Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi

Özet

Burada stres altında izole kloroplastların içine protein ithalat incelemek için yeni bir yöntem tarif. yöntemi hızlı ve basittir ve kloroplast protein alma için farklı stres koşullarında sonuçlarını ve ilgili düzenleyici mekanizmaları incelemek için uygulanabilir.

Özet

Kloroplastlar fotosentez ama birçok diğer metabolik ve sinyal fonksiyonları sadece içeren bitkilerin pek çok yaşamsal roller ile organelleri. Ayrıca, kloroplast gibi tuzluluk ve ozmotik stresler gibi çeşitli abiyotik streslere, bitki yanıtları için kritik öneme sahiptir. Bir kloroplast kendi genomu tarafından kodlanan, bazıları ~ 3.000 farklı protein kadar ihtiva edebilir. Ancak, kloroplast proteinlerinin çoğunluğu çekirdeğine kodlanmış ve sitozolde sentezlenen ve bu proteinler kloroplast zarf membranların de translocons aracılığıyla kloroplast alınmak üzere ihtiyacı vardır. Son çalışmalar, kloroplast proteini içe aktif stres ile kontrol edilebilir olduğunu göstermiştir. biyokimyasal stres koşulları altında, protein ithalat gibi düzenlenmesini araştırmak, biz kolayca herhangi bir laboratuvarda elde edilebilir hızlı ve basit bir işlem olarak burada açıklanan yöntemi geliştirdi. Bu yöntemde, bitkiler normal conditio altında yetiştirilirDaha sonra ns ve sıvı kültüründe stres koşullarına maruz. Bitki materyali toplanır ve kloroplastlar sonra homojenizasyon tarafından serbest bırakılır. Ham homojenat sağlam kloroplast izolasyonunu sağlayan, yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile ayrılır. Kloroplast verim sayımı ile değerlendirilir ve kloroplast intakt bir mikroskop altında kontrol edilir. Protein ithalat tahlilleri için, saflaştırılmış kloroplastlar in vitro çevrilmiş haberci proteinleri ³⁵ S radyoetiketlenmiş ile inkübe edilir ve zaman ders deneyler stres koşullarında genotipleri arasındaki ithalat oranları karşılaştırmalar sağlamak için yapılmaktadır. Biz düzenleyici mutant gelen kloroplastlar içine protein ithalat oranı özellikle ozmotik stres koşulları altında değişmiş olduğunu gösteriyor bu yöntem kullanılarak üretilen verileri sunmak.

Giriş

Kloroplastlar bitkilerin yeşil dokularda mevcut oldukça bol organelleri. Onlar fotosentez kritik rol, şeker karbondioksit dönüştürmek ve böylece yeryüzünde ¹ neredeyse tüm yaşamı desteklemek için ışık enerjisini kullanan bir işlem için iyi bilinmektedir. Buna ek olarak, kloroplast (ve plastidler adlandırılan ilgili organellerin geniş ailesi) amino asitler, lipidler, pigmentlerin sentezi ve bu ağırlık ve patojen zorlaması gibi çevresel sinyalin duyulması da dahil olmak üzere, bitkilerde bir çok önemli rol oynar. Fotosentez, belirli koşullar altında yararlı role sahip olduğu, yan ürünleri gibi reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturur, ancak, eğer zarar ya da ölümcül etkilere neden olabilir fazlasıyla üretilmiştir. ROS aşırı özellikle olumsuz çevre koşulları tarafından teşvik edilir ve böylece kloroplastlar yakından tuzluluk ve ozmotik stresler ² olarak abiyotik streslere, verilen yanıtların bağlantılıdır.

Chloroplasts karmaşık bir yapıya sahiptir. Her bir kloroplast dış ve iç membranlar oluşur kaplama olarak adlandırılan bir çift membran dış katman ile çevrilidir. Dahili olarak, fotosentezin ışık reaksiyonları gerçekleşecek thylakoid, adında başka bir zar sistemi vardır. iki membran sistemleri arasında sulu bir bölme arama C tespit katılır stroma vardır. Bir kloroplast 3.000 ~ farklı proteinleri içerebilir, ve bu proteinlerin büyük çoğunluğu ön-madde biçiminde sitozol sentezlenir ve zarf membran ¹ adanmış proteini translocons ile organel içe gerekir. İlginçtir, son çalışma kloroplast proteini ithalatı aktif düzenlenir belirtti ve bu yüzden kloroplast proteom üzerinde kontrol önemli bir seviyede uygulamak mümkün. Örneğin, protein ithalat inci bolluğu doğrudan yönetmelikle abiyotik strese yanıt verebilir 2015 yılında rapor edilmiştirubikuitin-proteazom sistemi ³ ile kloroplastlar (TOK) Dış zarfın zarında e translokon.

