Yöntem makalesi

RNA ölçülmesi için bir yöntem K 6 -methyladenosine Değişiklikler

DOI:

10.3791/54672

⸱

5 Aralık 2016

 ,  , 
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA N 6 -methyladenosine (m 6 A) değişiklikleri ölçmek için bir değiştirilmiş Northern lekeleme yöntemi tarif edilmektedir. Geçerli yöntem çeşitli deneysel tasarımlar altında çeşitli RNA'lar modifikasyonlar ve kontrolleri tespit edebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N 6-Metiladenozin (m6A) RNA modifikasyonları ökaryotlar arasında çeşitli ve her yerde bulunur. mRNA, rRNA, tRNA ve mikroRNA'da bulunurlar. Son çalışmalar, bu tersinir RNA modifikasyonlarının RNA ekleme, translasyon, bozunma ve lokalizasyonunu etkilediğini ortaya koymuştur. Sirkadiyen ritimler, kök hücre pluripotentliği, fibroz, trigliserit metabolizması ve obezite gibi çoklu fizyolojik süreçler de m6A modifikasyonları ile kontrol edilir. İmmünopresipitasyon / dizileme, kütle spektrometresi ve modifiye kuzey lekeleme, m6A modifikasyonlarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan yöntemlerden bazılarıdır. Burada, m6A modifikasyonlarını ölçmek için bir kuzeydoğu lekeleme tekniği sunuyoruz. Mevcut protokol, RNA'nın iyi boyutta ayrılması, çeşitli deneysel tasarımlar için daha iyi konaklama ve standardizasyon ve çeşitli RNA kaynaklarında m6A modifikasyonlarının net bir şekilde tanımlanmasını sağlar. M6A modifikasyonlarının sirkadiyen ritimler ve obezite ile ilgili insan fizyolojisi üzerinde çok önemli bir etkiye sahip olduğu bilinmesine rağmen, diğer (pato)fizyolojik durumlardaki rolleri belirsizdir. Bu nedenle, m6A modifikasyonları üzerine yapılan araştırmalar, moleküler fizyolojiye temel bilgiler sağlamak için muazzam bir olasılığa sahiptir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinamik ve tersinir RNA modifikasyonlarının RNA homeostazında önemli rolleri vardır. Kırk yıl önce, N 6-metiladenozin (m6A) modifikasyonlarının ökaryotik transkriptomlarda bol miktarda bulunduğubulundu 1. Haberci RNA (mRNA), ribozomal RNA (rRNA), küçük nükleolar RNA, transfer RNA ve mikroRNA2'de çeşitli işlevlere sahiptirler. mRNA'nın m6A modifikasyonları, eklemelerini3, translasyon4, bozunma5 ve lokalizasyon2'yi etkiler. Ayrıca, ribozom biyogenezini ve mikroRNA fonksiyonunuetkilerler 6. RNA'nın m6A modifikasyonlarının evrimsel korunumu, tek hücreli bakterilerde çok hücreli insanlara7 not edilmiştir. M6A modifikasyonlarının rollerinin tanımlanması şu anda kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır. Çabaların transkripsiyon kontrolüne yeni bakış açıları sağlaması bekleniyor. Son çalışmalar, mRNA8'in diğer kimyasal modifikasyonlarının da RNA metabolizmasında kritik roller oynadığını ortaya koymaktadır.

Sirkadiyen ritimler9, kök hücre pluripotensi10, trigliserid metabolizması4, fibroz11, obezite12 ve majör depresyon13, m6A modifikasyonlarının sonuçları kontrol ettiği bilinen süreçlere birkaç örnektir. Birçok sirkadiyen saat gen transkriptinde m6A bölgeleri14 bulunur. m6 A metilazveya demetilaz modülasyonu sirkadiyen dönem değişiklikleriniortaya çıkarır 15. Bir m6A transferaz olan Mettl3, kök hücre pluripotentliği için bir düzenleyicidir. Mettl3 eksikliği, implantasyon sonrası aşama10'da erken embriyonik ölümcüllüğe ve anormal soy astarına yol açar. Adipositlerde yağ kütlesi ve obezite ile ilişkili (FTO), bir m6A demetilaz eksikliği, Angptl44'ün transkripsiyon sonrası regülasyonu yoluyla yağ asidi mobilizasyonunu ve vücut ağırlığını etkiler. Bu çalışmalar, m6A'nın sadece mRNA işlemeyi kontrol etmekle kalmayıp, aynı zamanda embriyolojik gelişim ve pato-fizyolojide de kritik roller oynadığını ortaya koymaktadır. M6A modifikasyonlarının işlevi, gelecekteki terapötik düşünceler için çıkarımlar taşır.

