Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

Summary

Bu makale, insan hücrelerinin lizatlarından elde edilen dinnamin benzeri GTPase MxA proteininin oligomerik durumunu, denatüre olmayan PAGE ile western blot analizinin bir kombinasyonunu kullanarak değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokolü açıklamaktadır.

Abstract

Oligomerik komplekslerin oluşumu, birçok proteinin uygun yapısı ve işlevi için çok önemli bir ön koşuldur. İnterferon ile indüklenen antiviral efektör protein MxA, birçok virüse karşı geniş bir antiviral aktivite gösterir. MxA, dinamin benzeri bir GTPazdır ve daha yüksek dereceli oligomerik yapılar oluşturma kapasitesine sahiptir. Bununla birlikte, MxA'nın antiviral aktivitesi için oligomerizasyonunun gerekli olup olmadığı bir tartışma konusudur. Burada, Western blot analizi ile kombinasyon halinde denatüre olmayan poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile insan hücre hatlarının sitoplazmik fraksiyonunda endojen veya ektopik olarak eksprese edilen MxA'nın oligomerik durumunu değerlendirmek için basit bir protokol açıklıyoruz. Protokolün kritik bir adımı, özellikle MxA gibi hücresel zarlarla ilişkili proteinlerin, enzimatik aktivitesine müdahale etmeden toplanmasını ve/veya çökelmesini önlemek için deterjan seçimidir. Protokolün bir diğer önemli yönü, proteinin yapay etkileşimlerini önlemek için sistein kalıntılarının serbest tiyol gruplarının iyodoasetamid tarafından geri dönüşümsüz olarak korunmasıdır. Bu protokol, MxA'nın oligomerik durumunun basit bir değerlendirmesi için uygundur ve ayrıca MxA arayüz mutantlarının antiviral aktivitesinin ilgili oligomerik durumları ile doğrudan bir korelasyonuna izin verir.

Introduction

Bir proteinin kuaterner yapı, birçok hücresel süreçlerde önemli bir rol oynar. Sinyal yolları, gen ifadesi ve enzim devreye alma / devreden tüm protein kompleksleri ^1-4 doğru montaj güveniyor. Ayrıca, homo veya hetero-oligomerizasyonu olarak da bilinen bu proses geri dönüşü olmayan kovalent ya da geri dönüşümlü, elektrostatik ve hidrofobik protein-protein etkileşimleri kaynaklanmaktadır. Oligomerizasyon genom boyutunu artırmadan farklı hücresel süreçleri çeşitlendirmektedir, ancak proteinler denatürasyon ve yıkımı ⁵ karşı daha dirençli kararlı kompleksler inşa etmek için de bir strateji sağlar sadece. oligomerizasyonu bozukluklar protein fonksiyonu üzerinde bir etkisi vardır ve hastalığın gelişmesine yol açar. Örneğin, enzim, fenilalanin hidroksilaz tetrameric kompleks oluşturur. Protein kompleksi içindeki bazı mutasyonlar tetramer oluşumu zayıflatmak ve hastalık fenilketonüri ⁶ yol açabilir.

insan MxA proteini anti-viral, çeşitli RNA karşı geniş bir anti-viral aktivitesi uygulayıcı efektör protein hem de DNA virüslerini ⁷ indüklenen bir interferon (IFN) 'dir. Bu Dynamin-gibi büyük GTPases üst ailesine ait olan ve in vitro ⁸ büyük oligomerik yapıları oluşturma kapasitesine sahiptir. Oligomerizasyonu, hızlı bozulmaya ^9,10 arasında mxa korumak için önerilmiştir. Birçok araştırma grubu tarafından yoğun çabalarına rağmen, eylem moleküler mekanizması büyük ölçüde belirsiz kalır ve antiviral işlevi için mxa oligomerizasyon devletin rolü tartışma ^9,11,12 altındadır. Bu bağlamda, Gao ve ark MxA büyük halka benzeri oligomerik yapılarının ¹¹ şeklinde viral Nükleoproteinlerin ile etkileşerek antiviral aktivite sergiler bir model önerdi. Ancak, son zamanlarda biz MxA dimerleri antivirütik aktivite sergilerler ve grip A virüsü ¹² nükleoprotein ile etkileşim olduğu gösterilmiştir. Bmxa kristal yapısına ased Gao ve çalışma arkadaşları, in vitro olarak oligomerizasyonu ve antiviral fonksiyonu ^11,13 için kritik olan arayüz bölgelerde çeşitli amino asit kalıntıları tespit edilmiştir. Bu nedenle, anti-viral aktivite sergiler mxa oligomerik çizen aydınlatmak üzere, hızla endojen MxA IFNa uyarıldıktan sonra ifade hem de insan hücrelerinde ifade edilen bir MxA arayüz mutantlarının oligmeric durumunu belirlemek için basit bir protokol için çalışmıştır.

