Method Article

içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil AAVS1 Odağı

DOI:

10.3791/54718

⸱

November 20th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Institute, Katholieke Universiteit Leuven

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada daha önce tarif edilen sistemler geliştirir insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) arasında AAVS1 lokusunda RMCE göre hızlı ve etkili bir gen düzenleme yöntemi sunulmaktadır. Bu tekniği kullanarak, izogenik hatları hızlı ve güvenilir hPSCs ile transgenesis aracılı araştırma kolaylaştıran, uygun karşılaştırmalı çalışmalar için oluşturulabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hatta CRISPR-Cas9, insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) genetik modifikasyon liderliğindeki gen hedefleme teknolojileri devrimi ile hala zaman alıcıdır. daha hızlı ve off-hedef etkilerine daha az eğilimli Cre veya FLPe gibi siteye özgü hedefli rekombinaz kullanmak yaklaşımlar, yarar olabilir güvenli liman loci entegre transgenlerin ile rekombinant çizgileri kullanıyoruz karşılaştırmalı çalışmalar. önemli ölçüde daha iyi performans gen çoğu yönden hedeflemeyen, her ne kadar bu tür yöntemler, tarif edilmiştir. Çinko-parmak nükleazlar kullanılması, daha önce heterotypic FRT dizileri ile çevrili kaset ifade eden bir GFP-Higromisin-tk içeren hPSCs arasında AAVS1 odağı bir ana hücre hattını oluşturdu. Burada, bu hattı kullanarak FLPe rekombinaz aracılı kaset değişimi (RMCE) gerçekleştirmek için prosedürler açıklanmaktadır. ana cell hattı yükselticisiz bir puromisin direnç içerir ve FLPe rekombinaz bir RMCE verici vektör ile transfekte edilir. hem (Puromycin) pozitif ve negatif (FIAU) seçim programının uygulama rastgele entegrasyonları olmadan RMCE seçimine yol açar. RMCE% 100 verimle 15 D olarak tam anlamıyla karakterize pluripotent poliklonal transjenik çizgiler oluşturur. Son zamanlarda AAVS1 mahalinin sınırlamaları açıklanan rağmen, sistemin kolaylığı, izogenik ayarları hPSC transgenesis önünü açıyor karşılaştırmalı çalışmalar için gerekli olduğunu ve aksi olur fonksiyon analizi kar / zararı yarı yüksek verimli genetik ekranlar sağlıyor çok zaman alıcı olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedeflenen genom rekombinasyon araştırma birçok alanda hızlı gelişmeler kolaylaştırmıştır. Farelerde, genom düzenleme ve kök hücre araştırmaları arasındaki sinerji gen fonksiyonu ve gen regülasyonu karmaşık mekanizması artan bir anlayış için izin verdi. Uzun yıllar insan embriyonik kök hücreleri ilk izolasyonu (hESC), ve indüklenen sonra insan yana, pluripotent kök hücreleri (hiPSCs), gen düzenleme teknik engel oluşturmuştur, ancak böyle bir ilerleme ve ayrıca insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) beklenen . Hedeflenen nükleazlar-Çinko Parmak Nükleazlar (ZFNs), Transkripsiyon aktivatör gibi efektör nükleazlar (TALEN), ya da kullanarak genom mühendisliği son gelişmeler kümelenmiş düzenli palindromik tekrarlar / CRISPR-ilişkili protein 9 (CRISPR / Cas9) bize bu üstesinden gelmek için izin kısa interspaced 3 - zorluklar, etkin sürecini rekombinasyon 1 hedeflenen yapmada.

