Yöntem makalesi

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi

5.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54664

⸱

5 Kasım 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2School of Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Veterans Affairs, Tennessee Valley Health Authority

Bu makalede

Özet

Burada, β hücre proliferasyonunun müteakip immünofloresan analizi ile kültürdeki bozulmamış fare adacıklarına ilgi yüklü poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) mikrokürelerinin bileşiğini oluşturmak ve uygulamak için metodoloji sunuyoruz. Bu yöntem, aday β hücreli mitojenlerin etkinliğini belirlemek için uygundur.

Özet

biyo gelişimi, pankreas β-hücreleri de dahil olmak, hücre ve doku tiplerinin çeşitli hedeflenen ilaç iletimi için potansiyel önemli ölçüde arttırmıştır. Buna ek olarak, biyomalzeme parçacıklar, hidrojeller ve iskeleleri de eşsiz bir fırsat sunmak sürekli yönetebileceğini için, kontrol ilaç dağıtım ß-hücrelerinin kültür ve nakledilen doku modelleri. Bu teknolojiler sağlam adacıklar ve bir öteleme ilgili sistemini kullanarak aday β-hücre çoğalma faktörleri çalışma izin verir. Ayrıca, bir kültür sistemi içinde β-hücresi çoğalmasının uyarılması için aday faktörlerinin etkinliği ve uygulanabildiğini ortaya in vivo modeller ilerlemeden önce önemlidir. Bu yazıda, ilgi biyobozunur bileşik (ÇÇ) -yüklü poli (laktik-ko-glikolik asit) in situ bırakma o da sürekli etkilerini değerlendirmek amacıyla (PLGA) mikroküreler ile bozulmamış fare adacıklar kültür işbirliği için bir yöntem tarifβ-hücre çoğalması f mitojenik faktörler. Bu teknik, ticari olarak temin edilebilir maddeler kullanarak istediğiniz kargo içeren PLGA mikro küreler oluşturmak için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. tarif edilen teknik, bir örnek olarak, rekombinant insan bağ dokusu büyüme faktörü (rhCTGF) kullanırken, COI çok çeşitli kolaylıkla kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, β-hücresi çoğalmasını değerlendirmek için gerekli reaktiflerin miktarını en aza indirmek için, 96 gözlü levhalar kullanmaktadır. Bu protokol, hali hazırda alternatif bir biyo materyaller ve hücre yaşamım ve durumu gibi diğer endokrin hücre özelliklerini kullanmak için adapte edilebilir.

Giriş

Pankreas β-hücrelerinin vücuttaki yalnızca insülin üreten hücreler ve kan glukoz homeostazı sürdürmek için önemlidir. Sağlıklı bireylerin yeterli β-hücresi kütlesi ve uygun kan şekeri düzenleme işlevi de, diyabetli kişilerin yeterli β-hücresi kütlesi ve / veya fonksiyonu 1,2 ile karakterize edilmektedir. Β-hücresi çoğalmasını indükleyen sonuçta β-hücresi kütlesini artırmak ve diyabet 3 bireylerde glikoz dengesini geri olabilir önerilmiştir. etkili tedavilerin geliştirilebilir önce ancak, değerlendirme ve bozulmamış adacıklardaki potansiyel β-hücresi proliferatif bileşiklerin doğrulama gereklidir. Diyabetli bireyler haline kadavra insan adacıklar Nakli süredir kan glikoz dengesini geri yükler, ancak kullanılabilirliği ve bu deneysel işlemin başarısı adacıkları kıç nakli için mevcut insan adacık bir sıkıntısı ve ß-hücre ölümüne tarafından engellenirer nakli 4. Hatta insülin üreten hücrelerin çoğalmasını faktörlerin keşfiyle, büyük bir sorun hala in vivo ilgili sitelere bu faktörlerin teslim bulunmaktadır. β-hücresi proliferatif bileşiklerinin sürekli olarak verilmesi için bir strateji, poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA). PLGA FDA kullanım öyküsü, yüksek güvenlik, biyolojik olarak parçalanma ve uzatılmış salım kinetik 5 sayesinde ilaç verme ürünlerini onaylı vardır. Özellikle PLGA in vivo ya da vücutta doğal olarak oluşan metabolitlerin laktik asit ve glikolik asit içine kültüründe ya su ile hidroliz ile degrade laktit ve glikolid kopolimeridir. Kapsüllenmiş madde bileşiği, difüzyon ve / veya bozunma kontrollü salım mekanizmalarının her ikisi tarafından çevredeki salınabilir. COI kapsüllenmesi unencapsula göre reaktif biyolojik alınabilirliğini geliştirmek için, enzimatik bozulmaya karşı koruma sağlarted COI 5. Bu PLGA mikro-kültür, bozulmamış adacıklardaki Aday bileşiklerin uygulanması için kullanılan ve edilebilir nihai olarak canlı üzerinde olduğunu göstermektedir. Transplantasyon protokolleri incelenmiştir önce ex vivo adacıklar için β-hücre mitojenler yönetmek için PLGA etkinliğini test önemlidir.