Gibi yaygın bölünmüş Yeşil Floresan Protein olarak proteinler arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılan birçok teknik olmasına rağmen (split-GFP) tamamlama deneyi ^14, yüzey plazmon rezonans ¹⁵ ve Förster rezonans enerji transferi (FRET) ^16, onlar vermeyin bir oligomerik bir protein kompleksinin tam stokiyometri bilgiler. bu özel yanının araştırılması için teknikler gibiçok açılı bir ışık saçılım (MALS) ¹⁷ ve analitik ultrasantrifügasyon ¹⁸ çok kullanışlıdır. Genellikle, bu yöntemler kullanılarak analiz proteinler saflaştırılmış proteinlerdir. Oligomerleştirme işlemleriyle, diğer hücresel faktörlere bağlı olabilir. Bu faktörler bilinmiyorsa, analiz çok daha zordur. Ayrıca, bazı proteinler E. ifade etmek zordur E. coli ve saflaştırılması için. Bu nedenle, bu yöntemler hücresel ortamda protein oligomerizasyon analiz için en uygun seçenek değildir. Buna ek olarak, bu teknikler hazır olmayan pahalı aletleri gerektirir.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), boyut dışlama kromatografisi ya da geleneksel sodyum dodesil sülfat (SDS) sayfalık, ardından kimyasal çapraz bağlama hücre lizatları ^2,19,20 gelen oligomerlerin oluşma özellikleri için yararlı araçlardır. Bu yöntemler özel ekipman gerektirmez ve kolayca pe olabilirStandart bir laboratuarda rformed. Başlangıçta değişmez spesifik olmayan birleşimine ve mxa çökelmesine yol çeşitli kimyasal çapraz bağlama protokolleri değerlendirildi. Bu nedenle, önümüzdeki olmayan denatüre SAYFA protokolleri test etti. olmayan denatüre SAYFA SDS kullanımını hariç olarak, proteinlerin göç kendi ana şarj bağlıdır. Mavi yerel PAGE SDS benzer bir negatif yük, proteinleri yüklemek için Coomassie parlak mavisi G250 kullanır, ancak protein ²¹ denatüre etmez. Ne yazık ki, yüksek tuzlar ve genellikle lizis tampon içerdiği iki değerlikli katyonlar (örneğin, Mg ^{+ 2)} varlığında, parlak mavi çökeltileri coomassie. kullanılan tamponlar bağlı olarak, oligomerik protein kompleksi üzerinde bir etkiye sahip olabilir adımların daha fazla optimizasyon yapmadan numuneyi analiz etmek zor olabilir.

Burada oligomerizasyonuna belirlemek için, daha önce yayınlanan bir yöntem ²² dayalı basit bir protokol mevcutdenatüre PAGE kullanılarak hücre lizatları elde edilen insan MxA proteini.

Protocol

NOT: Bu protokol daha önce yayınlanmış denatüre PAGE protokolü ¹² dayanır. Bu çalışmada, bir MxA proteininin oligomerik durumu endojen mxa ifade mxa aşırı ifade Vero hücreleri ya da IFN-α-uyarılmış A549 hücreleri kullanılarak tayin edilmiştir. Aşağıda açıklanan protokol mxa ek olarak herhangi bir protein oligomerik durumunu analiz etmek için kullanılabilir. Ancak, daha fazla optimizasyon gerekli olabilir.

Denatüre edici olmayan PAGE için hücre lizatının hazırlanması 1.