m spesifik lokusRosa26, Hprt1 veya COL1A1 gibi yan etkiler olmadan daha güvenilir ve her yerde transgen ekspresyonunu sağlar ouse genomu, genetik çalışmalar, performansında önemli bir araç haline gelmiştir. Güvenli liman lokusları izogenik bağlamlarda farelerin farklı çizgileri arasındaki karşılaştırılabilir analiz sağlar. Bu sokma mutajenez, doza bağlı etkileri veya alacalı transgen ekspresyonu gibi iyi bilinen sınırlamalar ile ilişkili standart rasgele entegrasyon yöntemleri kullanılarak elde edilemez. güvenli liman loci Gen düzenleme kolaylığı ve esneklik özellikle (sırasıyla, loxP veya FRT) hedef dizileri tanıyan ve aynı hedefler arasında etkili rekombinasyon katalize Cre veya Flippase (FLPe) gibi alana özgü hedefli rekombinaz kullanımı yoluyla artar. Bu özelliklerinden dolayı, önceden hazırlanmış güvenli liman loci içinde loxP veya FRT dizileri kullanılarak rekombinaz-aracılı gen düzenleme trans fare kullanılan yaygın bir araçtırdoğuşu. Kaset yerleştirilmesi veya özdeş hedef diziler arasındaki aracılı eksizyonunu ek olarak, uyumlu loxP ya FRT sitelerinin kullanılması yeniden bağlayıcının aracı olduğu kaseti değişimi (RMCE) 4 sağlar.

İnsanda, güvenli liman loci yapılmıştır tanımlamaya çalışır. Fare orthologous HPRT, kayıp fonksiyon-Lesch-Nyhan Sendromu ve ROSA26 ile ilişkisi olmasına rağmen hPSCs hedef edilmiştir. HPRT hızla ROSA26 gibi, ESC transgen ifade susturmak ve rapor edilmiştir, transgen ekspresyonunu sürdürme yeteneği 7 - terminal açıdan farklılaşmış hücreleri, 5 araştırılmamıştır. CCR5 geninin homozigot boş mutasyon iyi insanlarda tolere gibi görünüyor, çünkü güvenli liman olarak değer. Değerlendirildi CCR5 hedeflenen ve EKH 8,9 dahil olmak üzere farklı insan hücre hatlarında, istikrarlı transgen ekspresyonunu sürdürmek bildirildi. Ancak,İkincisi, uzun vadeli kültür sırasında klonal düzeyde kanıtlanmış değildi ve her yerde transgen ifadesi üç germ farklılaşmış döl gösterdi değildi. AAVS1, Adeno ilişkili Virüs tip 2 (AAV) doğal entegrasyon sitesi, test edildi transgen nedeniyle rapor direnç yanı sıra hESC, içinde 10 susturulması. Daha sonra, birçok grup, in vitro ve in vivo 2,8,11,12, hem AAVS1 lokusunu kullanılan farklılaşmamış hPSCs sabit transgen ekspresyonunu, ve her üç germ farklılaşmış döl tarif. AAVS1 lokusu farklılaşmamış hESC ve hepatosit döl 13 in vitro değişken transgen inhibisyonunu uygulamak için bulunmuştur olarak son sonuçlar Bununla birlikte, bu bulgular nüans.

rasgele entegrasyon yaklaşımları ve yöntemleri kullanarak ilave tarama çalışmaları Geno bulmak amaçlanmıştır tek kopya entegrasyon belirlemek içinhPSCs genişleme ve farklılaşma 14,15 sırasında transgen susturulması dayanıklı mikrofon entegrasyon siteleri. Genel olarak, şimdiye kadar, hiçbir genomik site tam hPSCs ve döl güvenli bir liman olarak onaylanmıştır; her yerde sabit bir transgen ekspresyonu, hPSCs değil, aynı zamanda in vitro ve in vivo olarak farklılaşmış progeny'lerinde sadece uygun bir site tanımlanması, çözülmesi gerekmektedir. Tüm çalışılan loci arasında ve sınırlamalara rağmen, AAVS1 kalır en iyi karakterize ve kök hücre araştırmalarında en çok kullanılan.

RMCE başarıyla FLPe Cre 17 daha etkilidir endikasyonlar olsa bile, çok Cre rekombinaz kullanılarak, bu lokuslarının 6,7,14,16 bazı hPSCs içinde gerçekleştirilmiştir. Bütün bu durumlarda, bir pozitif ilaç direnci kaseti, yeniden kolonilerin seçimi için kullanılmıştır. Başarılı olsa da, bu işlemler standart gen üzerinde bir teknik ilerlemeyi teşkil etmemektedirZFNs kullanarak düzenleme işlemleri, Talens veya CRISPR / Cas9, gibi tek bir antibiyotik seçimi prosedürü rasgele entegrasyonları ekarte ve doğru hedef klonları tanımlamak için koloni taraması gerektiriyor.