Şu anda, canlı hayvanlarda β-hücresi çoğalmasını ölçmek için herhangi bir teknik yoktur. Deneyler, bu nedenle immunolabeling için Pankreatanın sonraki diseksiyon ve işleme, canlı hayvan bu bileşiklerin tatbikatını gerektiren in vivo potansiyel proliferatif bileşiklerinin etkinliğini değerlendirmek. Bu protokoller, pahalı ve zahmetli olan, ve adacıklar ulaşacak bir garantisi olmadan, sistemik olarak uygulanabilir bileşiğin gerektirir. Bunun aksine, çok ölümsüzleştirilmiş β-hücreleri, kültür insülin üreten hücrelerin çalışma için kullanılabilir, ancak bu hücre hatları adacık mimarisi ve ORTAM eksikliğit organizmalar 6 canlı bulundu. Ölümsüzleştirilmiş β-hücre hatları da, böylece, in vivo endogen β-hücrelerinin daha replikasyon çok daha yüksek bir derecesine sahip proliferasyonunu bileşiklerin analizi komplike olarak karakterize edilir. Bu çalışmada, yetişkin farelerden izole edilen sağlam adacıklar kullanan bir protokol açıklar. β-hücresi çizgileri farklı olarak, bozulmamış adacıklardaki normal adacık mimarisi korur. Benzer şekilde, doğrudan kültür, bozulmamış adacıklardaki proliferatif bileşiklerin uygulanması İn vivo yapılan deneylerde, aksine önemli ölçüde doğru β-hücresi çoğalmasını ölçmek için gerekli olan reaktifler miktarını azaltmaktadır.

Bu çalışma, bu örnekte, bir COI yönetmek için PLGA kullanan rekombinant insan bağ dokusu büyüme faktörü (rhCTGF). Bu inci halinde bileşik sürekli salgılanmasına izin veren burada tarif edilen yöntem, kültürlenmiş adacık ham bileşiğin tatbikat üzerine önemli bir avantaj kazandırane medya. Özellikle, bu deney proteinler ve bozulmamış adacıklardaki ilgi antikorların çeşitli yönetmek için değiştirilebilir. α-hücreleri de dahil olmak üzere başka endokrin hücre tipleri üzerinde etkiler de analiz edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm prosedürler onaylanmış ve Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ile uygun olarak yapıldı.

Fluorofor ile 1. Etiketleme COI (İsteğe bağlı)

  1. Mikroküre kargo görselleştirmek için, örneğin süksinimidil esterlerin ya da floresan türevleri gibi (bir protein ile ilgili, örneğin) bir serbest primer amini ile reaksiyona girecek bir floresan boya, seçin. dimetil sülfoksit 200 ul (DMSO) içinde fluorofor (COI mol göre) 8x mol fazlalığı içinde çözündürülür.
  2. Süspanse bir taşıt çözeltisi içinde 800 ul'lik nihai bir hacme (62.5 ng / ul nihai konsantrasyona) 'ye kadar COI 50 mg. Araç çözeltisi COI kaynağına bağlı olarak değişiklik gösterecektir.
    Not: tipik bir araç çözeltiler, fosfat tamponlu tuz (PBS) veya DMSO içerir.
  3. Adım 1.1 fluorofor / DMSO çözeltisi tüm ekleyin ve ÇÇ'nı tekrar süspansiyon. Vorteks gece boyunca 4 ° C 'de. Seçenek olarak ise, oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı vorteks4 saat (RT).
  4. etiketleme reaksiyonu takiben, bir tuz giderme kolonu kullanılarak aşırı fluorofor çıkarın.
    1. tuz giderme kolonundan saklama tamponu boşaltın ve iyonu giderilmiş su 16 ml ile yıkayın. üzerinden tüm akışını atın.
    2. tuz giderme kolonuna floresan etiketli COI ekleyin. iyonu giderilmiş su, 1.2 ml ile elüte ve akış toplar.
    3. Tekrar yıkama adımı ek dört kez, her iyonu giderilmiş su, 1.2 ml ilave ve ayrı bir örnek olarak akışı toplamak.
    4. -80 ° C de örnekler üzerinden toplanan tüm akış dondurma ve 24 saat boyunca üretici talimatlarına göre liyofilize edin.

