Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Kloroplastlar, bitki hücrelerinde fotosentezden ve bir dizi başka metabolik süreçten sorumlu dinamik organellerdir. Kloroplasttan gelen sinyal yolları ayrıca bitki fizyolojisi ve gelişimi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve bitkinin çevresel strese, patojenlere ve hatta yaprak şekline^{karşı tepkilerini koordine eder 1-6}. Son zamanlarda, biyologlar kloroplast yapısının yeterince anlaşılmamış bir yönüne ilgi duymaya başladılar: stromuller, kloroplast^7'nin yüzeyinden uzanan çok ince stroma dolgulu tübüller.

Stromüllerin biyolojik işlevleri bilinmemektedir, ancak stromul frekansının çevresel uyaranlara yanıt olarak değiştiği^{bilinmektedir 7-9} ve stromuller organeller 6 arasında sinyal moleküllerini iletebilir^. Tüm plastid türleri (sadece yeşil, fotosentetik kloroplastlar değil, aynı zamanda berrak lökoplastlar, nişasta dolgulu amiloplastlar ve pigmentli kromoplastlar, birkaç plastid türünü adlandırmak için) stromules yapar ve stromules bugüne kadar incelenen tüm kara bitki türlerinde bulunur. Stromuller dinamik olarak uzayabilir ve geri çekilebilir, saniyeler içinde görünebilir veya kaybolabilir veya uzun süreler boyunca nispeten sabit kalabilirler. Stromule biyologlarının karşılaştığı en büyük engellerden biri, stromullerin genellikle önemli ölçüde farklı yöntemler, dokular ve türler kullanılarak incelenmesi ve stromule biyolojisi literatüründe karşılaştırmaları zorlaştırmasıdır. İleriye dönük olarak, stromulleri incelemek için kullanılan deneysel sistemlerin standart uygulamaları ve kapsamlı açıklamaları, kloroplast morfolojisinin bu her yerde bulunan özelliklerinin işlevini keşfetmek için kritik öneme sahip olacaktır.

Burada, Nicotiana benthamiana yapraklarının epidermal kloroplastlarında stromule oluşumunu görselleştirmek için yöntemler açıklanmaktadır. Mezofilde, kloroplastlar yoğun bir şekilde büyük, üç boyutlu hücrelere paketlenir, bu da stromullerin konfokal mikroskopi ile doğru ve hızlı bir şekilde görselleştirilmesini zorlaştırır. Buna karşılık, epidermal hücreler nispeten düzdür, daha az kloroplast içerir ve yaprağın yüzeyinde bulunur, bu da stromullerin kolay ve hızlı bir şekilde görselleştirilmesine izin verir. N. benthamiana bu deneyler için ideal bir model sistemdir, çünkü birçok bitki türünün aksine, N. benthamiana'nın epidermisindeki tüm hücreler kloroplast^{yapar 10}. Arabidopsis thaliana da dahil olmak üzere çoğu bitkinin epidermisinde, sadece stoma koruyucu hücrelerinde kloroplast bulunurken, diğer epidermal hücrelerde "lökoplastlar", berrak, nispeten amorf ve fotosentetik olmayan plastidler bulunur^9,11,12. Bu nedenle, bir A. thaliana epidermisinin tek bir görüş alanı, bir çift koruyucu hücrede yalnızca bir avuç kloroplast gösterebilirken, bir N. benthamiana epidermisinin görüş alanı düzinelerce hatta yüzlerce kloroplast içerecektir. Bununla birlikte, burada açıklanan yöntemlerin tümü, stromule biyolojisindeki diğer soruları araştırmak için değiştirilebilir; örneğin, A. thaliana^9'un lökoplast stromullerini incelemek için aynı yaklaşımı kullandık.