RNA16-18'in m6A modifikasyonlarını ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Geleneksel olarak, ince tabaka kromatografisi (TLC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC),m6A'nın çeşitli RNA'lardaki dağılımını incelemek için kullanılır19,20. Kütle spektrometresi, RNA'daki m6A modifikasyonlarının tespiti için hassas bir araçtır. Bununla birlikte, kütle spektrometresi21 ile analiz edilmeden önce RNA'nın RNaz tarafından kısa parçalara ayrılması gerekir. Metil-RNA immünopresipitasyon ve dizileme (m6A-Seq)22, parçalanmış RNA'ları m6A-spesifik antikorlarla immünopresipitite eder ve paralel RNA dizilemesi gerçekleştirir. Bu yöntem, transkriptom genişliğinde m6A manzaraları oluşturur. m6A bireysel nükleotid çözünürlüklü çapraz bağlama ve immünopresipitasyonun (miCLIP) yüksek çözünürlüklü haritalanması, tek nükleotid çözünürlüğünde m6A modifikasyonlarını daha da haritalandırır23. Her iki yöntem de, belirli genlerin bilgileriyle birlikte tüm transkriptom boyunca m6A modifikasyonunun ayrıntılarını sağlar. Bununla birlikte, deneyler birden fazla koşulun karşılaştırılmasını gerektiriyorsa, her iki yöntemde de nicelikler ve standardizasyon zordur. Ayrıca, m6A-Seq için RNA'nın parçalanması, orijinal RNA yapısını değiştirir ve bu da doğal m6A seviyelerini etkileyebilir. RNA'nın global m6A modifikasyonlarını ve farklı deneysel koşullar altında değişikliklerini tespit etmek için, modifiye edilmiş bir kuzey lekeleme protokolü kullanan bir yöntem rapor ediyoruz. Bu yöntem, jel elektroforezi18 kullanarak RNA'yı moleküler ağırlığa göre çözer. Bu prosedür, birden fazla koşul veya numune içeren deneyler için daha iyi standardizasyon ve nicelikler sağlar. Ayrıca, rRNA, mRNA veya mikroRNA olsun, farklı RNA'lar için spesifik m6 A modifikasyon bilgisi sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: 6 A level rRNA, mRNA ve diğer küçük RNA'lar dahil toplam RNA m. Ribozomal RNA bol M 6 A değişiklikleri, 6 A seviyesi bu gerçeği dikkate almak gerekir m ölçümünü beri.