Bu prosedürde, metotlar ile ± 15 gün içinde (önceden hazırlanmış kaset içinde) poliklonal transgenik hatların üretilmesine izin seçimleri, bir (gelen kaset içinde) pozitif kombinasyonunu ve negatif kullanılarak AAVS1 lokusunda hPSCs olarak RMCE gerçekleştirmek için tarif % 100 verim ve rasgele entegrasyon olaylarının ücretsiz. Bu nedenle, bu yöntem hPSCs şu anda açıklanan RMCE teknolojileri ötesinde ilerlemeyi temsil ediyor.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfeksiyon için FRT içeren hPSC Ana Hücre Hattının hazırlanması 1.

  1. Veya hESC veya besleyici içermeyen iPSC orta sırasıyla (Tablo 1) kullanılarak inaktive Fare Embriyonik Fibroblastlar (IMEF) kapalı standart prosedürler altında Kültür HESC / iPSC ana hücre hatları. Her deneysel koşul için 6-oyuklu bir plaka içerisinde hPSCs arasında (besleyiciler üzerine) 2 ya da 1 (besleyici içermeyen) kuyu hazırlayın.
  2. kültürleri gözlemlemek ve hücreler 60 ulaştığınızda -% 70 confluency, plaka ilaca dirençli IMEF (iDR4). Kısaca, kat gerekli% 0.1 jelatin solüsyonu, 0.5 mL, 12 gözlü bir levhanın gözleri ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Plaka 125,000 oyuk başına iDR4s ve inkübe O / N IMEF ortamı (Tablo 1).

