Method Article

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

DOI:

10.3791/54692

⸱

November 23rd, 2016

 ,  , 
1Plant Gene Expression Center, Agricultural Research Service, USDA, 2Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kloroplastların yüzeyinden uzanan stroma dolu tübüller olan kloroplast stromullerinin dinamiklerini araştırmak için protokoller açıklanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stromules veya "stroma dolgulu tübüller", bitki hücrelerinde evrensel olarak gözlemlenen ancak işlevleri gizemli kalan kloroplast yüzeyinden dar, boru şeklindeki uzantılardır. Bitkilerin strese karşı tepkilerini koordine etmede kloroplastların rolüne artan ilginin yanı sıra, stromullere ve bunların kloroplast sinyal dinamikleri ile ilişkisine olan ilgi, stromul dinamiklerinin hızlı ve doğru bir şekilde görselleştirilmesine izin veren floresan mikroskobu ve protein floroforlarındaki ilerlemelerin yardımıyla son yıllarda artmıştır. Burada, kloroplast stromule biyolojisini araştırmak için mükemmel bir model sistem olan Nicotiana benthamiana'nın epidermal kloroplastlarında stromule frekansını test etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Ayrıca, yapraklardan kloroplastları çıkararak kloroplast stromullerini in vitro olarak görselleştirmek için yöntemler de sağlıyoruz. Son olarak, çevresel stres, kimyasal tedaviler veya gen susturma gibi uyaranlara yanıt olarak stromule frekanslarındaki farklılıkları analiz etmek için örnekleme stratejilerini ve istatistiksel yaklaşımları özetliyoruz. Araştırmacılar bu protokolleri, kloroplastların nasıl ve neden stromules yaptığını keşfetmek için yenilikçi deneyler için yeni yöntemler geliştirmek için bir başlangıç noktası olarak kullanabilirler.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kloroplastlar, bitki hücrelerinde fotosentezden ve bir dizi başka metabolik süreçten sorumlu dinamik organellerdir. Kloroplasttan gelen sinyal yolları ayrıca bitki fizyolojisi ve gelişimi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve bitkinin çevresel strese, patojenlere ve hatta yaprak şeklinekarşı tepkilerini koordine eder 1-6. Son zamanlarda, biyologlar kloroplast yapısının yeterince anlaşılmamış bir yönüne ilgi duymaya başladılar: stromuller, kloroplast7'nin yüzeyinden uzanan çok ince stroma dolgulu tübüller.

Stromüllerin biyolojik işlevleri bilinmemektedir, ancak stromul frekansının çevresel uyaranlara yanıt olarak değiş....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol için, N. epidermis stromule frekansı tahlil odaklanmıştır benthamiana yaprak. FNRtp: EGFP 13 ve NRIP1: 6 Cerulean çeşitli stabil transjenik 35S PRO dahil olmak üzere bu amaçla kullanılabileceğini oluşturulmuştur. Bu hatların her ikisi de, geniş bir şartlar aralığında altında yetiştirilen yaprak kloroplast stromada florofor sağlam ekspresyonunu göstermektedir. Seçenek olarak ise, bir kloroplast-hedefli flüoroforlar geçici N olarak ifade edilebilir benthamiana kullanarak Agrobacterium 13 dönüşümler. Agrobacterium infiltr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, genç N. kotiledonlardaki gün ve geceleri stromule frekansı görselleştirmek için kullanılan benthamiana fidanları. Bir z yığından Dilimler tek bir görüntü (Şekil 1A) birleştirilmiştir. Görsel amaçlı, o görüntü daha sonra desaturated ve stroma siyah (Şekil 1B) görünecek şekilde ters oldu. kloroplastlar ya hiç stromules (yeşil yıldız) sahip ya da en az bir stromule (eflatun yıldız) sahip olarak işaretlendi. görüntülen.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

stromules araştırırken, üç önemli faktör boyunca dikkate alınmalıdır: mutlak minimumda tutulmalıdır bitki dokusunun (i) manipülasyon, (ii) deneysel sistem tutarlı tutulmalıdır, ve (iii) örnekleme stratejileri dikkatle planlanan olmalıdır sağlam sağlamak, tekrarlanabilir veriler analiz edilmiştir.

Stromules oldukça dinamik: bunlar uzatmak ve mikroskop altında bir gözlemcinin gözleri önünde hızla geri çekebilirsiniz. Ayrıca, stromule frekansı (yaprak yaralanma gibi) stromules görselleştirmek i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.O.B. ve A.M.R., Ulusal Bilim Vakfı'ndan doktora öncesi burslarla desteklendi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HepesSigma-AldrichH3375
NaOHFischer-BilimselS320-1
SorbitolSigma-AldrichS1876
EDTAFischer-BiyoteknolojiBP121
MnCl < sub>2< / sub>Sigma-Aldrich221279
MgCl < sub>2< / sub>Sigma-AldrichM0250
KClSigma-AldrichP3911
NaClSigma-AldrichS9625
Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop Carl Zeiss IncModeli: LSM710
Karboksifloresein diasetat (CFDA)Sigma-Aldrich21879 &
Dimetil sülfoksit (DMSO)EMDMX1458-6
Waring blenderWaring Model: 31BL92
Fijifiji.scBiyolojik görüntüleri analiz etmek için açık kaynaklı yazılım

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
  2. Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stromule FrequencyFluorescence MicroscopyChloroplast IsolationConfocal MicroscopyStromule VisualizationNicotiana BenthamianaChloroplast StromulesStromule AnalysisStromule FormationStromule Dynamics

Related Articles