NOT: Bu protokol için, N. epidermis stromule frekansı tahlil odaklanmıştır benthamiana yaprak. FNRtp: EGFP ¹³ ve NRIP1: ⁶ Cerulean çeşitli stabil transjenik 35S _PRO dahil olmak üzere bu amaçla kullanılabileceğini oluşturulmuştur. Bu hatların her ikisi de, geniş bir şartlar aralığında altında yetiştirilen yaprak kloroplast stromada florofor sağlam ekspresyonunu göstermektedir. Seçenek olarak ise, bir kloroplast-hedefli flüoroforlar geçici N olarak ifade edilebilir benthamiana kullanarak Agrobacterium ¹³ dönüşümler. Agrobacterium infiltrasyon N. bazı bazal savunma yanıtları neden çünkü bu, transgenik çizgiler daha az ideal Agrobacterium ile benthamiana ve etkileşimler, potansiyel olarak, sonuçların yorumunu komplike, yaprak ¹⁴ stromule frekans değiştirebilir. Son olarak, in vitro stromule oluşumunu görselleştirmek için,aşağıda Bölüm 5'te tarif edildiği gibi kloroplast, genetik olarak kodlanmış florofor ya da floresan boya kullanılarak, herhangi bir bitki türünden elde edilebilir olabilir. ^9,15

Not:. Bitki yetiştirme için ayrıntılı yöntemler, daha önce tarif edilmiştir ¹⁶ Kısaca, N. büyümeye iyi drenaj sağlayan herhangi bir profesyonel toprak karışımı ile dolu 4 "tencere benthamiana bitkileri.. çimlenme için nemli bir ortam sağlamak için 10-14 gün için bir şeffaf plastik kubbe ile fidan Kapak 14- üreticinin talimatlarına herhangi bir standart gübre karışımı ekleyin günlük eski bitkiler. ~ 100 ľmol fotonlar m ^-2 sn ^-1 ışık yoğunluğu kullanarak, beyaz ışık altında bitkiler yetiştirin. Su bitkileri düzenli.

Görselleştirme için 1. Hazırlama Yaprak Örnekleri

NOT: doku hazırlanması stromule görüntülenmesi hemen önce yapılmalıdır böylece Stromule dinamikleri, ⁸ kişi yaralandı etkilenirkonfokal floresan mikroskop ile s. İdeal olarak, örnek bir tesisi çıkarıldıktan sonra 15 dakika ile görselleştirilmiştir edilmelidir.

1. çok keskin bir jilet kullanarak yaprak küçük bir bölümünü kesti. Her zaman tutarlılık için yaprak aynı bölgesini kullanın ve tüm deneylerde (adaxial veya eksen dışı) aynı yüzey görselleştirmek için emin olun.
2. Hemen yaprak bölümünü kestikten sonra, su dolu bir 5 ml iğnesiz şırınga yaprak bölümünü batığın, şırınga havayı çıkarmak ve bir parmak ile şırınga deliği kapsayan ve pistonu çekerek bir vakum uygulanır.
   1. Yaprak bölümü zarar görmesini önlemek için pistonu hafifçe bırakın. Bu iki ya da üç kez tekrarlayın, veya havanın en kaldırıldı ve kadar yaprak derin yeşil olarak görünmektedir.
      NOT: Bu adım stromules doğru görselleştirme engelleyebilir yaprak havayı temizler.
3. Bir slayta bir damla su ekleyin ve bu damla yaprak bölümüne yerleştirin. Sonra, başka bir dr eklemekyaprak üstüne su op ve yaprak üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. Herhangi bir hava kabarcığı varsa onlar kaldırılana kadar, yavaşça kapak kayma dokunun. slayt şimdi mikroskopi için hazırdır ve hemen görüntülenmiştir edilmelidir.