1. RNA İzolasyon

  1. (Kağıt havlu üzerine püskürtülen) ribonükleaz dekontaminasyon solüsyonu kullanarak, pipet ve laboratuar tezgah yüzeyleri silin. Islak kağıt nükleaz içermeyen su ile havlu ve tekrar pipet ve laboratuvar tezgah yüzeyleri silin.
  2. RNA Ekstraksiyonu
    1. Toplam RNA İzolasyon
      1. Bir kafa üstü karıştırıcı kullanılarak, doku, 50-100 mg ya da 4 ° C 'de muhafaza RNA izolasyon çözeltisi 1 mL 5-10 x 10 6 hücre homojenleştirin.
        Not: fazla doku (100-150 mg), çünkü burada daha düşük RNA konsantrasyonların farelerden adipoz doku örnekleri için gerekli olabilir. Örnekler fare kalp, karaciğer, iskelet kası, akciğer, beyin kaynaklı ve makrofajlar, daha önce 4 kullanılmıştır.
      2. İçindeOda sıcaklığında 5 dakika boyunca numune homojenatları cubate.
      3. Örnek homojenat 1 ml başına 1-bromo-3-kloropropan (BCP) 100 mcL ekleyin. 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır tüpleri ve üretici talimatlarına 24'e göre, toplam RNA izole etmek için devam edin.
    2. İzole edilmiş toplam RNA'dan poliadenile mRNA Saflaştırma
      1. olarak temin edilebilen kitler veya protokoller kullanılarak poliadenile edilmiş mRNA'nın arındırın.
        1. Aşağıdaki çözeltinin her yeniden askıya iyice çalkalanır: 2x bağlama çözeltisi, oligo (dT) polistiren boncuklar ve yıkama solüsyonu. oligo (dT) kullanılmadan önce oda sıcaklığına getirin boncuk emin olun.
        2. bir ısıtma bloğu içinde 70 ° C'de bir boru ve ısıya hazırlık başına elüsyon çözeltisi 120 uL aktarın.
        3. Bir mikrosantrifüj tüpe toplam RNA 500 mg kadar pipetle. nükleaz içermeyen su ile 250 mcL ses seviyesini ayarlamak.
        4. toplam RNA 2x bağlayıcı çözeltisi 250 uL ekleyin böylecedökülmesinden ve vorteks kısaca içeriğini karıştırmak için.
        5. oligo 15 mcL ekleyin (dT) boncuk ve vorteks iyice karıştırın.
        6. 3 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe karışımı.
        7. Isıtma bloğu numuneyi çıkarın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir.
        8. 2 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin.
        9. Dikkatle arkasında yaklaşık 50 uL bırakarak süpernatant kaldırmak.
        10. pipetleme pelet yeniden askıya yıkama solüsyonu 500 mcL ekleyin.
        11. Bir spin filtre / toplama tüpü kümesine süspansiyonu pipetle.
        12. 2 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin. toplama tüpünden sütunu kaldırmak ve flow-through atın. toplama tüpüne sütun dönün.
        13. Spin filtre üzerine yıkama solüsyonu Pipet 500 uL.
        14. 15.000 x santrifüj 2 dakika boyunca örn.
        15. taze toplama tüpüne sıkma filtre aktarın.
        16. Elüsyon çözeltisi pipetle 50 uL ısıtıldı70 ° C'ye kadar eğirme filtrenin merkezi üzerine.
        17. 70 ° C'de 2-5 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin.
        18. Spin filtrenin merkezi üzerine 70 ° C'ye kadar ısıtıldı elüsyon çözeltisi ilave 50 uL pipetle.
        19. Tekrarlayın Adım 1.2.2.1.18.
      2. 100 ug / mL glikojen, 3 M sodyum asetat tamponu (pH 5.2), ve mutlak etanolün 2.5 hacim 0.1 hacim. -80 ° C de bir gece hızlandırabilir.
      3. 4 ° C'de 25 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın.
      4. % 75 etanol içindeki 1 ml pelet yıkayın. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin. Dikkatlice etanol çıkarın.
      5. 3-5 dakika boyunca hava içinde kurutulur.
      6. pelet çözmek için nükleaz içermeyen su 10 uL ekleyin.
      7. -70 ° C'de saklayın.
  3. RNA Yeterlilik ve miktarının belirlenmesi
    1. Bir spektrofotometre kullanılarak, Notl RNA konsantrasyonunu belirlemek260 nm ve 280 nm 'de absorbans ng. A 260 / A 280 oranı 1.8-2.2 olmalıdır.
    2. % 0.8 agaroz jel elektroforezi 25 kullanılarak RNA örnek kalitesini kontrol edin.
      NOT: sağlam ökaryotik toplam RNA yoğun 28S ve 18S rRNA bantları göstermesi gerekir. İyi bir RNA preparasyonu için 18S rRNA bandı şiddeti ile 28S oranı ~ 2.

2. Jel Elektroforez ve Transferi

NOT: Tampon hazırlama protokolleri Tablo 1'de verilmiştir.