Saflaştırılmış kloroplast kullanılması ve in vitro sentezlenen ön-madde proteinlerinin protein içe vitro ^4,5 içinde yeniden edilebilir. Böylece, in vitro yöntemler, protein ithalat makine varsayılan bileşenlerinin analizi için ve protein ithalat ve düzenleme altında yatan mekanizmaları keşfetmek için kritik bir yaklaşım olmuştur farklı mutant bitki ^6, ithalat oranlarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, kloroplast kloroplast proteinlerinin ^7,8 alt organel lokalizasyon, topoloji ve çalışmalarını kolaylaştırabilir in vitro ithalat aşağıdaki ileri fraksiyon ya da proteaz sindirim, ile işlenebilir.

biz açıklayacağız olarak stres protein ithalat düzenlenmesini incelemek için, bizim rutin kloroplast izolasyon yöntemi değiştirdinizİşte. Önemli olarak, kloroplast 8 gün boyunca ortam agar standart Murashige ve Skoog (MS) büyütülmüş ve daha sonra, nispeten kısa, kontrollü baskı tedavisi sağlayan, stres ile takviye Sıvı MS ortamı içine transfer edilmiş bitkilerden izole edildi. Stres ile tedavi edilen bitkilerden izole kloroplast verimi ve yetkinlik İn-vitro protein içe tahlilinde ³ alt uyumludur. Kloroplast yalıtım protokole ek olarak, sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve yaygın olarak ^3,9-12 kullanılan in vitro protein alma için, rutin bir yöntem sunuyoruz.

Protokol

1. Arabidopsis Bitkilerin Büyüme ve Stres Tedavisi

1. 1 L iyondan arındırılmış su kadar MS temel tuz karışımı içinde 4.3 g, 10 g sakroz, 0.5 g 2- (N-morfolino) etan sülfonik asit (MES) eklenerek Murashige ve Skoog (MS) ortamı 1 L hazırlanmakta ve ayarlamak potasyum hidroksit ile pH'ı 5.7'ye (KOH). 120 ° C de 20 dakika süreyle phytoagar ve otoklav 6 g ekleyin.
   1. katılaşma önce, (- plaka başına 25 ml MS ortamı 20 ile çapı 9 cm, yükseklik 1.5 cm) yuvarlak Petri kapları içine orta dökün. Plakalar kapakları kapatmadan önce bir laminer akış kaputu 1 ~ için h kurumaya bırakın.
2. % 70 1 ml% 0.02 (h / h) Triton X-100 ihtiva eden ve sürekli, 5-10 dakika boyunca çalkalama (h / h) etanol ilave yüzey sterilizasyonu için 1.5 ml bir test tüpüne, Arabidopsis thaliana tohumları yerleştirin. 150 fidan - Her genotip / durum için, 10 Petri plakaları her taşıyan ~ 100 hazırlar.
3. Tohumlar yerleşmek kadar yaklaşık 10 saniye bekleyinDaha sonra tüpün alt ve pipetleme süpernatant atın. % 100 etanol 1 mL ekleyin ve 10 dakika için daha tüp çalkalayın.
4. tohumlar sterilize ederken laminer akış kaputu hazırlayın. , Örnek başına filtre kağıdı tek parça almak ekim kolaylaştırmak için ikiye katlayın ve kaputu% 100 etanol içinde ıslatın. tamamen kurur kadar bekleyin. daha hızlı bir şekilde,% 70 etanol daha buharlaştıkça yani% 100 etanol kullanılır edin.
5. İnce ucundan 1 ml pipet kesim ~ 5 mm kullanarak pipetleme filtre kağıdı üzerine tohum aktarın. 15 dk - onları yaklaşık 10 almalı, hangi kurumaya bırakın.
6. Her MS ortamı Petri plaka üzerine eşit 150 sterilize tohumları ve cerrahi bant ile her plaka mühür - ~ 100 Sow.
7. teşvik ve çimlenmesini senkronize 4 d - ters 2 4 ° C'de plakaları saklayın. Eski tohumlar 4 ° C'de (bir hafta kadar) daha uzun kalmak gerekebilir.
8. bir bitki doku kültürü odasına plakaları aktarın ve baş yukarı bırakın.Uzun gün döngüsü altında 8 gün boyunca bitkiler büyümek (16 saat 100 ľmol · m ^{- 2} · s ^{- 1} ışık, 8 saat karanlık) 20 ° C'de.
9. Bitkiler akış kaputu, 8 d eski stres tedavisi için, hafifçe stres içeren sıvı MS ortamında bir sterilize balona, etanol sterilize eldiven giyen elle onları kazıma, agar ortamı aktarabilirsiniz (örneğin 200 mM mannit). agar ortamı üzerinde taşıyan kaçının. steril folyo ile şişe ağzı kapatılır ve bitkiler hafifçe çalkalanarak (-100 rpm) ile orbital bir karıştırıcı üzerinde ek 2 gün boyunca adım 1.8 ile aynı koşullar altında büyümeye olanak sağlar.