Konfokal Floresan Mikroskopi ile 2. Görselleştirme Stromules

1. iletilen ışık, (uzak jilet hasar hücrelerden) yaprak bölümünün merkezine yakın bir görüş alanında odaklanmak. Birçok kloroplast eş zamanlı olarak görüntülenebilir ve böylece bir 20x objektif kullanarak. gerektiğinde hücre tipleri daha sonra ayırt edilebilir, böylece iletilen ışık bir görüntü kaydedin.
2. fluorofor kullanılmak üzere uygun uyarma ve emisyon filtreleri ile bir lazer ışık kaynağı geçin. Örneğin, bir 488 nm lazer ile GFP tahrik 500 nm ve 525 nm arasında emisyon toplar.
   1. mikroskop yazılımı kullanarak, GFP kanalı seçmek ve iğne deliği diyafram Ai 1 ayarlamak için tıklayınry birimi. , Lazer tarama seçin örnek görselleştirmek başlamak için, ve sonra lazer yoğunluğu ve hala net stromules görüntülenmesi sırasında lazer gücü en aza indirmek için dedektör kazancını ayarlamak için GFP kanalı tıklatın. Bu ayarlar belirlendikten sonra, onları tüm deneyler boyunca mümkün olduğunca tutarlı tutmak.
3. Görüş alanı içinde yaprak epidermis yoluyla görüntüleri bir dizi toplayacak bir z -stack deney hazırlayın.
   1. Z -stack için (yaprak yüzeyine yakın kloroplast test koşullar altında daha stromules varsa, örneğin) önyargı önlemek için bakış alanı tüm epidermal kloroplast içerir.
   2. Z -stack için gerekli zamanı tüm stromules dahil ancak minimize edecek maksimum aralık mümkün görüntüleri çekin. Örneğin, 1 Airy birim her 2 mikron muhtemel ideal bir görüntü alarak, 2 mikron derin bir in-odak konfokal bölümüne eşdeğerdir.
      NOT: Yaprak epidermis düzgün olmayan bir yüzey, yani örnek olarak değişecektir -stack z toplam derinliği; En z -stacks 10-20 görüntüleri gerektirir, ama daha fazlasını içerebilir.
   3. (Mümkünse, genellikle 5-10 dakika içinde) z -stack hızla toplanan emin olmak için tarama hızı ve gerektiğinde görüntü çözünürlüğünü ayarlayın. Daha sonra analiz için z -stack kaydedin.

3. Görüntü İşleme

1. herhangi bir görüntü analizi yazılımı kullanılarak stromule sıklığını belirlemek. Bu protokol için, Ulusal Sağlık Enstitüleri (http://imagej.nih.gov/ij/), ya da ImageJ, Fiji popüler yükseltme kamuya açık ImageJ, (http://fiji.sc kullanmanızı öneririz / Fiji).
2. Yazılımda maksimum yoğunluğu projeksiyon kullanılarak tek bir görüntü içine z -stack Birleştirme.
3. Belirleyin ve manuel olarak görüntüdeki tüm kloroplast saymak.
4. Her bir kloroplast için, görsel olarak ister bir veya daha fazla stromules belirlenmesiBirleştirilen z -stack görüntüde kloroplast uzanan görülür. Örnekler için, bakınız Şekil 1.
   Not: stromules biyolojik fonksiyonları bilinen olmadığından, kloroplast gelen her hangi ince, stroma dolgulu, boru şekilli uzantı uzunluğundan bağımsız olarak, bir "stromule" olarak kabul edilebilir. Yaklaşık 1 um, uzunluğu ⁷ büyük kısmı boyunca çap olarak daha az ise, genel bir kural olarak, kloroplast bir stroma doldurulmuş uzantısı stromule olup. bir kişi bir kloroplast bir stromule olup olmadığını belirlemede sübjektif farklılıkları kontrol etmek için tüm görüntüleri analiz emin olun. İkinci araştırmacı bağımsız daha sübjektif önyargıları azaltmak için stromule frekansları doğrulamak gerekir.

4. Deney Tasarımı ve Örnekleme

NOT: Stromule frekans yaprakları arasında oldukça değişkendir, ancak birçok rapor stromule frekansta küçük varyasyon bir Indivi içinde olduğunu ortaya koymaktadırÇift yaprak ^9,17.