  1. Formaldehid jel hazırlanması (% 1)
    1. diethylpyrocarbonate (DEPC) su ile tüm elektroforez cihazları durulayın.
    2. Tamamen bir mikrodalga fırınında DEPC su 215 mL agaroz 2.5 g eritin.
    3. 10x 3- (N-morfolino) propansülfonik asit (MOPS), 12.5 ml tampon ve% 37 formaldehid 22.5 ml.
    4. 1.5 mm kalınlığında tarak ile elektroforez cihazının içine dökün.
    5. t kabarcıkları ortadan kaldırmak veya itmekTemiz bir tarak ile jel kenarlarına hem.
    6. Jel, oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin.
  2. Örnek hazırlama
    1. örnek tamponu toplam RNA 1-10 ug ve 11.3 uL karıştırın.
    2. örnek tampon 11.3 uL RNA işaretleyici (1 mcg / ml) 2 ug karıştırın.
    3. 16 uL bir toplam hacimde 2.2.1 ve 2.2.2 örnekler nükleaz içermeyen su ilave edilir.
    4. 5 dakika boyunca 60 ° C de ısı ve daha sonra buzda.
    5. buz üzerinde / ul etidyum bromür 0.1 ug içeren izleme boya 4 uL ile 2.2.3 den örnek 16 mcL karıştırın.
      DİKKAT: Solunduğunda Ethidium bromür muhtemelen teratojenik ve toksiktir. etidyum bromür güvenlik formu okuyun.
  3. Elektroforez
    1. 10x MOPS 200 mL 1x MOPS çalışan tampon yapmak için GKD 2 O 1.800 ml tampon ekleyin.
    2. jel kuyu durulayın 1x MOPS çalışan tampon kullanın.
    3. Ön-run tO 5 dakika boyunca 20 V jel.
    4. Jelin kuyuların içine RNA örnekleri yükleyin.
    5. Işık maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün. (Gece ​​boyunca) yaklaşık 17 saat süre ile 35 V çalıştır
    6. Incelemek ve bir UV ışığı altında jel fotoğrafını.
  4. transfer
    1. Kullanılmayan kısmı kaldırmak için jel kesti.
    2. 10x SSC tamponu (20x SSC tamponu 250 mL DEPC su 250 mL) 500 mL hazırlayın.
    3. 50 rpm'de sallama ile 20 dakika için 10 x SSC tamponu ile iki kere jel yıkayın.
    4. Transfer tepsi (Şekil 1) transfer tamponu emen bir fitil kağıt, olarak hizmet verecek kadar büyük 1 filtre kağıdı sayfasını kesin.
    5. jel aynı boyutta filtre kağıdı 4 parça kesin.
    6. jel aynı boyuta pozitif yüklü bir naylon zar 1 sayfa kesin.
    7. jel üzerinde çentik ve, uygun yönlenmesinin sağlanması için bir işaretleyici olarak membran işaretleyin.
    8. 15 dakika boyunca 2 x SSC tamponu membran bekletin.
    9. 500 ml o dökünf 10x SSC transferi tepsisine tampon.
    10. cam levha üzerinde büyük filtre kağıdı sayfasını Lay ve transfer tamponu ile filtre kağıdı ıslatın.
    11. Bir pipet yardımıyla kabarcıkları dışarı rulo.
    12. transfer tamponuna önceden kesilmiş filtre kağıdı 2 adet ıslatın ve adım 2.4.5 filtre kağıdının ortasına koyun. herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak.
    13. aşağı filtre kağıdı üzerinde jel üst yan yattı.
    14. jel üstünde membran yerleştirin. jel ve membran çentikler aynı hizaya getirin.
    15. membran üstüne önceden kesilmiş filtre kağıdı 2 adet koyun ve transfer tamponu ile filtre kağıdı ıslatın.
    16. tabakalar arasındaki herhangi bir baloncukları giderin.
    17. havlu sadece jel ve zarından geçen tampon kadar emmek emin olmak için jel etrafında plastik wrap uygulayın.
    18. Filtre kağıdı üzerine kağıt havlu Stack.
    19. havlunun üstünde bir büyük boy cam plaka koyun.
    20. yığının üstüne bir ağırlık yerleştirin.
    21. RNA membrana jelden transfer etmek için gece boyunca devam edin.

