Algılama Trypanosoma brucei Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Özet

İn vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomları, düşük bir oranda antijenik varyasyona uğrar, öyle ki popülasyonlar, baskın bir varyant yüzey glikoprotein (VSG) tipini ifade eden parazitlerden ve küçük bir "anahtarlamalı" varyant popülasyonundan oluşur. Bu protokol, bu popülasyonları tespit etmek ve ölçmek için hızlı bir yöntemi tanımlar.

Özet

Trypanosoma brucei, hem İnsan hem de Hayvan Afrika Trypanosomimiasis'e (sırasıyla uyku hastalığı ve nagana olarak bilinir) neden olan bir protozoan parazit bir çeçe vektörü ile bir memeli konakçı arasında döngüler. Yüzeyini kaplayan yoğun, varyant yüzey glikoproteinini (VSG) periyodik olarak değiştirerek memeli konakçı bağışıklık sisteminden kaçar. Trypanosoma brucei'de antijenik varyasyonun saptanması hem zahmetli hem de emek yoğun olabilir. Burada, belirli bir popülasyonda yeni bir VSG'yi ifade etmek için 'değişen' parazitlerin sayısını ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Parazitler önce başlangıç VSG'sine karşı bir antikor ile boyanır ve daha sonra manyetik bir boncuk üzerine bağlı ikincil bir antikor ile boyanır. Başlangıç VSG'sini ifade eden parazitler daha sonra parazitleri bir mıknatısa bağlı bir sütun üzerinden geçirerek popülasyonun geri kalanından ayrılır. Baskın, başlangıç VSG'sini ifade eden parazitler kolon üzerinde tutulurken, akış, yeni bir VSG'yi ifade eden parazitlerin yanı sıra başlangıç VSG'sini ifade eden bazı kirleticileri içerir. Bu akış popülasyonu, kirleticileri etiketlemek için başlangıç VSG'sine karşı floresan olarak etiketlenmiş bir antikor ve ölü hücreleri etiketleyen propidyum iyodür (PI) ile tekrar boyanır. Akış sitometrisi ile görülebilen bilinen sayıda mutlak sayma boncuğu, akış popülasyonuna eklenir. Boncukların toplanan hücre sayısına oranı daha sonra tüm numunedeki hücre sayısını tahmin etmek için kullanılabilir. Akış sitometrisi, başlangıç, baskın VSG için pozitif lekelenmeyen PI negatif hücrelerin sayısını sayarak anahtarlayıcıların popülasyonunu ölçmek için kullanılır. Popülasyondaki anahtarlayıcıların oranı daha sonra akış sitometrisi verileri kullanılarak hesaplanabilir.

Giriş

Protozoon parazit, Trypanosoma brucei, Sahra-altı Afrika boyunca (Trypanosoma brucei brucei aracılığıyla) ve hayvanlar (Trypanosoma brucei gambience ve Trypanosoma brucei rhodesiense aracılığıyla) insanları etkileyen bir hastalık etkenidir. Bu çeçe sineği vektörünün tükürük yoluyla memeli konakçıda iletilir. İnsan ve Hayvan Afrika tripanosomyası Hem endemik bölgelerde ciddi bir ekonomik yük getiren ve birkaç ilaç mevcuttur ya da iki hastalığın tedavisi için geliştirilmektedir. Bağışıklık kaçırma mekanizmalarının anlaşılması trypanosomiasis için ilaçların geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Parazit kapsayan yoğun Variant Yüzey Glikoprotein (VSG) kat antijenik varyasyon birincil aracı biri olan T. brucei, memeli antikor tepkisini kaçınır. ~ 15 Expres VSG geninin yaklaşık olarak 2.000 varyantları tripanosom genomuna vardır, ama sadece bir birinden belirli bir zamanda transkripsiyonusion siteleri. Ifade VSG 'geçiş' aktif ifadesi sitesine bir VSG genini kopyalayarak, veya ⁽¹ gözden) daha önce sessiz ifade sitenin transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla gerçekleşebilir.