1. bir yaprak görünümünde tek bir alandan yaprak stromule frekansını hesaplayın. yaprak atın ve bu bağımsız örnek düşünün. bağımsız örneklem olarak bir yapraktan görüş ayrı alanlar düşünmüyoruz.
   NOT: stromules işlevi daha net tanımlanmış stromule aktivitede ve kadar en iyi nasıl önlem değişiklikleri, araştırmacılar stromule dinamiklerini miktarının yaratıcı olmaya devam etmelidir üzerinde güçlü bir fikir birliği yoktur. Literatürde arasında karşılaştırma, ancak raporlama ortak standartlar daha yaratıcı yaklaşımların yanısıra kullanılmalıdır. En azından, her zaman bir ya da daha fazla stromules sahip kloroplast sıklığını bildirmektedir.
2. bir görüş alanı içinde stromules sahip kloroplastlar sıklığını belirler. bir görüş alanındaki tüm kloroplast belirlemek için ImageJ kullanın. Daha sonra, her kloroplast için, kloroplast, en az bir stromule oluşturulmuş olup olmadığını belirlemek. Percenta olarak bildirin stromule frekansıBir stromule ile kloroplast ge.
   NOT: Bazı araştırmacılar stromule frekansları bildirmeden önce, arksinüs dönüşümü ile, örneğin yüzde dönüşümü; Bu istatistiki analiz için bir seçenek ise, stromule frekans Ark sezgisel bir değer değildir ve bir çalışma ana metin veya şekillerde rapor edilmesi gerekmez.
   1. alternatif bir yaklaşım olarak, stromules toplam sayısını saymak ve kloroplast toplam sayısına bölün.
      NOT: Çoğu durumda, bu 4.2 yaklaşım benzer sonuçlar verecektir; Tek bir kloroplast birçok stromules kurdu eğer, ancak, stromule frekansını tahmin edebilir. Örnek sonuçlar gösterilmiştir örnekte, örneğin birkaç kloroplastlar (33/87 bir stromule frekansa karşı) 40/87 almak amacıyla kloroplast başına stromules sayısı artırılarak, iki veya daha fazla stromules sahiptir.
   2. Seçenek olarak ise, bunun yerine stromule frekans stromule uzunluğunu belirler. Uzunluk ölçülebilirserbest çizgi aracı ile stromule takip ederek ImageJ.
      NOT: stromules biyolojik rolü bilinmemektedir yana, stromule uzunluğu işlevini etkileyen açık değildir. bunlar gözlenirse stromule uzunluğunda önemli farklılıklar rapor ama (4.2 de tarif edildiği gibi), aynı zamanda stromule frekansları rapor etmektedir.
      Not: Stromule frekansı aynı büyüme koşulları altında, farklı yaprak arasında oldukça değişken olabilir. Bu nedenle, zaman alıcı olabilir stromule frekansını belirlemek rağmen, deneyler dikkatle büyük örnek boyutları içerecek şekilde dizayn edilmelidir. Bizim laboratuarından veri setlerini kullanarak, standart ile (her bir tedavi için en az 16 bitki örneklem büyüklüğü iki durum arasında stromule frekansta en az 1.5 kat değişim istatistiksel olarak anlamlı bir fark olup olmadığını belirlemek için genellikle yeterince güçlü olduğunu belirledi α = 0.05 ve β = 0.80).
3. Sonuçların istatistiksel analizi.
   1. Bana karşılaştırmak içinİki tedavilerin stromule frekansları, (aynı zamanda eşitsiz varyans varsayarak heteroskedastik t testi veya t testi olarak da bilinir) Welch t testi kullanın.
      NOT: Bu test, geleneksel Student t testi kadar güçlü değil, ama stromule frekans dağılımındaki Varyans tedaviler arasında benzer olduğunu kabul etmez, çünkü Welch t testi avantajlıdır.
      NOT: stromule frekans bir "oran" olduğundan, örnekleme dağılımı teorik olarak çarpık istatistiksel analiz numunesi boyutları çok düşükse ya da stromule frekans (kapat% 0) ya da çok çok düşükse hangi, binom ziyade normal olarak tahmin edilmektedir yüksek (% 100'e yakın). Bazı raporlar normal dağılıma binom dağılımına dönüşümü ve böylece Student t testi ve ANOVA standart gereksinimlerini karşılamak için tasarlanmıştır istatistiksel analiz, daha önce arksinüs dönüşümleri kullandık. Ancak uygulamada, birrcsine dönüşümler istatistiksel analiz üzerinde çok az veya hiç etkisi yoktur ve bu nedenle tavsiye edilmez. Bunun yerine, istatistiksel gücünü artırmak ve verilerin yorumlanması hataları azaltacaktır örnek büyüklüğünü artırmak için deneyler tekrarlayın.
   2. Kullanılan istatistiksel ne olursa olsun yaklaşımı dikkatle her bir deney için numune alma stratejisi, örnek boyutunu, istatistiksel test ve p değeri rapor emin olun.
      NOT: biyolojinin diğer alanlarında olduğu gibi, bir p değeri 0.05'ten "istatistiksel olarak anlamlı" kabul edilebilir, araştırmacılar kesinlikle elde kesin p değeri rapor gerektiği halde. P iki ya da üç deneyler ile örnek sayısının artırılması, biraz 0.05 üzerinde ise gözlenen fark, tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını netleştirmek için yardımcı olabilir.