2. Su-içinde-yağ-içinde-su emülsiyon çözücü buharlaştırma yöntemi ile Mikroküre Hazırlama COI yüklü

  1. İlk su fazının (W1) oluşturmak için iyonu giderilmiş suyun 100 ul 1 mg floresan etiketli COI ekleyin.
  2. poli 65 mg çözülür (laktik-ko-glikolik acid) (50:50 laktid: glikolid, molekül ağırlığı 54.000 - bir mikrosantrifüj tüpü içinde, diklorometan içinde 750 ul 69,000). 10 Ultrasonicate - (160 W) 30 sn tamamen PLGA çözmek için. Bu yağ fazı (O) oluşturmaktadır.
  3. damla damla bir şekilde Ç evresine adım 2.1 oluşturulan W1 faz bütün ekleyin. W1 / O fazı oluşturmak için 30 saniye için 20,000 rpm'de bir elle tutulan homojenleştirici kullanılarak emülsiyon haline.
  4. 30 saniye için 20,000 rpm'de 1%, 15 ml (ağırlık / hacim), sulu bir poli (vinil alkol) (PVA) solüsyonu, damla damla bir tarzda W1 / O faz her ekleme ve elle tutulan homojenleştirici kullanılarak emülsiyon haline .
  5. solventi çıkarmak ve sulu fazın üretilmesi için, 1 saat için bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 635 mm Hg vakum için 200 ml yuvarlak tabanlı bir şişe ve konuyu adım 2.4 oluşturulan emülsiyon tüm aktarın.
  6. Sulu fazın kısım 1 mi adım 2.5 ila on dört mikrosantrifüj tüpleri oluşturulur. 7,500 de mikrosantrifüj tüpleri içinde sulu çözeltinin santrifüj8 dakika için xg.
    NOT: Bu adımda, mikro kalan sulu çözelti içinde mevcut olan ve bir mikrosantrifüj tüpüne altına konsantre edilmiştir.
  7. mikrosantrifüj tüpü altındaki mikro küreler rahatsız etmeyecek şekilde dikkatli bir şekilde, bir mikropipet ile mikrosantrifüj tüpleri pipetleme sulu çözelti 900 ul çıkarın.
    1. Her bir mikrosantrifüj tüpüne deiyonize su 1 ml eklenerek aşırı PVA'nın mikro küreleri yıkayın. mikrosantrifüj tüpü altındaki mikro küreler rahatsız etmeyecek şekilde 8 dakika boyunca 7.500 x g'de santrifüj ve yeniden dikkatli bir mikropipet ile mikrosantrifüj tüpleri pipetleme sulu çözelti 900 ul çıkarın.
      Not: Geri kalan 100 ul sulu çözelti elde mikro küreler içerir.
  8. -80 ° C de aşama 2.7 üretilen sulu bir mikroküre çözelti dondurularak.
  9. göre bir dondurarak kurutucunun kullanarak Lyophilize mikroküreler üreticinin-20 ° C'de talimatları saklayın.
    Not: Tamamen PLGA mikro küreler eritilmesi ve serbest protein 7, standart bir eğriye protein konsantrasyonu görece belirleyerek COI yükleme etkinliğini ölçmek.
  10. Bir negatif kontrol olarak, (bundan sonra kontrol mikro-küreler olarak adlandırılır) "boş" mikro-küreler toplu oluşturur.
    Not: Kontrol mikrosferlerin üretimi adım 1.2 araç çözeltisi 800 ul Resim COI eklenmesiyle hidrofilik COI yüklü mikro-üretimi ile aynıdır. β-hücresi mitojen deneyi için COI yüklenmiş PLGA mikro küreler PLGA göreceli kütle konsantrasyonunda maçı kontrol parçacıklar.

