 72 mm) kullanıldı. - Her hayvanın solunum hızını (40-60 nefes / dakika) ve çekirdek vücut sıcaklığını (35 ± 1 ° C) korumak için bir hayvan izleme ve kontrol sistemi kullanın.
- Hem enfekte hem de kontrol böbreklerinin yüksek çözünürlüklü, eksenel T2 ağırlıklı görüntüleri elde etmek için çok dilimli, çok eko-spinli bir eko MR görüntü alımı kullanın. Tipik MR görüntüleme parametreleri, tekrar süresi = 5.000 ms, eko süresi = 40 ms, dilim kalınlığı = 2.0 mm, düzlemsel uzaysal çözünürlük = 200 μm, 3 sinyal ortalamaları ve 8 dakikalık bir edinme zamanıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tıbbi görüntüleme teknikleri, İYE'yi ve terapötik etkinliği invaziv olmayan bir şekilde değerlendirme fırsatı sunar. Bu nedenle, MR 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli'nin enjeksiyonundan sonra akut enfeksiyon uyarılmasını doğrulamak için ve ameliyat öncesi ve sonrası böbrek değişiklikleri görselleştirmek için kullanılmıştır. Şekil 1a-b , giderek artan böbrek enfeksiyonu bölgesini gösterir (sarı oklar). Enfeksiyon sonrası postoperatif 1. ve 4. günlerde her bir h...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kemirgenlerde artan akut pyelonefrit (örn. Fare ve sıçanlar) transüretral kateterizasyon ile üretilebilir. 16 , 17 , 18 Bu transüretral enfeksiyon yöntemi, invazif olmadığı ve artan enfeksiyonun insan patofizyolojisini taklit ettiği için avantajlıdır. 17 , 18 , 19 , 20 Bununla birlikte, bu yö...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların başka bir açıklaması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, NIH/NIDDK K12 DK100014 (Lan Lu), Case Comprehensive Cancer Center (NIH/NCI P30 CA43703) ve Clinical and Translation Science Collaborative of Cleveland'ın (NIH/NCATS UL1 TR000439) desteğini kabul etmek ister.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Emici Ped | Fisher | 14-127-47 | |
| Steril Pamuklu Gazlı Bez Ped | Fisher | 22-415-469 | |
| Lateks Cerrahi Eldivenler | Henry Schein Hayvan Sağlığı | 21540 | |
| Düz Künt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Neşter Sapı | Fisher | 08-913-5 | |
| Steril Neşter Bıçakları | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Şırınga | BD Biosciences | 309628 | Bakteriyel enjeksiyonlar için |
| 20 ml Luer-Lok Şırınga | BD Biosciences | 301031 | Tuzlu su yıkama için |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 inç. İğne | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 inç İğne | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 İnsülin Şırıngası | Exel International | 25846 | İlaç enjeksiyonları için |
| İzofluran | Henry Schein Hayvan Sağlığı | 050033 | |
| Ksilazin | Henry Schein Hayvan Sağlığı | 33197 | Enjekte Et IP |
| Ketamin | Patterson Veteriner Hekimi | 07-881-9413 | IP |
| Yohimbin (Atipamezol) | Edin: Patterson Veteriner Hekimi | 07-867-7097 | Ameliyat sonrası IP enjekte |
| edin Bupivakain (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | İnsizyon bölgesine SQ enjekte edin |
| 4-0 Kromik Bağırsak Sütürü | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Örgülü Vicryl Sütür | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Şırınga | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 veya CFT073 ATCC | 700928 | ||
| Cerrahi Emilebilir Hemostat Ethicon | Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRG | Bruker | 94/20 USR |
Kaynaklar
- Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
- Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
- Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
- Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
- Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
- Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
- Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
- Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329(2007).
- Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
- Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
- Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
- Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
- Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
- Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
- Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
- Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
- Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
- Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
- Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
- Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