Not: her iki Vero ve A549 hücrelerinde insan MxA proteininin oligomerik durumunu analiz etmek için, 1.0 x 10 ⁶ hücre hasat edilmiştir. hücre tipi veya analiz etmek için protein bolluğu ile ilgili olarak, hücre sayısı ayarlanmalıdır. En kısa ışığa duyarlı iyodoasetamid eklendiğinde, ışığa maruz kalmaktan lizis tamponu korumak için de önemlidir.

1. Kuyu başına Tohum 0,3 x 10 ⁶ A549 veya Vero hücrelerinde6 iyi yemekleri. Oyuk başına 2 ml büyüme ortamı içinde hücre tutulur (bakınız Tablo 1). Bir hücre kültür inkübatörü içinde bir gece boyunca inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 _CO2).
2. fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 1 ml ile yıkanır hücreleri hasat ve 0.5 ml 0.25% tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA), oda sıcaklığında yaklaşık olarak 5 dakika boyunca 1 x çözeltisi ilave edilerek çıkarın.
3. En kısa sürede hücreler çanak ayırmak gibi 0.5 ml besi ekleyin ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
4. iyi bir 2 ml tüp içine her hücreleri aktarın ve bir masa üstü santrifüj (5000 xg, 4 ° C, 5 dk) kullanarak onları pelet.
5. Dikkatle hücre pelletini bozmadan pipetleme süpernatant kaldırmak.
6. dikkatle yukarı ve aşağı hücre süspansiyonu pipetle 1 ml buz gibi soğuk PBS ile hücreleri yıkayın.
7. bir masa üstü santrifüjde Pelet hücreleri (5,000 xg, 4 ° C, 5 dakika).
8. Dikkatle wi pipetleme süpernatant kaldırmakHücre topaklarını ayırma thout.
9. Yukarı ve aşağı pipetleme ve buz koymak tarafından 200 ul buz gibi soğuk lizis tamponu (bakınız Tablo 1) yeniden süspanse hücreleri.
10. Hemen sonra, teneke folyo kullanarak ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir tüpler kaplayarak ışıktan lizat korur.
    Not: serbest tiol gruplarının korunması geri çevrilemez olduğu, buz üzerinde 30 dakika süre ile inkübe edildikten sonra, artık ışığa maruz kalmaktan lizat korumak için esastır.
11. önceden soğutulmuş bir masa üstü santrifüj (13,000 x g, 4 ° C, 20 dakika) içinde santrifüjleme ile hücre debrisini uzaklaştırmak.
12. Santrifüj aşaması esnasında, 20 dakika boyunca 4 ° C 'de soğuk bir odada, diyaliz tampon maddesi (Tablo 1) diyaliz sütun dengelenmesi. 10.000 kesilmiş bir moleküler ağırlığa sahip bir sütun kullanarak.
    1. Bir şamandıra şamandıra sütunlar takın ve diyaliz tamponu ile dolu bir beher içine koydu. hafif karıştırma sağlamak için, bir manyetik karıştırıcı kullanın. membran dokunmayın.
       NOT: Dialyssütun satın alınabilir veya Fiala ve çalışma arkadaşları ¹⁹ tarafından tarif edilen protokole göre 1.5 ml tüpler hazırlanabilir edilir.
13. diyaliz tamponu ve şamandıra şamandıra sütunları çıkarın. membran dokunmadan pipetleme hazırlanmış diyaliz sütuna temizlenir lizatları aktarın. Bir şamandıra şamandıra sütunlar takın ve diyaliz tamponu ile dolu beher içine geri koyun.
14. Dikkatli bir şekilde manyetik bir karıştırıcı kullanılarak karıştırılarak, 4 ° C'de en az 4 saat (ya da tercihen bir gece) buz soğukluğunda diyaliz tampon (Tablo 1) ihtiva eden bir beher içinde lizat dialyze. 200 ul lizat için en az 100 mi diyaliz tampon kullanın.
15. 1.5 ml tüp içine diyaliz örnek aktarın. bir masa üstü santrifüj (13,000 x g, 4 ° C, 20 dakika) içinde santrifüjleme ile çökeltileri uzaklaştırmak. kompleksler hemen diyalizden sonra protokolü (bölüm 2) ile devam oligomerik protein ayrışmasını önlemek için. donma yokHazırlanan lizatları.