Çok iş T. anlamak antijenik varyasyon ayrılmış olmasına rağmen brucei, anahtarlama frekansı etkileyen faktörler hala tam olarak anlaşılamamıştır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar anahtarlama in vitro davranışsal oluşurken, anahtarlama frekansları yaklaşık 10 ⁶ hücre ² içinde 1 mertebesinde, çok düşük olduğu gerçeği ile engellenmiştir. Bu anahtarlama ilk etapta tespit etmek zor olduğundan, belirli bir faktör artar veya anahtarlama frekansını azaltır olmadığını ölçmek zor hale getirir. 2009 öncesinde, belirli bir nüfusta anahtarlayıcıları izole etmek için yöntemler uzun ve emek yoğun. Bunlar arasında baskın VSG karşı aşılanmış farelerde ile tripanozomlarına pasaj ve daha sonra hücreler toplandıBir gün sonra ³ veya immünofloresan ^4,5 ile hücrelerin yüzlerce sayma. Ilaç direnci anahtarlayıcıları ⁶ izole etmek için başka bir strateji seçimi dayanmaktadır. In vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomlar tipik bir büyük varyant ve alternatif varyantları ifade switcherlar çok daha küçük bir nüfusa ifade büyük bir nüfus oluşuyor, çünkü biz baskın, başlangıç VSG olarak bu yazıda boyunca büyük varyantı bakın. Bunu yaparken, biz hiçbir şekilde bu önemli varyant popülasyonda diğer varyantları daha fazla uygunluk olduğunu ima etmek istiyoruz.

4 saat - Burada güvenilir 3 belirli bir nüfusta bir dominant olmayan VSG ifade tripanozomlann sayısını ölçebilen bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir belirli bir genetik manipülasyon ya da ilaç tedavisi popülasyonda açık hücrelerin sayısını artırır olmadığını belirlemek istediğinde için özellikle yararlıdır. Bunun yerine do ifade hücrelerinin nüfusu riddingminant ilaç ile VSG başlayan ya da immünolojik vasıtasıyla, bu hücreler önce, bir manyetik sütun üzerinde izole hâkim VSG karşı antikora bağlanmış manyetik boncuk ile kaplanması ve ortadan kaldırılmıştır. anahtarlamalı nüfus daha sonra akış yoluyla toplanan ve kirletici tanımlamak için bir fluorofor etiketli anti-VSG antikoru ile tekrar lekeli. Niceleme hücrelere tanelerin oranı belirlenir ve nüfus ⁷ anahtarlama sayısını ölçmek için kullanılabilir, böylece her bir örnek için, mutlak sayaç boncuk belirli sayıda ekleyerek elde edilir.

Protokol

NOT: süreci boyunca, o buz üzerinde hücreleri tutmak için gereklidir. Soğuk ortam ayrıca boyunca kullanılmalıdır.

1. Numune Hasat

1. 1.000.000 / ml - 0.5 bir yoğunluğa Lister 427 suşu kan dolaşımı tripanozomlann büyütün. Bu parazit az sayıda kültürleri başlamak en iyisidir. 1.500 x g'de 10 dakika boyunca 50 x 10 ⁶ hücre / örnek aşağı doğru döndürün. Daha sonra pozitif ve negatif antikor denetimlerini kullanın için kültüründe 1 x 10 ⁶ hücre bırakın emin olun.
   NOT: Bu protokol ayrıca, hayvan kanı (detaylar için tartışmaya bakınız) izole tripanozomlann kullanılabilir.
2. Pipet veya yüzer maddenin en dökün (yaklaşık 750 ul bırakın). 1.5 ml mikrosantrifüj tüp hücreleri aktarın.
3. bir mikrosantrifüj içinde 5,200 x g'de, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de hücreler Spin ve supernatant çıkarın.