Adacık Kültür Medya ve Pre-tahlil Medya 3. hazırlanması

  1. sağlam fare adacıkları kültür 200 ml ortam hazırlayın: RPMI 11 mM glukoz,% 10 at serumu, 100 U / ml penisilin G ve 100 ug ile desteklenmiş 1640 ortamında ml streptomisin (bundan sonra ise şu şekilde de ifade /) Kültür ortamı sağlar.
    Not 1: fetal sığır serumu (FBS) farklı olarak, at serumu plasental laktojen, proliferasyon tahlilinde analiz boşa β-hücresi proliferasyonu, bir indükleyici yoksundur.
    NOT 2: PLGA mikroküreler kullanmadan önce sterilize edilmez gibi, kültür ortamına antibiyotik eklenmesi mikrobiyolojik kontaminasyonu önlemek için çok önemlidir.
  2. 50 ml konik tüp içinde bir elektronik pipet ve yer ile adacık kültür ortamı 25 ml çıkarın. ön-deney ortamı oluşturmak için 0.2 mM EGTA bir son konsantrasyon ile 50 ml konik bir tüp içinde doku adacığı kültür ortamı 25 mL Supplement.
    NOT: EGTA eklenmesi hafif adacık mimarisi değiştirmeden adacık hücre-hücre kişileri gevşetir. Bu adacık iç hücrelere ulaşabilir ÇÇ'nı sağlamaya yardımcı olur ve merkezi adacığın nekroz önlemeye yardımcı olur.

Bozulmamış Fare Adacık 4. Kültürleme

  1. önceden seçilen suşu, cinsiyet, ag bozulmamış adacıkları izolePankreas 8,9 rutin bir kolajenaz sindirimi ardından fare E ve genotip. Havuz birlikte örneklerinden gibi gelen adacıklar.
  2. Kısım adacık kültür ortamı 200 ul, 96 oyuklu bir doku kültür plakasının bir oyuğuna 40 adacıklar. kuyu başına Görme boyut maç adacıklar (numuneler arasındaki adacık denklik (IEQ) kesin bir değerlendirme gerekli değildir). bir buharlaştırma tamponu sağlamak için, 200 ul steril su ile adacıkları ile gözlere hemen bitişik boş kuyu doldurun. Kültür% 95 hava ve% 5 CO2 atmosferi altında bir gece boyunca 37 ° C 'de ortam adacıklar.

COI yüklü ve Kontrol PLGA Mikrokürelerinin 5. Yeniden süspansiyon

  1. gece boyunca doku adacığı çıktıktan sonra, liyofilize COI yüklü PLGA mikro-bir kısım ön deney ortamı eklenerek tekrar süspansiyon mikro bu mikrosantrifüj tüpü içinde COI nihai konsantrasyonu, 10 ng / ml (belirli bir miktarda COI miktarı, olduğu oluşturulan microspheres adım 2.9) 'de tespit edilmiştir. 4 ° C'de 10 sn uzun puls W 160 ° C'de 10 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde yeniden süspansiyon haline getirildi COI yüklü mikro küreler sonikasyon.
  2. Liyofilize kontrol PLGA mikrokürelerin eşit kütlesine öncesi deney ortamı aynı hacimde ekleyerek yeniden süspanse kontrolü PLGA mikroküreler. 4 ° C'de 10 sn uzun puls W 160 ° C'de 10 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde yeniden süspansiyon haline kontrol PLGA mikro küreleri sonikasyon.
  3. Görme mikro küreler iki cam lamelleri arasında yeniden süspanse mikroküreler 2 ul pipet ile dağılmış onaylayın. Epifloresans veya aydınlık mikroskop 40X objektif kullanılarak mikroküreler gözünüzde canlandırın.
  4. mikro-belirgin çekiş hala görünür ise, 4 ° C'de 10 sn uzun bakliyat ve yeniden süspansiyon haline getirilmiş mikro kürelerin tekrar görselleştirme W 160 ° C'de ek bir 10 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde sonikasyon.