2. Elektroforez

Not: bazı değişiklikler ²² daha önce anlatıldığı gibi Elektroforez uygulandı. Aşağıda tarif edilen protokol, ön döküm gradyan jelleri (% 4-15 gradyan) kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, jeller laboratuarda hazırlanabilir. SDS oligomerik protein kompleksleri ayrışmasını önlemek için gibi herhangi bir denatüre etme maddesini dahil etmek çok önemlidir. elektroforez Zaman insan MxA proteinin farklı oligomerik devletler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu oligomerik kompleksinin büyüklüğü gibi karmaşık analiz elde edilebilir gerekiyordu ayırma aralığına bağlı olarak, diğer proteinler için değişebilir. Bu nedenle, elektroforez optimal zaman deneysel olarak tespit edilmelidir. oligomerlerin optimal çözünürlük analiz edilmesi için akım 25 mA geçmemelidir.

1. Jel odasında sigara denatüre SAYFA jel birleştirin. t doldurunÖnceden soğutulmuş çalışan tamponu (Tablo 1) de, iç ve dış oda.
2. 4 ° C'de soğuk bir odada 15 dakika boyunca jel başına 25 mA önceden soğutulmuş çalışan tampon maddesi ile jel ön çalıştırın.
3. 4x numune tamponu, 5 ul (Tablo 1), yukarıda hazırlanan lizatlar 15 ul karıştırın. örnek kaynatmayın.
4. 15 örnek ul ve jel üzerinde seçim doğal protein standardı yükleyin. 4 ° C'de soğuk bir odada 4 saat 25 mA'da jel üzerinde çalıştırıldı.
   Not: yarı-nicel analiz için, bir protein miktar protokol (örneğin, bir Bradford protein tahlili ²³⁾ şerit başına toplam protein eşit miktarlarda yükleme sağlamak için gerçekleştirilebilir.

3. Western Blot

NOT: Aşağıda açıklanan ıslak western blot sistemi protokolüdür. Herhangi bir kurutma membran kullanılabilir. tampon ile kurutma bölgesi dengeleme önce% 100 metanol poliviniliden florür (PVDF) zarlara etkinleştirmefer. Yarı-kuru western blot alternatif olarak kullanılabilir, ancak büyük oligomerik kompleksleri için optimize edilmiş olması gerekir.

1. Jel sökün ve dikkatlice SDS tamponu (Tablo 1) içine aktarın.
2. hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
3. 2 süngerler, 4 selüloz filtre kağıdı çarşaf ve jel başına bir kurutma membran hazırlayın. Tampon (Tablo 1) blotting onları ıslatın.
4. 1 sünger, 2 selüloz filtre kağıdı levhalar, membran, jel, 2 selüloz filtre kağıdı yaprak, 1 sünger: (aşağıdan yukarıya) aşağıdaki gibi sandviç birleştirin.
5. lekeleme tankına sandviç koyun. Jel eksi kutup yüzleri ise membran artı kutbu karşı karşıya olduğundan emin olun.
6. Önceden soğutulmuş lekeleme tampon ile blot doldurun.
7. en iyi protein aktarımı sonucu, 4 ° C'de bir gece boyunca 90 mA'da kurutun.
8. sandviç sökün ve Ponç membran inkübe edilerek protein standardı görselleştirmekOda sıcaklığında 5 dakika boyunca eau çözüm.
9. açıkça protein standardı bantları görünceye kadar dikkatli deiyonize su ile Ponceau S yıkayarak membranın destain.
10. Bir kalem kullanarak protein standardı bantları işaretleyin.
    NOT: Artık Ponceau S immün engelleyebilir. Bunu önlemek için, membran deiyonize su ile 1 dakika ve daha sonra yıkama için 0.1 M NaOH içinde inkübe edilerek, daha boyası olabilir.
11. Blokaj tamponu ile membran bloke oda sıcaklığında en az 1 saat veya gece boyunca 4 ° C (Tablo 1 e bakınız).
12. Analiz edilecek proteine ​​karşı yöneltilmiş antikorlar kullanılarak imüno-boyama ile ilgili proteini (ler) görselleştirme.
    Not: tampon (Tablo 1) bloke 1000: insan MxA proteininin insan MX1 özgü tavşan poliklonal antikoru kullanılarak görselleştirilmiştir 1 seyreltilmiştir. antikor çözeltisi 4 ° C'de gece boyunca inkübe edildi. Seçenek olarak ise, monoklonal birnti-MxA antikoru (klon 143) ²⁴ (veriler gösterilmemiştir) kullanılabilir.