2. in vitro transkripsiyon ile öncü proteinin yapma / yaptı

Not: Bu protokol, şablon / preprotein olarak D öncüsü (pPsaD) kompleksi Arabidopsis fotosistem kullanımını varsaymaktadır, ancak yöntem diğerleri ile uyumludur.

1. PBluescript II SK vektör (veya akış yukarı T7 promoteri ile benzer başka vektör) ¹³ çoklu klonlama bölgesinin (MCS) içerisine pPsaD kodlama dizisi (CDS) klonlama. DNA izolasyon kiti kullanılarak plazmid (pBSK-pPsaD) saflaştınlır ve DNA dizilimi yolu ile sekansının doğrulanması.
   NOT: Tüm bu adımlar, standart moleküler klonlama teknikleri kullanır.
2. 260 nm'de absorbans ölçümü için ayarlanmış bir spektrofotometre kullanılarak pBSK-pPsaD plazmit DNA konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 ng / ml bir son konsantrasyona kadar plazmid seyreltilir.
3. şablon olarak seyreltildi plasmidi kullanılarak (35 çevrim için) 20 uL PCR çalışması. 2 ul 10 x polimeraz tamponu, 2 uL 2mM dNTP, 1 uL 5 mM M13 ileri primeri (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 uL 5 mM M13 ters primeri (5: aşağıdaki reaksiyon hazırlanması '-CAG GAA ACA-3 ACC GCT ATG'), 1 uL pBSK-pPsaD plazmid, 1 U Taq polimeraz ve damıtılmış su ile seyreltilir kadar toplam reaksiyon hacmi oluşturmak için20 uL. aşağıdaki gibi standart bir PCR programı kullanarak: 95 ° C, 5 dak; [95 ° C, 30 saniye 35 döngü; 56 ° C, 30 saniye; 72 ° C, 30 saniye); ve 72 ° C, 5 dakika.
4. TAE tamponu (Tris-HCI, pH 7.6, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA) içinde agaroz jeli cDNA doğru amplifikasyon kontrol ve ilgili ölçmek için (ağ / hac),% 1 üzerinde PCR ürünün 5 uL başlat standartlara bant göreli konsantrasyonunu onaylayın. diğer uygulamalar için -20 ° C 'de, ürünün geri kalan saklayın.
5. Aşağıdaki gibi PCR DNA ile uyumlu olan bir tavşan retikülosit lizat göre hücresiz transkripsiyon / translasyon sistemi kullanılarak 50 ml'lik bir reaksiyon hazırlanması: 40 uL retikülosit lizatı transkripsiyon / translasyon sistemi, 2.5 uL radyo işaretli ^[35S] metionin, 11 uCi / ml (spesifik aktivite:> 1000 Ci / mmol), 2.5 uL steril damıtılmış su ve 5 uL pPsaD PCR ürünü (100-800 ng).
   Dikkat: eldiven, laboratuvar giysi ve emniyet glas Wearses radyoaktif madde taşırken. Monitör ve çalışma yüzeyi ve araçlarını temizlemek. onaylı bir atık konteynerine tüm radyoaktif atık bertaraf edin.
6. 30 ° C su banyosu içinde 90 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin. Buz üzerinde numunesinin ederek reaksiyonu durdurun.
7. otoradyografi, florografi ya da fosfor görüntüleme ardından standart sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) üzerine doğrulaması için bir test örneği olarak reaksiyon (aynı hacmi de aşama 5.7 için bir giriş kontrol olarak hizmet görebilir) 1 uL çıkarın. İyi bir sonuç pPsaD (~ 23 kD) molekül ağırlığına karşılık gelen bir tat ve güçlü bant gözlem ile gösterilir. diğer uygulamalar için, -80 ° C'de reaksiyon kalan saklayın.