N 6 -methyladenosine 3. Algılama

  1. membran Çapraz bağlama
    1. 2x SSC tamponu nemli membran tutun.
    2. UV çapraz bağlayıcı içine 10x SSC tamponu ile dalmış filtre kağıdı 2 yaprak yerleştirin.
    3. RNA adsorbe tarafı yukarı bakacak şekilde, filtre kağıdının üstüne membran yerleştirin.
    4. "Autocrosslink modu" (120,000 μJ) seçin ve ışınlama başlatmak için "Başlat" düğmesine basın.
    5. membrana jelden RNA transferi onaylamak için UV jel görüntü alıcı ile membran ve jel inceleyin.
  2. Bağışıklık
    1. 1 saat boyunca oda sıcaklığında Tween 20 (TBST) tampon Tris-tamponlu tuzlu su içinde% 5 yağsız süt içinde membran engeller.
    2. 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez yıkayın.
    3. Gecede m 6 A (membran inkübe K 6 -methyladenosine) antikor çözeltisi (1: 1000,% 5 yağsız süt TBST tamponu) 4 ° C'de ilave edildi.
    4. 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez membran yıkayın.
    5. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 5 yağsız süt TBST tamponu içinde 2.000: 1) HRP ile konjüge edilmiş eşek anti-tavşan antikoru çözelti içinde membran inkübe edin.
    6. 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez membran yıkayın.
    7. Gelişmiş kemiluminesans substrat (membran cm2 başına 0.125 ml) uygulayın.
    8. Imalatçının talimatlarına 26 göre bir dijital kamera optimum ayarlarla kemilüminesans yakalar.
  3. m 6 A Niceleme
    1. ImageJ yazılımı kullanarak göreceli m 6 A kemilüminesan yoğunluğunu ölçmek.
      1. ImageJ yazılım menüsü altında ilgili dosyayı açmak için "Dosya" seçeneğini seçin.
      2. ImageJ gelen "Dikdörtgen" aracını seçin ve etrafında bir çerçeve çizinsinyaller.
      3. Ribozomal RNA deneyleri odağı değilse, hesaplama için 18S ve 28S ribozomal RNA m 6 A bantları kaçının.
      4. Seçilen şeritli onaylamak için "Command" ve "1" i tıklayın.
      5. Basın "Command" ve "3" Seçilen komplo göstermek için.
      6. "Düz" aracını tıklayın ve parçalı alanı ayırmak için çizgiler çizmek.
      7. ölçümleri kaydetmek için "Wand" aracını tıklayın.
      8. veri verir.
      9. Etidyum bromür boyama gelen 18S ribozomal RNA bant ile m 6 A düzeylerini normale.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normal ışık-karanlık sirkadiyen fazda 14 gün sonra, vahşi tip farelerde sürekli karanlıkta yerleştirildi. karaciğer RNA'lar 4 saat aralıklarla numune ve modifiye Northern blot ile incelenmiştir. RRNA, mRNA ve küçük RNA'ların metilasyonu açık (Şekil 2) tespit edilmiştir. Farklı sirkadiyen saatler arasında karşılaştırma (BT) doğru 18S rRNA standardı ile hesaplanabilir. RRNA, mRNA ve küçük RNA'lar m 6 A düzeylerinin sağlam sirkadiyen salınım oldu.

rRNA tarafından Sunulan girişimi önlemek için, poliadenile edilmiş RNA'lar aşama 1.2.2 gibi saflaştırılabilir. Saflaştırmadan sonra, rRNA, büyük ölçüde diğer RNA'lar (Şekil 3) daha iyi bir görünüm için izin ortadan kaldırılabilir.

figure-results-1
g> Şekil 1: leke aktarma ünitesi montajı. zara RNA kurutma için kılcal aktarım ünitesi gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: C57BL / 6J fareler m 6 A düzeyleri günlük ritim. Bu rakam, m 6 vahşi tip farelerin karaciğer toplam RNA'nın bir leke 4 saat aralıklarla normal ışık-karanlık fazın 14 gün sonra koyu, koyu fazının ilk gününde kurban gösterir. Miktar m 6 18S ve 28S rRNA arasındaki görüntü yoğunluk farkı kullanılarak yapıldı. M 6 A bolluk altındaki formaldehit jelden 18S rRNA bandına normalize edildi.et = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: ya rRNA olmadan m 6 A lekeler. Örnek m toplam RNA ve vahşi tip fare karaciğerinde poliadenile RNA 6 bir blotlar gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1: Tampon ve çözümleri.