5. Stromule Dynamics Visualize'a Bozulmamış kloroplastlar ayıklanıyor

NOT: Çeşitli yöntemlerin vitro ¹⁵ stromule oluşumu üzerinde bir çalışmada biraz farklı bir protokol içeren, yapraklardan kloroplast izole etmek için kullanılmıştır. Aşağıda ayrıntılı protokol biyokimyasal saf kloroplast örnekleri verim değildir nispeten basit bir yöntem kullanır, ancak bunun yerine sağlam, sağlıklı kloroplast ^9,18 büyük miktarda izole etmez.

1. Soğuk ekstraksiyon tamponu hazırlayın: 50 mM Hepes, NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1.0 mM _MgCl2 ve 1.0 mM _MnCI2. Kullanmadan önce NaOH ve HCl ve soğutmak ile 6.9 pH ayarlayın.
   NOT: Her ne kadar gerekli değildir, soğuk tamponlar kullanılarak ve sağlam kloroplastların yüksek oranda verecektir mümkün buz örnekleri tutmak.
2. Yalıtım tamponu hazırlayın: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1.0 mM _MnCl2, 1.0 mM _MgCI2, 10 mM KCI ve 1.0 mM NaCI. Kullanmadan önce NaOH ve HCI ve soğutmak 7.6 pH ayarlayın.
3. Yaprakları değilsenizdimetil sülfoksit içinde 50 mM stok çözelti CFDA (DMSO) (1.0 mL DMSO 2.3 mg CFDA) genetik olarak kodlanmış stromal fluorofor ifade carboxyfluorescein diasetat (CFDA) çözeltisi hazırlayın.
   Not: tam konsantrasyonu kritik değildir. her zaman karanlıkta CFDA stok tutmak. -20 ° C'de, 50 mM CFDA az miktar saklayın.
4. kloroplast izole etmek için, çeşitli bitkilerden ~ 5-10 g yaprakları kaldırmak ve kısaca soğuk suyla durulayın. Hemen 50 ml soğuk ekstraksiyon tamponu transfer. birçok kısa darbelerle bir karıştırıcı ile ezme bırakır. iki adet 50 ml'lik santrifüj tüplerine ekstre kloroplast bölünmesi, yaprak tozu gidermek için tülbent iki ya da üç kat üzerinden filtre ve 750 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj.
5. Süpernatant atın ve 10 ml izolasyon tamponunda yeşil kloroplast tekrar süspansiyon. Tekrar santrifüj 750 xg'de 1 dakika için, supernatant atmak ve izolasyon tamponunda tekrar süspansiyon kloroplastlar, 5 ml nihai hacmi getirmek için.
6. transferi 201, bir slayt kloroplastların l, bir lamel ile kaplayın ve mikroskopi başlar.
   Not: plastid hedefli floresan proteinleri eksprese eden transjenik bitkilerden Kloroplastlar artık konfokal floresan mikroskobu ile görselleştirme için hazırdır.
7. stromules görselleştirmek için plastid hedefli floresan proteinleri ifade değildir bitkilerden kloroplast Leke.
   1. izolasyon tamponunda kloroplastlar askıya 5 ml 50 mM CFDA stokunun 5 ul ekleyin. 50 uM nihai konsantrasyon getirin.
   2. kloroplastlar 5 dakika inkübe ve sonra bir slayt küçük bir kısım (~ 50 ul) aktarmak, bir lamel ile kaplayın ve mikroskopi emmesine izin verin.
   3. bir FITC veya GFP filtre seti kullanın. tek bir izole kloroplast görselleştirmek için aynı anda çok sayıda kloroplast görselleştirmek için bir 20x objektif veya daha yüksek bir amacı kullanın.
      NOT: CFDA bozulmamış kloroplast stroma içinde floresan olacaktır.
   4. Güçlü arka plan flüoresan ise, Chlo yıkamaYine CFDA, 750 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj ile 5 dakika inkübasyondan sonra, 10 ml izolasyon tamponunda roplasts, 5 mi yalıtım tamponu içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon atın.