3. Kloroplast İzolasyon

1. Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın:
   1. 0.6 M sorbitol, 10 mM magnezyum klorür: Kloroplast izolasyon tamponunda (CIB, 2x) hazırlanması_(MgCI2), 10 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 20 mM sodyum bikarbonat _(NaHCO3), 40 mM 4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) ; KOH ile pH 8.0 olacak şekilde ayarlanır. 2x CIB 2 L hazırlayın alikotları yapmak ve uzun süreli depolama için -20 ° C'de muhafaza edin, ya da kısa süreli depolama için 4 ° C'de. damıtılmış su ile 1;: 1x CIB ettirmek için, 2x CIB 1 seyreltin Bu kloroplast yalıtım deney gününde taze olarak hazırlanabilir.
   2. HEPES-MgSO ₄ sorbit tamponu (HMS, 1 x) hazırlanması: 50 mM HEPES, 3 mM magnezyum sülfat (MgSO ^ _4), 0.3 M sorbitol; Sodyum hidroksit (NaOH) ile pH 8.0 olacak şekilde ayarlanır. , 400 mL kadar tamponu hazırlayın alikotları yapmak ve uzun süreli depolama için -20 ° C'de muhafaza edin, ya da kısa süreli depolama için 4 ° C'de.
2. soğuk oda veya buz üzerinde aşağıdaki prosedürleri yürütün. st önce çözümler, gereç, ekipman ve rotor tüm ön soğutmaArting.
3. 13 mL Percoll, 13 mL 2x CIB tamponu ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 5 mg glutatyon karıştırılması ve 4 ° C'de 30 dakika (fren kapalı) için 43,000 x g'de karışım santrifüj ile sürekli bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Santrifüj işleminden sonra, degrade rahatsız etmemek ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutmak için dikkatle tüp kolu.
4. 1 L'lik bir behere genotip / durum başına 1 x CIB 100 mL aktarın.
   1. bir elek içine devrilme sıvı ortamdan fidan kaldırmak ve başka CIB içeren beher içine aktarabilirsiniz; Daha sonra, taze CIB 100 mL ile değiştirmeden önce herhangi bir kalıntı sıvı ortam kaldırmak için CIB ile doku durulayın.
5. homojenizasyon için, 50 ml beher düzenlenen taze CIB 20 mL kullanarak yuvarlak homojenizasyon beş ardışık tur, her numune başına 100 mL 1x CIB toplam kullanın.
   1. homojenizasyon ilk turu için, izin elle 50 ml beher içine bitki doku transferiBir önceki tutma tampon parmaklarının arasından boşaltmak için. ilk turda dokusunun en kullanmaya çalışın, ama tamponu ile batırılır emin olun; Bu mümkün değilse, ikinci turda kalan kullanılmamış dokuyu tanıtmak.
6. doku içine doku homojenleştirici duyargasını ve 1 iki darbeleri ile homojenize - 2 sn her. yumuşak bir sıkarak 250 mL'lik santrifüj tüpü içine filtre bezi iki katmanı boyunca Homojenat filtre. süzüntü saklayın ve 50 ml beher geri doku aktarın.
7. homojenizasyon ilk turunda kullanılmayan kalan doku ekleyerek, 50 ml beher içine ikinci bir 20 mL CIB kısım yerleştirin ve homojenizasyon ve filtrasyon adımları tekrarlayın. Bu nedenle, tekrar CIB 100 ml (yani, 5 20 mL alikotları), ve elde edilen süzüntüler bir araya kullanıldıktan tüm kadar 3.5 ve 3.6 adımları tekrarlayın.
8. Santrifüj 4 ° C'de 5 dakika (fren) için 1000 x g'de toplanmış Homojenat ve kapalı dökünsüpernatant hemen pelet rahatsız etmemek için özen, santrifüj tamamlanmasını takiben. yavaşça buz tüpü çalkalayarak tüp içinde kalan kalıntı süpernatant pelletini. pipetle veya vorteks kuvvetlice tekrar süspansiyon yok.
9. Yavaşça alıcı borunun çeperi yoluyla uygulamak için bir Pasteur pipeti kullanılarak, önceden hazırlanmış sürekli yoğunluk gradyanı üst kısmına Homojenat aktarın. degrade rahatsız etmemek. 4 ° C'de 10 dakika (fren kapalı) için 7800 x g'de bir sallanan kepçeli rotor santrifüjleyin.
   Alt bant sağlam kloroplast içerir ve üst bant kırık kloroplast içerir: İki yeşil bantlar santrifüj sonra degrade görülebilir: NOT.
10. pipetleme En bant atın, sonra gradyanı başına 8 mL'lik bir hacmi koruyarak, yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne Pasteur pipeti ile alt bant aktarın.
11. t ~ 1x HMS 25 ml tüp içine tampon ekleyin ve iki kez tüp terso kloroplastlar gelen Percoll yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca (fren) için 1000 x g'de sallanan kovalı rotor ve santrifüj içinde tekrar tüp yerleştirin.
12. Süpernatantı dökün ve dikkatlice yavaşça buz tüpü çalkalayarak tüp içinde kalan artık HMS kloroplast pelletini. (Pelet boyutu ve Bölüm 4'te sayma dayanarak) gerekirse HMS 300 uL, ama çok fazla örneği sulandırmak için değil deneyin - ek bir 100 ekleyin.
    1. buz üzerinde kloroplast tutun. kloroplastlar, aşağı uygulamalar için kullanılır önce her zaman onları tekrar süspansiyon tüp sallayın. Her zaman kloroplast aktarmak için (büyütülmüş gözenek) ile bir kesim pipet kullanın.