Nucleofection tarafından 2. hPSC Transfeksiyon

  1. Ertesi gün, 37 ° C 'de 1 saat süre ile, 10 uM Rho-ilişkili protein kinaz (rock) inhibitörü (Y-27632) de dahil olmak üzere, taze ortam ile HESC / iPSC kültürler önceden inkübe edin. Next, oda sıcaklığına-sıcak öncesi buzdolabı HESC transfeksiyon çözüm almak.
  2. Nucleofection durum başına nucleofection kaplama ortamı (Tablo 1) 1 ml hazırlayın. Oda sıcaklığı 1 mL PBS ile yıkayın, kuyular kapalı IMEF orta alın ve orta kaplama nucleofection 500 mcL ekleyin. Steril 1.5 ml tüpler diğer 500 uL aktarın ve kaplama kadar 37 ° C'de saklayın. Not: 2 pFLPe vektörleri: 0, 2: 1 ve 0: Tipik RMCE deney üç farklı RMCE verici molekül oranına sahip koşulları içerir 1.
  3. tek bir hücre süspansiyonu içine HESC / IPSC çıkarın.
    1. Medya çıkart RT 2 mL PBS ile yıkayın ve sırasıyla, besleyici ya da besleyici içermeyen hPSC kültürleri 1 ml tripsin% 0.05 veya Accutase ekleyin. 37 ° C de 5 (Accutase) dakika - 7 (tripsin) ya da 2 inkübe edin. Accutase tedavisi için - hücreleri gevşek, ama ekli kalmalıdır.
    2. Dikkatle inkübatör gelen ve bir olmadan plakayı çıkarınHücreler ayırmak için llowing, aspirasyon ile ayrışma ajanı kaldırın. 1 ml hESC medya ekleyin ve hafifçe köpüklenme kaçınarak, plaka yüzeyinde medya temizlenerek gevşek hücreleri ayırmak. Hücreler tek bir hücre süspansiyonu olduğundan emin olun.
    3. temiz ve steril bir 15 ya da 50 ml tüp içinde hücreler toplanır. HESC ortam 1 ml ile kuyu yıkayın aynı 15 veya 50 ml bir tüp içinde hücreleri toplamak. (Bir sonraki adımda sırasında) sayma hücre sayım cihazı kullanmak için bir 50 uL kısım alın. Koleksiyonun hacmini not edin ve toplam hücre sayısını hesaplamak. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
  4. 5 ml serolojik pipet ve yumuşak pipetleme ile PBS ile 10 6 hücre / ml ihtiva eden bir süspansiyona hücre pelletini. Köpürtmeyiniz. Temizlemek için deneysel koşul (yaklaşık 2 x 10 6 hücre), steril 15 ml tüpler başına 2 mL aktarın.
  5. santrifüj birlikte, öncedenpFLPe plasmidleri 10 uL maksimum hacminde karışımları Donörün RMCE pare.
    1. Bir temiz, steril bir 1.5 ml'lik tübe pFLPe (6.5 kb) 2.5 ug aktarın. PFLPe vektörüne RMCE donör vektörü 13 1 molekül oranı: 2 ekleyin. Örneğin, 12 Kb RMCE donör vektörünün yaklaşık olarak 10 ug.
  6. tüm adımlarda köpüren kaçınarak, nucleofection devam edin.
    NOT: Bazı hPSC transfeksiyon protokolleri adım 2.4 önce ek IMEF tükenmesi adımı uygulayın. Bununla birlikte, uygulamada, IMEF anlamlı transfeksiyon etkinliğini değiştirmeyen bir süspansiyon içinde küçük bir hücre fraksiyonu olan, ne de non-proliferatif beri bu kirletici rekombinant hücreler oluşturur. Buna ek olarak, bu canlılığı geliştirmek için transfeksiyon işlemi sırasında hızla devam etmek için önemlidir. Bu nedenlerden ötürü, IMEF tükenmesi uygulanmaz.
    1. kaplama ortamı ile iDR4 plaka ve 1.5 ml tüpler kaldırmainkübatör gelen. Bir seferde bir tüp, hücre pelet bozmadan özenle PBS kapalı pipetlemeyin. mümkün olduğu kadar çıkarın. hafifçe pipetleme transfeksiyon solüsyonu 100 uL pelletini. plazmid karışımları içeren 1.5 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın ve hafifçe karıştırın.
    2. kabarcıklar tanıtmak için dikkat, transfector küvetine hücre DNA karışımı aktarın. Program A13 (besleyiciler kültüre hücreleri) ya da F16 (besleyici içermeyen) Nucleofector cihazda küvet tanıtmak ve uygulamak.
      NOT: Diğer transfeksiyon yöntemleri veya Nucleofector cihazları bu programlar ya da transfeksiyon koşulları optimizasyonu gerekebilir.
    3. nucleofection kiti mevcut harcanabilir aktarma pipet kullanarak, küvet geri almak ve kaplama orta 0.5 mL uygulayarak ve tüm hacim aspire içeriğini toplamak. ama nazikçe ve bir harekette, hızla bu adımı gerçekleştirin.
    4. Plaka damla damla 12-wiDR4 ve orta kaplama 500 mcL içeren arşın plaka. Bir sonraki deneysel koşul için 2.6.4 - Tekrar 2.6.1 adımları.
  7. inkübatör bir raf üzerine kültür çanak yerleştirin ve eşit hücre süspansiyonu dağıtmak için yan yavaş yavaş ileri geri hareket ettirin ve yan. Bir sonraki medya değişikliği 24 saat önce hücreler 10 uM ROCK inhibitörü (Y-27632) varlığında kurtarmak için izin vermek için kuluçkaya yatmaktadır.

3. Pozitif ve Negatif Seçim Hücrelerinin Gören RMCE

  1. Günlük değiştirme kültür ortamı (/ oyuk 1 mL) ve 2-3 D transfeksiyondan 100 ng puromycin / ml seçimi ile başlar.
    NOT: pozitif ve negatif seçim Bileşenlerin optimum konsantrasyonu, her yeni oluşturulan hPSC ana hücre hattı için deneysel olarak tespit edilmelidir. Minimal görsel toksisite 7 sonra belirgin olduğu düşük doz (konsantrasyonunu belirlemek için ana hücre hattını kullanarak, bir kill eğrisi 13 gerçekleştirinSeçimin d ancak kültür büyümüş değildir), optimal doz (tüm hücreler seçimi 7 d sonra ölü en düşük konsantrasyon) ve yüksek doz (belirgin toksisite neden konsantrasyon, 2 sonra tüm hücreleri öldürme - 3 d) puromycin ve fialuridin (FIAU) hem de.
    1. HESC orta aspire. 1 mL PBS ile yıkayın. 100 ng / puromycin mL HESC orta ekleyin.
  2. ölümün ve büyüme dengeli böylece hücre büyümesi gözlemleyin. Adım 3.1.1 Aşağıdaki günlük puromycin ile ortamı değiştirmek. 250 ng / ml arasında en fazla 50 ng / mL - büyüme hücre ölümünü gelse olduğunda, 25 bloklarında puromisin konsantrasyonunu artırır. 7 gün - 5 için puromycin seçimini devam edin.
  3. 3-4 d günü 6 post-transfeksiyon etrafında, puromisin seçimi başladıktan sonra, 0.5 uM FIAU ile seçim başlar. Günlük ortamı değiştirmek ve en fazla 7 gün boyunca sürekli FIAU korumak.