ÇÇ yüklü veya Control PLGA Mikrokürelerinin ile Adacık 6. Tedavi

  1. her bir COI yüklü mikro-küreleri ile tedavi edilmesi için, 100 ul'lik bir son hacim ve önceden belirlenmiş bir son konsantrasyona ön-deney ortamı, yeniden süspansiyon haline ÇÇ mikro-10 ng / ul seyrelterek deney ortamı hazırlar.
    Not: protein uygun nihai konsantrasyon Bu deney için kullanılan her COI için değişecektir. İdeal olarak, nihai bir konsantrasyon aralığı test edilmiştir.
  2. her bir kontrol olarak kullanılmak üzere, adım 6.1 COI yüklü mikro küreler seyreltilmesi için kullanılan aynı seyreltme hacimde Aşama 5.2'de elde yeniden süspanse kontrol PLGA mikro-seyreltilmesiyle kontrol deneyi ortamı hazırlar.
    NOT: Kontrol deney ortamı ile tedavi Adacık boş mikroküreler deneysel sonuçlar üzerine olabilecek etkisi algılanmasını sağlamak için bir negatif kontrol olarak görev yapacak.
  3. Dikkatle Resim adacıklar kuyulardan yerinden olan bu gibi bir mikropipet ile her bir adacık kültür ortamında 100 ul çıkarın. Yavaşça 100 mikron eklemekDeney ortamı veya her bir kontrol deney ortamı 100 ul l.
  4. Üç gün boyunca% 95 hava ve% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C 'de adacıklar inkübe edin.

7. Mikroskop Slaytlar üzerine Sağlam adacıklar Dispersleme

  1. Üç gün sonra, adacıklar çıkarmak için değil dikkatli bir şekilde tüm kuyulardan tahlil ortamı çıkarın ve atmak için bir mikropipet kullanın. Yavaşça tahlil medya onları yıkamak için adacıklar PBS ul 200 ekleyin. Dikkatlice çıkarın ve bir mikropipet ile PBS atmak ve yavaşça ilave 200 ul PBS ile tekrar adacıklar yıkayın.
  2. Çıkarın ve mikropipet ile PBS atmak ve% 0.025 tripsin 100 ul, 2 mM EDTA çözeltisi ekleyin. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Pipetleyin tripsin-EDTA çözeltisi yukarı ve adacıklar görsel tek hücrelere dağılması teyit kadar aşağı her 2 dakikada adacıklar bir ışık mikroskobu kullanılarak (hücre bazı küçük kümeleri hala mevcut olabilir unutmayın). her bir kuyunun bireyin tüm hacmi aktarınly labeled- mikrosantrifüj tüpleri içine.
  3. Tripsin-aracılı hücre ayrışmasını durdurmak için her mikrosantrifüj tüp adacık kültür ortamı 400 ul ekleyin.
  4. 4 ° C 'de 100 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj örnekleri mikrosantrifüj tüplerine altına adacık hücreleri pelet.
  5. Yavaşça 200 ul taze adacık kültür ortamı bir mikropipet kullanarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
  6. Bir sito-santrifüj kullanarak, santrifüj yüklü mikroskop lamı üzerine 3 dakika boyunca 140 xg'de adacıklar ayrışmış.
  7. Oda sıcaklığında hava kuru slaytlar 10 dakika, daha sonra bir hidrofobik işaretleme kalemi ile ayrışmış adacıklar etrafında bir kutu çizin.
  8. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 75 ul% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin sabitleyin. % 4 PFA çıkarın ve yavaşça PBS 75 ul iki kez yıkama hücreleri. Yıkama işleminden sonra, 75 ul% 0.2 Triton X-100, PBS içinde 10 dakika boyunca hücreler geçirgenliği. Daha sonra, 75 ul PBS ile yıkama hücreleri.
    Dikkat: PFA, alerjik karsinojenik ve toksik olduğu bilinmektedir.

8. İmmünofloresan İnsülin için Dissosiye Adacık Etiketleme ve Hücre Çoğalma Marker, Ki67