Results

Denatüre PAGE kullanılarak, insan vahşi tip bir MxA, dimerik arayüz mutantlan MxA (R640A) ve MxA (L617D) yanı sıra hücre lizatları ¹² monomerik arayüz mutant MxA (M527D) oligomerik durumunu analiz edilmiştir. Hücreler,% 1 oktilfenoksipolietoksietanoldür (NP-40) ve iyodoasetamid, protein çözünürlüğünü ve serbest tiol gruplarının korunmasını sağlamak için ihtiva eden bir tampon maddesi içinde lize edilmiştir (bakınız Şekil 1). Daha önce tarif edildiği gibi, bir tuzu ve küçük metabolitler diyali...

Discussion

Burada Western blot analizi ile, ardından denatüre PAGE ile memeli hücrelerinde ifade edilen proteinlerin oligomerik durum hızla belirlenmesini sağlayan basit bir yöntem tarif eder. Bu yaklaşımın en önemli avantajı, belirli bir proteinin oligomerik durumu önceden protein saflaştırma olmadan bütün hücre lizatları belirlenebilir olmasıdır. Bu oligomerize veya yardımcı faktörler ile birlikte kendi işlevini yerine proteinler için önemli olabilir. Buna ek olarak, proteinler, yerli durumunda hala ve daha da jelden ekstre için...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Üniteleri, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Diyaliz tamponunda ön denge (Gliserol çıkarılması istenirse) Fiala ve ark. 2011
4– % 15 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri, 10 kuyulu,	Bio-Rad	456-1083	Tampon sistemini ayarlamak için çalışma tamponunda önceden çalıştırma
cOmplete, Mini, EDTA içermeyen	Roche	11836170001	50 ml PBS başına 1 tablet
, pH 7.4  500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S çözeltisi	Sigma-Aldrich	P7170<	güçlü>TOKSİ eldiven giyin ve gözleri koruyun
NativeMark Lekesiz Protein Standardı  50 &mikro; l	Invitrogen	P / N 57030	yük 5 ve mikro; l/kuyu
A549 hücreleri	ATCC	ATCC CCL185	Büyüme ortamında büyür (bkz. Tablo 1)
Vero hücreleri	ATCC	ATCC CCL81	Büyüme ortamında büyür (bkz. Tablo 1)
anti-Mx1 antikoru	Novus Biologicals	H00004599_D01P	1: 1.000 seyreltmede kullanın
ECL Anti-tavşan IgG, Yaban turpu Peroksidaz bağlantılı tüm antikor ( eşek)	GE-Healthcare	NA934V	1:10.000 seyreltmede
%0,5 Tripsin-EDTA (1x)              Yaşam Teknolojileri	Thermo Fisher	15400-054
İyodoasetamid    5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stok  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Piruvat yaşam teknolojileri	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Kalem  Strep 100 x        100ml ve nbsp;                           yaşam teknolojileri	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Et Suyu, 100 ml        yaşam teknolojileri	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Fetal Sığır Serumu, Diyalizli, ABD Menşeili 500 ml Gibco Lot:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Selüloz filtre kağıdı	Bio-Rad	1703965
PVDF lekeleme ve membran	GE-Healthcare	10600022
Tris(hidroksimetil)aminometan	Biosolve	0020092391BS
sodyum florür (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA içermeyen	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS %10 çözelti	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glisin	Biosolve	0007132391BS
sodyum ortovanadat (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Gliserol	Sigma Aldrich	G7757
β-Gliserofosfat	Sigma Aldrich	G9422
Süt tozu	Migros/İsviçre
Metanol	Millipore	1.06009
sodyum klorit (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
magnezyum klorür (MgCl2)	Amresco	288
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
sodyum hidroksit (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045