Bu protokol, genç N. kotiledonlardaki gün ve geceleri stromule frekansı görselleştirmek için kullanılan benthamiana fidanları. Bir z yığından Dilimler tek bir görüntü (Şekil 1A) birleştirilmiştir. Görsel amaçlı, o görüntü daha sonra desaturated ve stroma siyah (Şekil 1B) görünecek şekilde ters oldu. kloroplastlar ya hiç stromules (yeşil yıldız) sahip ya da en az bir stromule (eflatun yıldız) sahip olarak işaretlendi. görüntülenmiştir 87 epidermal kloroplast, 33 stromules var. Bu durumda, bu yaprağın stromule frekansı 37.9% 'dir.

Bu analizi kullanarak, protokol gün ve gece 24 bitkilerin toplam olarak bir 21 bitki (bitkide bir yaprak) tekrar edilmiştir. günde, ortalama stromule frekansı 20.8 ± 1.8% idi; Geceleri, ortalama stromule frekansı 12.8 ± 0.9% idi (Şekil2). Welch t testi ile belirlenen Stromule frekans, gündüzleri anlamlı derecede yüksek bulundu (n ≥ 22, p <0.0005). Her ne kadar 23.000'in üzerinde kloroplastlar ve birkaç yüz hücreleri, örneklem büyüklüğü gözlendi n, 22 olarak rapor edildiğini unutmayın, bağımsız bitkilerin sayısı incelendi.

Burada tarif edilen protokol kullanılarak, kloroplast stromules N yapraklarından izole edildikten sonra in vitro olarak tespit edilmiştir plastid hedefli GFP (Şekil 3A) ifade benthamiana, veya N izole kloroplast leke CFDA kullandıktan sonra benthamiana (Şekil 3B) veya Spinacia oleracea (Şekil 3C).

Şekil 1. N. stromule frekansı miktarının Benthamiana yaprakları. (A) aZ -stack N. epidermisin görünümünde kısmi alandan benthamiana ifade stromal GFP tek bir görüntüdeki tüm epidermal kloroplast ve stromules göstermek için birleştirilmiştir. (B) Bu görüntü, siyah ve beyaz dönüştürülür ve görsel amaçlı ters edildi. stromules ile Kloroplastlar bir kırmızı yıldız işareti ile belirtilmiştir; stromules olmadan kloroplastlar yeşil yıldız işareti ile belirtilmiştir. Ölçek çubukları 10 um temsil etmektedir. Brunkard ark modifiye. 9 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Koşulda stromule frekans karşılaştırılması Şekil 2.. Bu protokol str belirlemek için kullanılmıştırgünde 22 bitki ve gece 24 bitkilerde omule sıklığı. Stromule frekans geceleri daha gündüzleri anlamlı derecede yüksek bulundu (Welch t testi, n ≥ 22, p <0.0005). Hata çubukları standart hata gösterir. Brunkard ark modifiye. 9 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. yapraklarından bozulmamış kloroplast ayıkladıktan sonra stromules görselleştirme. (A) transgenik N. gelen Kloroplastlar benthamiana burada açıklanan protokoller kullanılarak izole edildi kloroplasta hedeflenir GFP (yeşil) bırakır. (B) Kloroplastlar, doğal tipte N. izole edilmiştir benthamiana ve CFDA, Fluo boyanan yapraklar(Sarı gösterilir) Sadece sağlam, canlı kloroplastların içinde resces. (C) Kloroplastlar da ıspanak gibi diğer bitki türlerinden izole edilebilir (G. oleracea), ve sonra, (sarı) CFDA ile boyanmıştır. Klorofil otofloresansı kırmızı gösterilir. Brunkard ark modifiye. 9

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.