2. Manyetik Etiketleme

1. Tekrar süspansiyon hücreleri 150 ul kültür ortamında (HMI-9 wiUygun seyreltme örneğin inci serumu) + primer anti-VSG antikoru.
   Not: Anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1:50 seyreltmede kullanılmıştır. Bir florofor ile işaretlenmiş bir birincil anti-VSG antikor kullanılması önemlidir.
2. 10 dakika boyunca 4 ° C 'de soğuk bir odada 8 - hız 6 bir girdap adaptör 60 kullanılarak vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ile yıkayın.
3. 5,200 x g'de, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de spin ve süpernatant aspire. serum ile 1 ml HMI-9 ile yıkayın ve yukarıdaki gibi döndürün. süpernatant aspire. serumu HMI-9, 100 ul içinde süspanse pelet.
4. (MSC) mikroboncuklar ayırma Manyetik aktive hücre 110 ul ekle. birincil anti-VSG antikor uygun olarak, anti-fare anti-tavşan veya anti-biyotin boncuk kullanın. İyice karıştırın. 10 dakika boyunca 4 ° C 'de soğuk bir odada Vorteks hücreleri.
5. Hücreler vorteks olsa da, bir ayırma mıknatıs üzerinde bir manyetik aktive ayırma kolonu / örnek oluşturdu. Bir yeniden var emin olunsütununda ceptacle (biz bir 15 ml santrifüj tüpü kullanın) flow-through toplamak için. Soğuk bir odada aparatı ayarlayın.
6. Başbakan sütuna serum ile HMI-9 2 ml ekleyin. akış her bir örnek toplamak için sütunu altında bir 15 ml santrifüj tüp yeri emişli sonra.
7. Adım 2.4 10 dakika inkübasyondan sonra, 800-1000 civarında ul soğuk HMI-9 serumu ile ekleyin. 5,200 x g'de, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de dönel çıkartıldı ve süpernatan bağlanmamış antikorların çıkarılması için. Serum ve tekrar süpernatant 100 ul bırakarak ile HMI-9 1 ml yıkayın.
8. şiddetle ve görsel santrifüj tüpü Flick pelet tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olmak için tüp inceleyin. Hücreler de yeniden süspanse emin olmak için yukarı ve aşağı serum ve pipet ile HMI-9 1 ml ekleyin.

3. Manyetik Ayırma

1. Yukarıda açıklandığı gibi sütunlar hazırlanmış olduğundan emin olun. sütun hücreler uygulanır. Hücreler baskın olmayan VS ifade ile flow-through toplayınsütun üzerinden akmaya 7 dakika - G. 1 orta ml + tripanozomlar genellikle 6 alır.
2. Yıkama 1 ml HMI-9 serum ile 2x ve adım 3.1 olarak akış yoluyla aynı tüp içinde toplamak.
3. Bölme akış (3 mi), iki 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine.
   Not: Bu, daha sonra bir araya getirilebilir ya da yarı vb RNA izole etmek için de kullanılabilir
4. mıknatıstan sütun çıkarın. sütununa serum ile HMI-9 3 ml ilave edilir ve başlangıç ​​baskın VSG ifade eden hücreleri elde etmek için bir 15 ml santrifüj tüpüne sütun dalma. daha sonra analiz için akıtılan malzemenin 300 ul çıkarın. buz üzerinde bu hücreleri tutun.
5. pozitif ve bir negatif kontrol olarak kullanılmak üzere, 37 ° C 'de büyümekte, kontrol hücrelerinin başlangıç ​​kültüründen yaklaşık 1.000.000 hücre sunar 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine bunları pipet (bu sıklıkla geçiş beklenmemektedir).
   Not: pozitif kontrol hücreleri adım 4.1 fluoroforla işaretlenmiş antikor ile boyanmış olacaktır. Negatif kontrol hücreleri remaProtokolün geri kalanı boyunca lekesiz olarak.
6. Sıkma akış örnekler ve 5,200 x g'de, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de pozitif antikor kontrol örneği ve supernatant çıkarın.
   Not: elüt hücrelerinin diğer 300 ul alikosu, anti-VSG boyama için pozitif kontrol olarak kullanılabilir.