RMCE Hatları 4. Genişleme ve Karakterizasyonu

  1. seçim işlemi tamamlandıktan sonra, D14 yaklaşık - 15, dirençli RMCE koloniler mevcut ve yeni RMCE hattı oluşturmaktadır. standart prosedürler (geçit 1, P1) Aşağıdaki 2: 1 oranında toplu olarak ayrıldı.
  2. Plaka (orijinal ana hücre hattı normal kültür koşullarına bağlı olarak ya da besleyiciler kapalı), 12-çukurlu plaka 2 kuyu. daha fazla genişleme, depolama, ya da deneysel set-up (bu işlemlerin hiçbir ek açıklama bu protokol yapılır) ve karakterizasyon için diğeri için bir kuyu kullanın.
  3. P1 hücreleri ayırmak için hazır olduğunda, 2.4'te tarif edildiği gibi tek bir hücre süspansiyonu içine karakterizasyon için çok ayırmak ve 15 ml bir tüp içinde hücreleri toplamak. NOT: hPSC WT kullan hücreleri (genetik modifikasyon) ve karakterizasyonu için sırasıyla negatif ve pozitif kontroller, hem ana hücre çizgisi.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de aşağı doğru döndürün. 1 mL PBS içinde süspanse ve flow sitometri için ikiye bölünmüş örnekve DNA analizi 13.
  5. Analizi 13 (300 uL) Flow sitometri:
    1. % 5 oranında bir nihai konsantrasyona kadar PBS içinde hücrelere fetal buzağı serumu ekleyin. Bir hücre süzgeç ile temiz bir FACS tüp hücreleri aktarın ve buz üzerinde saklayın.
      Not: Hücre canlılığı, bu şartlar altında, yüksek, yani canlı olmayan hücreler (örneğin, 7-AAD veya PI) bir floresan boya kullanmak mümkündür, ancak gerekli değildir.
    2. Hücre analizörü bir akış sitometresinde analiz hemen geçin ve 20.000 kayıt - 30.000 olayları. Analiz için, WT negatif kontrol numunesi kullanılarak GFP veya TDT arka plan çiçeklenme üzerinde kapıları ayarlayın.
  6. DNA analizi 13 (700 uL):
    1. Temiz bir 1.5 ml tüp hücreleri aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de Spin ve süpernatant aspire. Bir ticari kit kullanılarak, DNA ekstraksiyon geçin ve üreticinin talimatlarına uyun. enlem -20 ° C'de kuru topak Mağazaer analizi.
  7. DNA konsantrasyonu ölçün.
    1. 25 dakika -. 15, 150 V 1x DNA jel leke ihtiva eden bir% 2 agaroz jeli üzerinde, Şekil 3'te koşulları ve Tablo 2 13 çalıştırmak PCR örnekleri göre standart PCR reaksiyonları hazırlayın. Bir jel analizörü koşmak analiz edin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AAVS1-spesifik ZNFs kullanarak, heterotipik FRT hedef sekanslarını ihtiva eden tam olarak karakterize HESC / iPSC ana hücre çizgileri oluşturulur ve 13 tarif edilmiştir. FRT ihtiva eden ana hücre hatları ZFN tedaviden sonra pluripotensini ve genom bütünlüğünü muhafaza ve stabil bir şekilde in vitro ve in vivo olarak GFP ifade edilmiştir. RMCE FLPe rekombinazın ve RMCE donör vektörleri (Şekil 1A) ile ana hücre hatlarının kotransfeksiyonu ile gerçekleştirilir. RMCE vektörleri transgen sınırdaş AAVS1 ana hücre hattında olanlar aynı FRT dizilerini içeren Şekil 1B yapısal ifade TDT Pz kullanarak RMCE izler.:. F3-P CAGGS tdTPH-F transfeksiyon sonra hPSC eşit dağılmış hücreleri küçük gruplar oluştururlar iDR4 MEF tabakası ve transfekte hPSC hem GFP yanı sıra geçici TDT (Şekil 1B, D 2) ifade etmektedir. 3 - Hücreler 2 için geri bırakılırseçim başlamadan önce d post-transfeksiyon. Pozitif seçim ilk RMCE donör ekleme lehine amacıyla puromycin düşük doz kullanılarak başlatılır. İlk masif hücre ölümü rekombinasyon geçiren tek hücre yol açabilir, çünkü puromycin sürecini hayatta kalmak için onları yapamaz hale, başında hafifçe uygulanır. İlerleyen günlerde, puromisin konsantrasyonu nonrecombined hücreleri yavaş yavaş ölürken rekombinant hücreler küçük koloniler halinde büyümeye izin vermek için en uygun doz kademeli yukarı kaldırdı gerekmektedir.