Kloroplast Verim ve Bozulmamışlık 4. Analizi

1. 1.5 ml tüp içinde 495 uL 1x HMS tamponuna izole kloroplastların 5 mcL ekleyin ve sonra 1 elde etmek için tersini tüp hafifçe karıştırın: 100 seyreltme.
2. Plahaemositometre sayma odasının üstüne bir kapak camı ce. Yavaşça pipet ~ 40 - kapak cam ve sayım odasına arasındaki boşluğa seyreltilmiş kloroplast süspansiyonu 60 ul. 10X veya 20X amacı ile bir faz-kontrast mikroskop kullanarak, bozulmamış kloroplastlar yuvarlak ve parlak görünmesini ve ışık halesi ile çevrilidir.
   NOT: Mikroskop altında, 25 büyük meydanlar, sayma odasının merkezinde her biri 16 küçük kareler ile 1 mm ² sayma alanı yoktur.
3. 10 büyük kareler kloroplastlar sayısını. çok az veya çok fazla kloroplast varsa, buna göre seyreltme faktörü (yukarıdaki adım 4.1) ayarlayabilir ve prosedürü tekrarlayın 10 ila 30 büyük kare başına kloroplastların sayısı ortalama gerekir.
4. aşağıdaki gibi mL (konsantrasyon) başına kloroplastların sayısını hesaplayın: n (Adım 4.3 hesaplanan büyük kare başına kloroplastların ortalama sayısı), büyük kareler 25 (toplam sayısını ×) 100 (seyreltme faktörü) x 25 kareler üzerinde hacmi 0.1 ^mm3 olduğu), 1 mL başına veri ifade 10 ⁴ (ölçekleme faktörü ×.
5. Adım 3.12 'de elde edilen kloroplast süspansiyon hacimce konsantrasyonu çarpılarak kloroplast gerçek verimini hesaplayın. Normal olarak, birden fazla 50 x 10 ⁶ kloroplast elde edilebilir.

5. Kloroplast Protein İthalat

1. Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın:
   1. 10x HMS tamponu hazırlayın: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO ₄ ve 3.0 M sorbitol; NaOH ile pH'ı 8.0'a ayarlayın. uzun süreli depolama için -20 ° C'da, bu tampon, kısım ve mağaza 50 mL hazırlanması ve kısa süreli depolama boyunca 4 ° C 'de.
   2. 1x HMS tampon içinde çözünmüş 50 mM EDTA: İthalat durdurma tamponu hazırlayın. -20 ° C'de bu tampon, kısım ve mağaza 50 mL hazırlayın.
   3. (60 w mM Tris-HCl, pH 6.8,% 10 (h / h) gliserol,% 2: 2x protein yükleme tamponu hazırlayın/ H) SDS,% 0.005 (ağ / hac) bromofenol mavisi. 4 ° C'de 50 mL, ve mağaza sağlayın. Kullanımdan hemen önce, tampon 900 uL 1 M, 1,4-ditiyotreitol (DTT), 100 uL ilave edin.
2. 3 zaman noktaları ile bir zaman ders çalıştırmak 3 tüpleri ithal durdurma tamponu 130 mcL kısım içeren her hazırlamak ve buz üzerinde bunları bırakın. (Genotip / durum başına) 2 ml tüp içinde 450 uL ithalat reaksiyonu hazırlayın. kullanımdan hemen önce tüm malzemeyi çözülme.
   1. Bir içe reaksiyonu için tipik bir uL hacim içinde 10 x 10 ⁶ kloroplast kullanımı; Örneğin kloroplast konsantrasyonu 2.5 x 10 ⁸ ug / ml 40 uL kloroplast süspansiyonu kullanmak faydalı olacaktır. Üç zaman noktaları 3 × A uL gerekir (yani, bizim örneğimizde 120 uL).
   2. Aşağıdaki sırayla, buz üzerinde reaksiyonlar bileşenleri karıştırmak: damıtılmış su (toplam hacim 600 uL yapmak için), B uL 10x HMS tamponu (B = [600-3 x A] / 10, yani, 48 bizim örneğimizde), 12 uL1 M glukonik asit (potasyum tuzu), 6 uL 1 M NaHCO _3, 6 uL% 20 BSA, 30 uL 100 mM adenozin 5'-trifosfat, magnezyum tuzu (MgATP), 24 uL 250 mM metionin (a / h) (radyoaktif olmayan ) ve 30 uL protein öncüsünün. Hemen ithalat reaksiyonu başlamadan önce, 3 × kloroplast bir uL ekleyin ve tüp hafifçe dokunarak karıştırın.
3. ² · s ^{- 1 -} ışık 100 umol · m altında bir su banyosu içinde 25 ° C 'de, reaksiyon tüpü inkübe edin. Bazen kloroplast tekrar süspansiyon tüpler hafifçe vurun.
4. Zamana karşı yapmak için, pPsaD için ~ 12 dakika (4, 8 ve 12 dakikalık zaman noktalarında uygun kadar olan içe doğrusal aralığı içinde gerekli zaman noktalarında reaksiyonundan 130 uL'lik geri bu durumda). Lineer aralığı süresi farklı proteinler ¹⁴ değişebilir. Nedenle, t optimize etmek için daha önce her bir de ön test etmek için önerilmektedirO zaman puan.
5. Hemen geri çekilmesi üzerine, buz gibi soğuk ithal durdurma tamponu bir tüp her 130 uL kısım aktarmak tüp hafifçe dokunarak karıştırın ve zaman ders tamamlanana kadar buz üzerinde tüm tüpleri korumak.
6. Santrifüj bir mikrofüj içinde 12,000 x g 'de 30 saat boyunca tüm örnekler, pipetleme süpernatantlar atmak ve pelet tekrar vorteks yoluyla 15 ul 2x protein yükleme tamponu.
7. Tüm örnekler artı standart SDS-PAGE ve otoradyografi, florografi ya da fosfor görüntüleme ¹⁵ ile pPsaD giriş kontrolü (adım 2.7, her ithalat reaksiyonuna ilave miktarın% 10'u kadar pPsaD eşdeğer içeren) analiz. Sonuçları ölçmek ve analiz etmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. içe verimliliği bir gösterge sağlamak için, farklı genotipler ithal protein miktarı / koşullar Her bir olgun bant ile bağlantılı radyoaktivite ölçümü ile değerlendirilebilir.

