Bu rapor bakteriyel dış membran proteinlerinin ve insan tamamlayıcı regülatörü vitronectin arasındaki etkileşimler karakterize için iletişim kurallarını açıklar. İletişim kurallarını bağlama reaksiyonlar ve biyolojik fonksiyonu herhangi bir bakteri türlerinde vitronectin eğitim için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Vitronectin bakteriyel yapışma ve Serum direnç rolü eğitim için deneyleri
Bu makalede
Özet
Özet
Bakteri tamamlayıcı düzenleyiciler konak immün yanıt evading bir araç olarak kullanmaktadır. Burada, biz rol vitronectin edinme bakteri hücre yüzey çalış, direnç ana bağışıklık sistemi için değerlendirmek için protokol tanımlamak. Akış Sitometresi deneyler insan plazma vitronectin Haemophilus influenzae tip f bakteriyel reseptör dış membran protein H için bir ligand olarak teşhis etti. Bir enzim bağlı immunosorbent assay saflaştırılmış Rekombinant protein H ve vitronectin arasındaki protein-protein etkileşimler karakterize etmek için istihdam edildi ve benzeşme bağlama biyo-katman Interferometry kullanarak değerlendirildi. Vitronectin protein H Ana bilgisayar bağışıklık yanıtının kaçakçılığı bakteri hücre yüzeyinde bağlama biyolojik önemi bir serum direnç tahlil normal ve vitronectin tükenmiş insan serumu ile kullanarak teyit edildi. Vitronectin bakteriyel uyum içinde önemi ve vitronectin kaplama, Gram boyama tarafından takip olmadan cam slaytlar kullanılarak analiz. Son olarak, insan alveoler epitel hücre monolayers için bakteriyel yapışma araştırılmıştır. Burada açıklanan protokoller faiz bakteriyel herhangi bir tür çalışma odasına kolayca adapte edilebilir.
Giriş
Vitronectin (Vn) önemli bir insan glikoprotein homeostazı, düzenleme, fibrinolitik sistem üzerinden sürdürmek için yer var. VN da C5b6-7 karmaşık oluşumu ve C9 polimerizasyon sırasında terminal tamamlayıcı yolu engelleyerek bir tamamlayıcı regülatör işlev görür. Birçok bakteriyel patojenler Vn hücre yüzeyine karşı kompleman birikimi1,2,3aracı olarak işe gösterilmiştir. Buna ek olarak, bakteri ve ana bilgisayar epitel hücre reseptörleri, böylece teşvik bağlılık ve patojenler2,4,5içsel....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. bir bakteri yüzey Protein Ligand olarak Vn Analizi
-
Vn-bağlama kullanarak akış sitometresi bakteriyel yüzeyde tespiti
Not: akış sitometresi yan dağılım ve ileri dağılım olumlu olaylar kapı yapardık. Yalıtan Vn ile etkileşimleri incelemek için kurulan klinik (n = 10)7 E. coli BL21 ile birlikte seçildi (DE3) negatif kontrol (Şekil 1A) olarak.- Kültür kurulan klinik beyin-kalp infüzyon (BHI) orta 10 µg/mL NAD ve 200 devir / dakikada sallayarak ile hemin 37 ° C'de ile takıma izole ediyor. Luria-Bertani orta E. coli14kültü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
VN-bağlama bakteri yüzeyine Akış Sitometresi tarafından tespit edilmiştir. Tüm kurulan klinik yalıtır Bu çalışmada test Vn hücre yüzeyine işe. Vn etkileşimi ile hücre yüzeyine E. coli negatif kontrol zorlanma (Şekil 1A) gözlenmiştir. Şekil 1' deBgösterildiği gibi PH kurulan hücre yüzeyinde büyük Vn-bağlayıcı protein olur. Oysa kurulan M10Δlph Vn bağlanamadı ve denetimine benzer .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bakteriyel patojenler Vn hücre yüzeyine için recruit ve kompleman faktörler birikimi ve membran saldırı karmaşık2tamamlanmasını önlemek için bu tamamlayıcı regülatör kullanmaktadır. VN aynı zamanda bakteri yüzey proteinleri ve konak hücre yüzey reseptörlerinin, arasında bir köprü molekül olarak böylece patojenler epitel hücrelerinin yüzeyine uygun ve daha sonra içselleştirilmesi arabuluculuk etkinleştirme çalışır. Bu çalışmada serum direnci ve enhancement-in sağlanmasında Vn i) bağlama bakteri hüc.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir maddi çıkar çatışması var.