4. Boyama Bulaşanlar ve switcherlar Belirlemek İçin

1. Süspanse akış örnekler ve 100 ul HMI-9, uygun seyreltide Serum primer, fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG antikoru ile pozitif kontrol hücreleri.
   Not: etiketli anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1 seyreltme ile kullanılır: 1000. fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG step.There adım 3.5 aşağıdaki iki mikrosantrifüj tüpleri içinde akış numune 3 mi olmalıdır MACS ayırma etiketlenmemiş antikor olarak aynı kaynaktan olabilir.
2. yeniden sus ise iki mikrosantrifüj tüpler pelet birleştirmek, akım sitometri-through akımı ile tüm analiz etmek100 ul HMI-9 serum + anti-VSG antikoru ile örnekleri bekleyen. İyice karıştırın.
3. 10 dakika boyunca 4 ° C 'de soğuk bir odada Vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ekleyin. 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg'de ve çıkarma bağlanmamış antikorların çıkarılması için.
4. serumu HMI-9 için 1 ml hücre yıkayın. 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg'de çıkarın. Bu son dönüş sırasında, adım 3.4 ve negatif kontrol örneğinden yıkandı-örnekleri aşağı doğru döndürün.
5. 148.5 ul HMI-9 serumu, 25 ul mutlak sayım boncuk ve 1.5 ul Propidium iyodür solüsyonu (175 ul toplam) boyama: Tüm akış ve elüt örnekleri yeniden süspanse edin. 175 ul pozitif ve negatif antikor kontrol örnekleri tekrar süspansiyon HMI-9 serumu ile. Mutlak sayım boncuk / kullanılan özel lot için 25 ul sayısını kaydetmek için emin olun.
6. bir akış sitometresinde aracılığıyla tüm örnekleri çalıştırmak ve veri toplamak. PI olarak leke ölü hücreler ^{+. Kirletici maddeler PI olarak leke - VSG +. VSG - - Seçiciler PI olarak leke 8.}
7. veri flow sitometri kullanılarak anahtarlama frekansları hesaplayın.
   NOT: anahtarlama frekansları nasıl hesaplanacağı ile ilgili talimatlar için, ek dosyasına başvurun Sitometrisi Calculations.docx ve Tablo 1'de.

Sonuçlar

Burada anlatılan yöntemi nüfusu ⁸ switcherlar sayısını artırdı VSG ifade site içinde bu çift iplikli tatili göstermek için kullanılmıştır. Burada, aynı ifade yerinde bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan olan tripanozomlann bir nüfusa temsilcisi sonuçlarını gösterir. Biz bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan edilmemiş olması olanlara bu tripanozomlann karşılaştırın. 1 akış-geçen manyetik aktive hücre sıralama kolondan toplanan un-uyar...

Tartışma

Deneysel tekniği ile ilgili olarak, protokolün en önemli bileşeni soğuk tüm örnekleri tutuyor. Tripanozomlarına çok hızlı yüzeyleri ⁹ bağlanan antikor içselleştirmeye ancak bu işlem motilite bağlıdır ve hücreler, 4 ° C 'de tutulur sürece tahlil etkilemez. Tüm numuneler daima buz üzerinde tutulmalıdır ve pipet 25 ° C laboratuar ortamında maruz kalma en aza indirmek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Soğuk HMI-9 serum ile deneyin başlangıcında mevcut olmalıdır ve boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. sütun ü...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
etiketsiz anti-VSG antikoru	n/a	n/a	VSG antikoru evde yapılır
florofor etiketli anti-VSG antikoru	n/a	n/a	VSG antikoru evde yapılır
HMI-9 ortamı	n/a	n/a	HMI-9 evde yapılır
Propidium İyodür	BD Pharmingen	556463
CountBright mutlak sayma boncukları	Thermofisher Bilimsel	C36950
LD sütunları	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS mıknatıs	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS manyetik ayırıcı	Miltenyi Biotech	130-042-302
vorteks adaptörü-60	ThermoFisher bilimsel	AM10014
akış sitometresi	Coulter	yok
akış sitometresi analiz yazılımı	FloJo	n/a