Sonuçlar

3 zaman noktaları ile bir örnek kloroplast proteini içe Deney, Şekil 1 'de gösterilmiştir. PSAD ~ 23 kD ¹⁶ bir ön-madde biçiminde olan, bir stroma maruz fotosistem bir ~ 18 kD bileşenidir. Bunu sabit olarak WT göre SP1 mutant, yükselir çünkü pSAD mutant ³ ithalat etkinliğindeki bir değişikliğe işaret, gerilimli şartlar altında, burada in vitro protein içe deneyi için seçildi. SP1 proteini ³ - sp1 mutant kloroplast protein ithalat makine önemli bir regülatör bir kusur taşır. Normal koşullar altında yetiştirilen bitkilerden izole kloroplastların için sp1 ve WT arasındaki pSAD ithalat belirgin bir fark yoktu (veriler gösterilmemiştir) ^3. Ancak, burada açıklanan yöntemler kullanılarak ozmotik izole kloroplastların içine pSAD ithalat değerlendirmek içinstresli bitkiler, açık bir fark tespit edildi. Biz de genotipleri ile zamana bağlı bir şekilde olgun protein formunda birikimi gözlenen iken, ithalat oranı önceki sonuçlarla ³ ile uyumludur sp1 kloroplastlarda (Şekil 1), için daha WT kloroplastlar için anlamlı olarak daha düşüktü ve ortaya stres koşulları altında pSAD kloroplast ithalatını düzenleyen SP1 proteinin önemli bir rol.

Şekil 1. Protein İthalat Testi stres koşullarında yetiştirilen Kloroplastlar 10 günlük bir WT (Col-0) izole edilmiştir. Osmotik Stres Koşullarında Yetiştirilen bitkilerden izole edilen kloroplastlarda ve sp1 mutant Arabidopsis bitkileri kullanarak Yürütülen (200 mM mannitol) 2 gün boyunca. (A) Protein ithalat kullanılarak gerçekleştirilmiştir ^[35 S] -methionine etiketli pPsaD ve SDS-PAGE ve fosfor görüntüleme ile analizden önce 4, 8 ve 12 dakika devam etmesine izin verilir. Buna paralel olarak, in vitro olarak aşağıdakileri içeren pPsaD% 10 giriş kontrolü, çevrilen protein (IVT) analiz edilmiştir. muhtemelen kesilmiş veya proteolizlenen çeviri ürünlere karşılık iki bant vardır aralarında iken kendi yoğunluk zamanla (*) sırasında değişmedi çünkü (ön) ve olgun haberci (mat) pPsaD formları, belirtilmiştir. Stres koşulları altında yetiştirilen WT ve sp1 bitkilerden kloroplastların içine ithalat fiyatlarını karşılaştırın (B), A ithal olgun proteine karşılık gelen her bir bandın şiddeti ölçüldü. Tüm veriler 12 dakika sonra WT bitkilerden kloroplastlarda ithal protein miktarı yüzde olarak ifade edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Biz son zamanlarda kloroplast protein ithalat aktif kloroplast fonksiyonu ve bitki yaşam ³ için kritik stres, ile kontrol edilebilir olduğunu gösterdi. Bu çalışmada, bu tür düzenlemeyi izlemek için, biz stres koşulları altında yetiştirilen bitkilerin ithalat kapasitesinin değerlendirilmesini sağlamak için bizim kloroplast izolasyon ve in vitro ithalat tahlil prosedürleri güncellenmiştir. Sonuçlar kloroplast protein ithalat düzenlenmesinde SP1 için önemli bir rol gösterdi.

Geleneksel in vitro ithalat deneyleri standart MS ağar ortamı ^6,17,18 yetiştirilen bitkiler kullanın. Burada anlatılan sp1 mutant durumunda, bu tür geleneksel tahliller WT ³ protein ithalat göreli herhangi bir farklılık ortaya koymamıştır. Protein ithalat burada tarif edilen yöntemler (Şekil 1) kullanarak stres koşulları altında değerlendirilir Ancak, protein ithalat düzenlenmesinde SP1 rolü açıkça ortaya çıkar. o m ikenay doğrudan (yöntemler sırasıyla, sıvı kültüründe ve agar ortamı üzerinde yetiştirilen bitkiler istihdam gibi) geleneksel deneylerde elde edilenlerle stres koşulları testte ithalat verileri karşılaştırmak mümkün olmayabilir, stres ve non-stres koşulları arasındaki karşılaştırmalar yapılabilir şartıyla vardır bitkilerin hepsi ya da stres olmadan aynı sıvı kültür ortamında yetiştirilir.