  1. 100 slayt kapasiteli mikroskop lamı kutusunun alt iki ıslak kağıt havlu koyarak nemli odasına hazırlayın.
  2. Yeri nemli odasında aşağı düz (yukarı bakacak şekilde hücreler) slaytlar. bir mikropipet kullanarak, önceki yıkama aşamasından PBS aspire ve bloke etme çözeltisi 75 ul ekleyerek etiketleme için numune hazırlanması (% 5 normal eşek serumu, PBS içinde (NDS)) numuneler için antikorların spesifik olmayan bağlanma bloke her kaydırın. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke çözüm slaytlar inkübe edin.
  3. Yavaşça aspire mikropipet kullanılarak gine domuzu anti-insülin ile ve tavşan anti-Ki 67 antikorları ihtiva eden birincil antikor çözeltisinin 75 ul bloke etme çözeltisi, PBS içinde% 5 NDS 1 ug / ml seyreltilmiştir. 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    NOT: hücre çoğalması Alternatif belirteçleri hücre nükleer antijeni (PCNA) ve phosph çoğalan içerirohistone H3 (PH3),
  4. Yavaşça bir mikropipet kullanarak birincil antikor çözüm aspire ve 75 ul PBS ile hücreleri yıkayın. PBS aspire bir mikropipet kullanarak ve hücreler iki kez daha, 75 uL PBS ile her zaman yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke etme çözeltisi 2 ug / ml'ye seyreltilmiş 75 ul anti-kobay Cy5 sekonder antikor ve anti-tavşan Cy3 ikincil antikor ile her bir örnek inkübe edin.
    NOT: Zaten mikroküreler etiketlemek için kullanılan aynı ya da spektral örtüşen florofor ile işaretlenmiş sekonder antikorlar kullanmayın.
  5. Mikropipet kullanılarak ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca PBS içinde 300 nM DAPI 75 ul inkübe aspire sekonder antikor çözeltisi. Aspire DAPI bir mikropipet kullanarak ve 5 dakika boyunca iyonu giderilmiş su içinde durulayın.
  6. Yavaşça bir mikropipet kullanarak numunelerin su aspire. bir damla bir cam lamel antifade reaktifi ihtiva eden hızlı kuruyan monte çözeltisi (yaklaşık 100 ul) nokta. o, aşağı mikroskop lamı örnek tarafı ters çevirinmontaj çözümü nto. Yavaşça kabarcıklarını çıkarmak ve yumuşak bir temizleme dokusu ile aşırı sıvı silip bir pipet ucu kullanılarak slayt karşı lamel basın. lamelleri oda sıcaklığında bir gece boyunca kurumaya bırakılır.

9. Görüntü Alma ve Analiz

  1. görüntü elde etmek için ekli kamera ile bir Epifloresans mikroskop kullanın. Her fluorofor için en uygun pozlama süresi (- Ki67 için insülin 80 msn ve 250 msn DAPI için tipik olarak 20 milisaniye, 40) belirler. görüntü elde etme parametreleri tüm örnekler için eşit olduğundan emin olun.
  2. Her numune için, elle 3,000 insülin pozitif hücrelerin sayısı ve bunların da Ki67 pozitif kaç saymak. Sadece iyi tanımlanmış ve açıkça görülebilir bir çekirdeği insülin-pozitif hücrelerin sayısı. insülin-pozitif hücre sayısı ile Ki67 pozitif / insülin-pozitif hücrelerin sayısını bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile her numune için β-çoğalan hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
  3. Gün sonraβ-hücresi proliferasyonunda anlamlı bir fark kontrol ve tek yönlü bir varyans analizi ticari olarak temin istatistiksel yazılım kullanarak bu sonuçlara bakarak deney örnekleri arasında mevcut olan, her bir numune için β-hücrelerinin yüzdesinin etermining, belirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1, yukarıdaki protokol kullanılarak oluşturulan mikro-görsel bir temsilidir. Burada açıklanan protokol çeşitli büyüklüklerde rhCTGF yüklü mikro küreler elde edilir. Bazı mikro daha büyük (Şekil 2) olabilir ancak mikro kürelerin büyük kısmı, çapı 1 um ila 10 olacaktır. Eğer arzu edilirse, mikro küre boyutu ayarlanmış ve homojenizasyon hızı ve süresi, kullanılan yüzey aktif madde konsantrasyonu, ve her bir su / yağ / su fazı 10<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