1 10x MOPS tampon (pH 7.0, ışıktan koruma)
MOPS 41.85 g 0.2 M
Sodyum asetat 4.1 g 0.05 M
EDTA, disodyum tuzu 3.7 g 0.01 M
DEPC su
Genel Toplam 1 L
oda sıcaklığında karışmaya
2 20x SSC tamponu (pH 7.0)
Sodyum klorit 175.3 g 3 M
trisodyum sitrat 88.3 g 0.3 M
DEPC su
Genel Toplam 1 L
Oda sıcaklığında karıştırdıktan sonra otoklav
3 takip Boya
10x MOPS tamponu 500 ul 1x
Ficoll 400 0.75 g % 15
mavi Bromophenol 0.01 g % 0.2
Ksilen siyanol 0.01 g % 0.2
DEPC su
Genel Toplam 5 mL
-20 ° C'de de
4 DEPC su
1'den oranı sulandırmak: DEPC ve 1,000 GKD 2 O
Gece boyunca oda sıcaklığında karıştırdıktan sonra otoklav
5 Örnek tamponu (ışıktan korumak)
10x MOPS tamponu 200 ul
% 37 formaldehid 270 ul
formamid 660 ul
-20 ° C'de de

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA modifikasyonlarının hücresel fonksiyon ve fizyolojide önemli rolleri vardır. Bu modifikasyonların düzenlenmesi, işlevi ve homeostazı ile ilgili mevcut anlayış hala araştırılmakta ve genişletilmektedir8. Bu nedenle, RNA modifikasyonlarını değerlendirmek için kesin ve altın standart bir yönteme ihtiyaç vardır. Modifiye edilmiş kuzey lekeleme yöntemi, RNA modifikasyonlarının kesin olarak ölçülmesini ve çeşitli RNA'lardaki modifikasyonların net bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Yöntem en az 3 gün gerektirse de standardize edilebilir ve çeşitli deneysel tasarımlarda kullanılabilir. Ayrıca, farklı antikorlarla, farklı RNA modifikasyonlarını tespit edebilir27.

RNA modifikasyonlarını analiz ederken farklı RNA'ları ayırmak önemlidir. Ribozomal RNA, toplam RNA28,29 miktarının büyük bir bölümünü oluşturur. RNA modifikasyonlarının yalnızca toplam RNA'da analiz edilmesinden elde edilen sonuçlar, çoğunlukla rRNA'daki değişiklikleri temsil edecektir. Metilasyon ve rRNA'nın bu tür diğer modifikasyonları, diğer RNA'lardaki değişiklikleri potansiyel olarak maskeleyebilir. Jel ayırma prosedürü ile mRNA ve diğer küçük RNA'ların modifikasyonları daha doğru bir şekilde analiz edilebilir.

m6A immünopresipitasyon ve dizileme ile transkriptom çapında haritalama, her bir RNA22 tipinin modifikasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Spesifik RNA'lar hakkında bilgi ve yaklaşık 80-120 bp'lik bir çözünürlük sağlar. m6A-Seq, farklı deneysel koşullar arasındaki modifikasyonları karşılaştırabilse de, bu tür deneyler için uygun standartların ve kontrollerin seçimi zordur18. İmmünopresipitasyonun çoğaltılması zordur ve genellikle tekrarlar arasında önemli farklılıklar gösterir. Ayrıca, m6A-Seq, immünopresipitasyon ve dizileme30'dan önce RNA örneklerinin parçalanmasını gerektirir. Parçalanma süreci, orijinal RNA modifikasyonları üzerinde potansiyel olarak aşırı etkilere neden olabilir. Deney, belirli genin bilgisine ihtiyaç duymuyorsa ancak karşılaştırma için farklı koşullar gerektiriyorsa, mevcut yöntem, çeşitli deney düzenekleri için daha iyi görselleştirme ve kontrol sağlar.

RNA'nın modifikasyonu, transkripsiyonel kontrolün düzenlenmesinde önemli bir adımdır31. Bununla birlikte, çeşitli fizyolojik alemler altında çeşitli RNA modifikasyonlarının homeostazı ve düzenleyici mekanizmaları hala belirsizdir. Mevcut modifiye edilmiş kuzey lekeleme yöntemi kullanılarak, farklı RNA modifikasyonları ölçülebilir ve karşılaştırılabilir. Ayrıca, RNA modifikasyonlarının değişiklikleri ve düzenlemeleri daha ayrıntılı olarak incelenebilir. Gelecekte, hem klasik kuzey lekeleme hem de modifiye kuzey lekeleme protokollerinden elde edilen deneysel verileri birleştirmek ve RNA biyolojisi hakkında daha fazla bilgi sağlamak da mümkün olabilir.