Agar ortamı üzerinde stres tedavisi ile karşılaştırıldığında, sıvı kültür içinde in vitro içe deneyleri için gereken bitkilerin çok sayıda tedavisi için daha uygundur. Ayrıca, kısa süreli stres tedaviler için özellikle önemlidir, tüm bitkiler için bir stres, düzgün uygulamayı kolaylaştırır. Burada sunulan yöntem manitol tedavisi ile osmotik stres çalışma uygulanmış, ama kolayca, diğer streslere geniş bir şekilde adapte edilebilir; örnek, kısa vadeli tuz stresi ve oksidatif stres, hangi karşılık gelen stres olabilir b içine benzer sıvı MS ortamı aracılığıyla başvurdu. gerilmelerin diğer türleri için, stres derecesi ilk optimize edilmiş öneririz; aşırı ağır tedaviler izole organellerin verim ve / veya ithal yeterlilik üzerinde olumsuz etkileri olabilir.

aşağıda ayrıntılı olarak bir, özel dikkat protokol kapsamında birçok önemli adım vardır.

üreticiye bağlı olarak - (ağırlık / hacim,% 0.9 0.6) MS ortamı için en uygun agar konsantrasyonu değişebilir. Bu nedenle, deneysel deneyler başlamadan önce konsantrasyonda agar optimize etmek önerilir. orta o hasat adım (adım 1.9) de dokuya yapışır ve böylece yumuşak olmamalı, ne o kadar zor bitkinin kök gelişimini önlediğini olmalıdır. sukroz konsantrasyonu da kullanılan bitkilere göre ayarlanabilir. (W / v) sakaroz bitkilerin daha iyi büyümesi yardımcı olabilir% 3 - özellikle de hasta mutantları ile çalışırken, MS ortamı 2 ile takviye edilmiştir. ne zaman uygulamastres tedavileri yalan, sıvı ortamda (örneğin,> 14 gün eski) çok eski bitkilerin aktarmak iyi değildir. eski tesislerin daha gelişmiş kök daha kolay bir transfere sırasında zarar olmasıdır.

buğday tohumu dayananlar ve tavşan retikülosit dayananlar: kopya / çeviri sistemine ilişkin olarak, 2 büyük sistemler bulunmaktadır. Bu kitler, örneğin linearize plazmid, unlinearized plazmidler, ya da PCR ürünleri gibi farklı şablonlar kullanabilir. kitleri, aynı zamanda, T3, T7 ve SP6 başlatıcısına özgüdür. Burada tavsiye kiti PCR ürünlerinin ve T7 promotörü ile birlikte kullanılmak üzere uygun olduğunu not edin. Ancak, bilinmeyen nedenlerle, bu sistem ile yapılan bazı radyoaktif işaretli preproteins ithalat deneyinde verimli işe yaramayabilir; Bu tür durumlarda, bir bir buğday tohumu özü sistemi veya plazmid şablonları içindir bir retikülosit lizat sistemi deneyebilirsiniz. Bir de transkripsiyon / çeviri yeniden sonucunu artırabilirÜreticinin el kitabında göre reaksiyon koşulları değiştirerek eylem.

Bu sabah erken kloroplast izolasyon başlamak önemlidir (ya da erken büyüme odasında ışık döngüsü içinde) bozulmamış organellerin izolasyonu engelleyebilir nedeniyle fotosentez kloroplastların içinde nişasta birikimini önlemek amacıyla. kloroplast izolasyon prosedürü gereksiz gecikme olmadan hızlı bir şekilde yapılmalıdır ve izole kloroplastların her zaman soğuk tutulmalıdır. Bu yavaş yavaş iyi değil onların canlılığını kaybeder kloroplast izole gözlem karşı azaltmaktır. Yeni çözülmüş CIB veya HMS tampon kullanıyorsanız, homojen bir çözelti elde etmek Kullanmadan önce iyice tampon karıştırmak için emin olun. bitki malzemesinin homojenizasyonu için en uygun koşullar ampirik olarak kurulmuştur ve farklı doku homojenizer kullanıldığında değişebilir.