kültür içinde β-hücresi çoğalmasının bir çalışma tipik olarak birkaç zorluklar tarafından engellenmiştir. İlk olarak, ölümsüzleştirilmiş β-hücresi çizgileri canlı adacıklar endojen β-hücrelerinde bulunan daha çoğalmasının yüksek derecede karakterize edilir. Buna ek olarak, bu ölümsüz hücre kuşakları, normal β-hücresi fonksiyonu için kritik normal yapısını yoksundur. Bu iki olgu sonuçlar, in vivo ya da bütün adacıklar test edildiğinde de geçerli olacaktır ölümsüzleştirilmiş β-hücresi çizgileri kullanılarak elde ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu el yazmasını eleştirel bir şekilde okuduğu için Bethany Carboneau'ya (Vanderbilt Üniversitesi) teşekkür eder. Ayrıca adacık izolasyonları için Anastasia Coldren'e (Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Adacık Tedarik ve Analiz Merkezi) ve santrifüj ve doku kültürü tesislerinin kullanımı için Dr. Alvin C. Powers'a (Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi) ve Dr. David Jacobson'a (Vanderbilt Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu araştırma, NIH hibe DK20593 tarafından desteklenen Vanderbilt Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi'nin Adacık Tedarik ve Analiz Çekirdeğinin kullanımını içeriyordu. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (14POST20380262) ile RCP'ye ve Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı'ndan (1-2011-592) ve Gazi İşleri Bakanlığı'ndan (1BX00090-01A1) M.A.G.'ye hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Oregon Yeşili 488 Karboksilik Asit, Süksinimidil Ester, 6-izomerThermoFisher ScientificO6149COI'yi florofor
DMSO Dimetil SülfoksitFisher BioReagentsBP231-1Adım 1'de floroforu çözmek için
Tek kullanımlık PD-10 Tuz Giderme SütunlarıGE Healthcare17-0851-01Adım 1'de
kullanılan tuz giderme sütunuResomer RG 505, Poli (D, L-laktid-ko-glikolid), ester sonlu, moleküler ağırlık 54.000 - 69.000Sigma-Aldrich739960Adım 2'de mikrokürelerin oluşturulmasında kullanılır
Poli (vinil alkol) moleküler ağırlık 89.000 - 98.000Sigma-Aldrich341584Adım 2'de mikro kürelerin oluşturulmasında kullanılır
RPMI 1640Thermo Scientific11879-020Adacıkların kültürlenmesi için
Dekstroz SusuzFisher BioReagents200-075-1Adacıklar ortamı için takviye
Penisilin-StreptomisinSigma-AldrichP4333Adacıklar için antibiyotikler
Normal at serumuJackson ImmunoResearch008-000-121Adacıklar için ek
96 oyuklu doku kültürü plakasıCorning3603Adacıkların
kültürü içinEtilen gliko-bis (2-aminoetileter) - N, N, N', N' < / em>-tetraasetik asitSigma-AldrichE4378Ön tahlil adacık ortamı için takviye
Cytospin 4 SitosantrifüjTermo BilimselA78300003Hücreleri mikroskop slaytları üzerine döndürmek için
EZ Tek SitohuniTermo BilimselA78710020Hücreleri mikroskop slaytları
üzerinde döndürmek içinEtilendiamintetraasetik asitFisher BioReagentsBP118-500Adacıkların ayrıştırılmasında kullanılır
paraformaldehitSigma-AldrichP6148Hücreleri sabitlemek için
Triton  X-100Fisher BioReagentsBP151Geçirgen hücreler için
Normal eşek serumuJackson ImmunoResearch017-000-121İmmünofloresan için bloke edici reaktifler
Ki67 için anti-Ki67 antikoruabcamab15580immünofloresan
Poliklonal Gine Domuzu Anti-İnsülinDakoA0564İnsülin immünofloresan
Cy3 AffiniPure için Eşek Anti-TavşanJackson ImmunoResearch711-165-152Ki67 immünofloresan
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea PigJackson ImmunoResearch706-175-148İnsülin immünofloresan
için DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)ThermoFisher ScientificD1306İmmünofloresan Aqua-Mount'ta
çekirdek görselleştirme içinLerner Laboratories13800Hızlı kuruyan montaj ortamı
FreeZone -105 > C 4.5 Litre Cascade Tezgah Üstü Dondurarak Kurutma SistemiLabconco7382020Mikrokürelerin liyofilizasyonu için
ile etiketlemek için

Kaynaklar

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
  3. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
  4. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823(2012).
  5. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
  6. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
  7. Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
  8. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  9. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255(2007).
  10. Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
  11. Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
  12. Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
  13. Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
  14. Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
  15. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  16. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  17. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
  20. Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
  21. Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
  22. Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
  23. Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
  24. Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PLGA MikrosferlerBeta H cre ProliferasyonuBozulmam Adac klarS rd r lebilir Sal mBile ik Y klemeMikrosfer retimiAdac k K lt rmm nolabelingKi67 KantifikasyonuSitosantrif j

İlgili makaleler