Modifiye northern blotlama protokolünün başarısını belirleyen en önemli faktör, RNA örneğinin bütünlüğüdür. Bir miktar bozunmaya sahip RNA'lar, iyi klasik kuzey lekeleme sonuçları verebilir, ancak bu, değiştirilmiş kuzey lekeleme sonuçları üzerinde potansiyel olarak önemli bir etkiye sahip olabilir. RNA'nın farklı dokulardaki veya hücre dizilerindeki modifikasyonları da önemli ölçüde değişebilir. Son deneyleri gerçekleştirmeden önce farklı dokular için uygun RNA numune yüklerini test etmek önemlidir.

Kurutma prosedürleri geleneksel olarak Dr. Southern ve farklı coğrafi yönlerden sonra adlandırıldığından, mevcut teknik için "kuzeydoğu" kurutma adını öneriyoruz.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.W., Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüsü (NHRI-EX101-9925SC), Ulusal Bilim Konseyi (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) ve Chang Gung Memorial Hastanesi'nden (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 ve CMRPG3C1763) destek aldı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RNaseZap çözümüAmbionAM9782Protokolü 1.1
TRI Reaktif çözeltisiAmbionAM9738Protokolü 1.2.1.1
1-Bromo-3-kloropropan (BCP)SigmaB9673Protokolü 1.2.1.3
EtanolJTbaker8006Protokolü 1.2.1.3
İzopropanolSigmaI9516Protokolü 1.2.1.3
GenElute mRNA MiniprepKiti SigmaMRN70Protokolü 1.2.2.1
GlikojenAmbionAM9510Protokolü 1.2.2.2
Sodyum asetatFluka71183Protokolü 1.2.2.2
Nükleaz içermeyen suAmbionAM9930Protokolü 1.2.2.6
DEPCSigmaD5758Protokolü 2.1.1
AgaroseJT BakerA426Protokolü 2.1.2
MOPSSigmaM1254Protokolü 2.1.3
%37 formaldehit ÇözeltisiSigmaF8775Protokolü 2.1.3
EDTA, Disodyum TuzuJT Baker8993Protokolü 2.1.3 10x MOPS tampon
formamidSigmaF7503Protokolü 2.2.1
RNA Milenyum İşaretleyiciAmbionAM7150Protokol 2.2.2
Etidyum BromürAmrescoX328Protokol 2.2.5
Ficoll PM400GE Sağlık17-0300-10Protokol 2.2.5 izleme boyası
Bromofenol mavisiSigma114391Protokol 2.2.5 izleme boyası
Ksilen Siyanol FFSigmaX4126Protokolü 2.2.5 izleme boyası
Sodyum klorür dihidratJT Baker3624Protokolü 2.4.2 20x SSC tamponu
Trisodyum sitratSigmaS1804Protokolü 2.4.2 20x SSC tamponu
Hybond Kurutma KağıdıGE Sağlık RPN6101MProtokolü 2.4.4
GE Hybond-N+ membranıGE Sağlık RPN303BProtokolü 2.4.6
Stratalinker UV Çapraz Bağlayıcı 2400Stratagene400075Protokolü 3.1.2
Jel Yakalayıcı 1500ANTTeknolojisi Jel Yakalayıcı 1500Protokolü 3.1.5
Anti-m6< / sup>A (N6< / sup>-metiladenozin)Sinaptik Sistemler202003Protokolü 3.2.3
Amersham ECL Anti-Tavşan IgG, HRP bağlantılı tüm AbGE HealthcareNA934Protokolü 3.2.5
ChemiDoc MP SistemiBIO-RAD1708280Protokolü 3.2.8

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127(2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438(2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27(2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445(2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874(2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA EpigeneticsModified Northern BlottingRNA IsolationAgarose Gel ElectrophoresisUV Cross Linkingm6A Antibody DetectionChemiluminescence QuantificationMouse Tissue AnalysisCircadian Rhythm Research

İlgili makaleler