Farklı bitki genotipleri simila içeriyorsar klorofil düzeyleri, klorofil miktar ithalat deneyleri yapmadan önce örnekleri normalleştirmek için alternatif bir yol olarak kullanılabilir. Klorofil% 80 izole edilmiş kloroplastlara bir numunenin ekstre aşağıdaki spektrofotometrik tespit edilebilir (h / h) sulu bir aseton ^19,20. Bitkilerin ithalat oranları (örneğin, klorotik fenotipleri ile mutantlar) karşılaştırılmalıdır farklı klorofil içeriğini gösteren Ancak, ithalat tahlillerinde kloroplast örnekleri normalleştirmek sayma kloroplast numarasını kullanabilirsiniz. İyice adımda 3.11 kloroplast tekrar süspansiyon özellikle önemlidir. Yetersiz tabanda ithalat reaksiyonlarında doğru yükleme engel olacak böylece zor numaralar doğru saymaya yapacak kloroplastların, agrega terk edip olabilir. Şiddetli toplama mikroskop altında görüldüğü takdirde Aggregat kadar buz üzerinde kloroplast örnek sallayarak devam (örneğin, 10 kloroplast birlikte katıldı> ile agrega)es kaldırılır. Tampon daha küçük bir hacimde kloroplast tekrar süspansiyon daha kolaydır.

Protein ithalat reaksiyonları (Bölüm 5) nedeniyle radyoaktif doğanın uygun önlemler ile yapılmalıdır farkında olmak önemlidir. Gerekli önlemler şunlardır: izleme ve çalışma yüzeyi ve ekipman dekontaminasyon ve onaylı bir atık konteynerine tüm radyoaktif atıkların bertaraf, tek kullanımlık eldiven, laboratuvar giyim ve koruyucu gözlük takan. Ayrıca doğru ozmotik basınç ithalat reaksiyonları esnasında kloroplast sa¤laml korumak için kritik öneme sahiptir akılda tutmak ve bu esas HMS tampon tarafından yapılmaktadır. 10x HMS yapışkan olduğu için, ilk önce oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır ve daha sonra iyice karıştırıldı ve doğru hacim ölçümü sağlamak için bir kesim pipet kullanılarak uygulanmalıdır. içe reaksiyonunda soğuk metionin olmayan chloropl halinde serbest radyo-etiketli metionin dahil edilmesini önlemek için ilave edilirinkübasyon aşaması esnasında organel çeviri yoluyla ast proteinler, BSA proteazlar için bir alt-tabaka olarak işlev görerek, proteolizi en aza için kullanılır ise.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Murashige ve Skoog bazal tuzu	Melford	M0221
phytoagar	Melford	P1003
2- (N-morfolino) etan sülfonik asit (MES)	Melford	B2002
triton X-100	Fisher	BPE151-500
cerrahi bant (örn.< / em>, Mikro gözenek, 3M)	3M	1530-1
filtre kağıdı	Fisher	FB59023
Percoll	Fisher	10607095
Etilen Glikol Tetraasetik Asit (EGTA)	Sigma	E4378
etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Fisher	D / 0700/53
4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES)	Melford	B2001
filtrasyon bezi (Miracloth)	Calbiochem	475855
50 mL santrifüj tüpü	Fisher	CFT-595-040M
250 mL santrifüj şişesi	Fisher	CFT-891-V
Polytron (örn., Kinematica PT10-35)	Fisher	11010070
Polytron probu (örn., Kinematica PTA20S)	Fisher	11030083
santrifüj (örneğin , Beckman Coulter Avanti JXN-26, 50 ve 250 mL tüpler için)	Beckman Coulter	B34182
250  için sabit açılı rotor; mL şişeler (örneğin , JLA-16.250)	Beckman Coulter	363930
50  için sabit açılı rotor; mL tüpler (örn., JA-25.50)	Beckman Coulter
(örn., JS-13.1)	Beckman Coulter	346963
radyo işaretli [35< / sup>S] metiyonin	Perkin Elmer	NEG072002MC
tavşan retikülosit lizat tabanlı hücresiz çeviri sistemi (TNT T7 PCR DNA için hızlı kit)	Promega	L5540
faz kontrast mikroskobu (ör. , Nikon Eclipse 80i)	Nikon	kullanılamıyor
hemositometre (Geliştirilmiş Neubauer BS748 bölmesi)	Hawksley Technology	AC1000	0,1 mm derinlik, 1/400 mm2
cover camlar	VWR	16004-094	22 mm & kez; 22 mm, kalınlık 0,13-0,17 mm
1,5 mL mikrofüj tüpleri	Sarstedt	72.690.001
2 mL mikrofüj tüpleri	Starlab	S1620-2700
mikrofüj (örn., Eppendorf 5415D)	Eppendorf	kullanılamıyor
Nanodrop 2000 spektrofotometre veya benzeri	Thermo Fisher	SPR-700-310L
glukonik asit (potasyum tuzu)	Fisher	22932-2500
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma	A7906
MgATP	Sigma	A9187
metiyonin	Sigma	M6039
bromofenol mavisi	Fisher	B / P620 / 44
gliserol	Fisher	G / 0650/17
SDS	Fisher	S / 5200/53
Tris Baz & nbsp;	Melford	B2005
ditiotreitol (DTT)	Melford	MB1015
görüntü analiz yazılımı (e., Aida Image Analyzer)	Raytest	kullanılamıyor