Teşekkürler
Bu eser hibe Anna Vakfı ve Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. ve Edla Johansson Vakfı, İsveçli Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir (sayı K2015-57 X-03163-43-4, vermek www.vr.se), kanser Vakfı Üniversitesi'nde Malmö, Physiographical toplum (Forssman'ın Vakfı) ve Skåne County Konseyi araştırma ve Geliştirme Vakfı hastanede.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL termomiksleyici | Eppendorf | 5355 | kuru blok ısıtma ve soğutma çalkalayıcı |
| 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp | BD Falcon | 60819-138 | 12 > 75 mm stil |
| %5 CO2 verilen inkübatör | Termo Bilimsel | ||
| 6 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp | VWR | 89000-478 | 12 > 75 mm stil, kapaklı |
| 24 oyuklu plakalar | BD Falcon | 08-772-1H | Hücre kültürü sınıfı |
| % 30 Hidrojen peroksit (H2< / sub>O2< / sub>) çözeltisi | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratuvar analiz sınıfı |
| 75 cm2 doku kültürü şişesi | BD Falcon | BD353136 | Bacalı |
| 96 kuyulu siyah düz tabanlı plaka | Greiner Bio-One | 655090 | Doku kültürü ile tedavi edilmiş ve mikro; Şeffaf siyah plakalar |
| A549 Hücre Hattı insan | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Hücre ayrılma enzimi (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Hücre Kültürü Sınıfı |
| AR2G sensörleri | Pall Life Science | 18-5095 | Amino birleştirme ile hareketsiz proteine sensör |
| Aseton | VWR | 97064-786 | Analiz sınıfı |
| Sığır Serum Albüminleri (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Hücre kültürü için uygun |
| Kabarcıklı kağıt | VWR | 28511-007 | |
| Biyo-katman interferometre | Pall Life Science | FB-50258 | Çift katmanlı interferometri ölçüm cihazları |
| Kristal viyole çözeltisi | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b bağlayıcı protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Dondurulmuş sıvı form olarak satın alındı |
| Kalsiyum klorür (CaCl2< / sub>) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin çözeltisi | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Sitrik asit | Sigma-Aldrich | 251275-500G | Amerikan Kimya Derneği (ACS) sınıfı |
| Renk Giderici çözüm | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli konakçı (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein ekspresyon konakçısı |
| F12 ortamı | Sigma-Aldrich | D6421 | Hücre Kültürü Dereceli |
| Akış sitometresi | BD Biosciences | 651154 | Araştırma uygulamaları için hücre analizi notu |
| Fetal Buzağı Serumu (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Hücre kültürü için uygundur |
| Normal insan serumu (NHS) | Kompleman Teknolojisi, Inc. | NHS | Havuzlanmış insan serumu |
| FITC konjuge eşek anti-koyun antikorları | AbD Serotec | STAR88F | Poliklonal |
| Gentamisin | Sigma-Aldrich | G1397 | Hücre kültürü sınıfı |
| Glikoz | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Jelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Hücre kültürü için uygun |
| Hemositometre | Marienfeld | 640210 | |
| HRP konjuge anti-His tag antikorları | Abcam | ab1269 | Poliklonal |
| İnsan Faktörü H | Kompleman Teknolojisi, Inc. | A137 | Dondurulmuş sıvı form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Dondurulmuş çözelti |
| İnsan serum albümini | Sigma-Aldrich | A1653-10G | liyofilize toz |
| Histidin afinite reçine sütunu (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Ni Sefaroz ile önceden paketlenmiş sütunlar |
| His etiketli PH | Laboratuvarımızda rekombinant olarak eksprese edilir ve saflaştırılır | ||
| İyot çözeltisi | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Metanol | VWR | BDH1135-1LP | Analiz sınıfı |
| Mikroskop | Olympus | IX73 | Ters mikroskop |
| Mikroskop slaytları | Sigma-Aldrich | S8902 | düz, boyut 25 mm ve kez; 75 mm |
| Magnezyum klorür (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plazmid içeren C terminali 6x Omurga üzerindeki His-tag (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vektörü |
| Polisorb mikrotitre plakaları | ELISA | Sigma-Aldrich | M9410 |
| Sigma-Aldrich | 6009 | Amerikan Kimya Derneği (ACS) sınıfı | |
| Koyun anti-insan Vn antikorları | AbD Serotec | AHP396 | Poliklonal |
| Çalkalayıcı | Stuart Scientific | STR6 | Platform çalkalayıcı |
| Doku kültürü şişesi | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| > Termomikser | Sigma-Aldrich | T3317 | Kuru blok ısıtma ve soğutma çalkalayıcı |
| Tetrametilbenzidin | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA sınıfı |
| İnsan plazmasından Vitronektin (Vn) | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | hücre kültürü sınıfı |
Kaynaklar
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