3-4 d (D 6 post-transfeksiyon civarında) pozitif seçim başlattıktan sonra, negatif seçim FRT-aracılı rekombinasyon olayları için sadece seçmek için başlatılır. RMCE timidin kinaz (TK) intihar geni kaybı ve dolayısıyla Fialuridin (FIAU) duyarlılık neden olur. Bu noktada uygulanan negatif seçimi, burada 2 küçük kümeler - 4 GFP - / TdT + (RMCE) hücrelerdirBu gibi durumlarda, AAVS1 lokusunda TK gene etkilenmez, çünkü FIAU (Şekil 1B, D 6) için en uygun konsantrasyonları dayanabilecek, rasgele entegrasyon önler. Aynı anda oluşumu FRT aracılı daha sonra karakterizasyonu (Şekil 2B) sırasında rasgele entegrasyon olaylarının olmamasıyla gösterildiği gibi rastgele entegrasyon, son derece düşüktür.

10 post-transfeksiyon, bazı değil tamamen seçilen karma RMCE koloniler (Şekil 1B) bulunabilir - karışık RMCE GFP - daha homojen olurken D 9 ile böylece / TDT + koloniler, büyümeye devam ediyor. RMCE FLPe yokluğunda meydana gelmez ise, kullanılır: (2: 1) - GFP / TdT + RMCE koloniler RMCE verici ve FLPe hem de sadece mevcut olduğu zaman, (2: 0). Gün 13 kadar FIAU Tam seçimi - / TDT + KÜLTÜR - 15 sonrası transfeksiyon homojen bir GFP yol açare. RMCE 15 gün 13 12.8 ± 6.8 (n = 6) Puro R / FIAU R kolonilerinin ortalama verir. / TdT + fenotipi (Şekil 2A) - yeni oluşturulan RMCE hattı (a nonclonal bir hücre popülasyonu içinde bir araya Puro R / FIAU R RMCE koloni) karakterizasyonu Flow cytometry hücrelerin% 100 RMCE GFP mevcut olduğunu teyit etmektedir. Bir flüoresan raportör yapısal ifadesi olmadan RMCE donörler kullanıldığında, elde edilen Puro R / FIAU R RMCE hPSC hattı homojen GFP olduğu -.

nonclonal RMCE hattının PCR tanımlaması tam kasetli değişimini (saptanabilir ana hücre hattının kasetinin izi) gösterir ve ikinci seçim programı RMCE verici ve her ikisi de FLPe salgılayan (rasgele entegrasyon içermeyen çizgileri oluşturduğu vektör) (Şekil 2B). Bu sonuçlar ayrıca s tarafından kanıtlanmışouthern benek ve ek olarak, RMCE hatları pluripotent 13 kalmasını göstermektedir. Bu artık gerekli rasgele entegrasyon genom değerlendirme veya rutin RMCE deneyler sırasında Pluripotency testi ya yürütmek için yapar. Özet olarak, bu protokolü kullanarak rasgele entegrasyon serbest AAVS1 lokusunda hPSC transgenik hücre soyları kolaylıkla% 100 verimle 15 D ve detaylı karakterizasyonu gerek kalmadan elde edilebilir.

figure-results-1
Şekil 1: RMCE şematik genel RMCE seçim programı (A) zaman çizelgesi.. Sol: ana hücre çizgisi (MCL), bir FRT-flanked kaseti GFP ve Higromisin-tk ifade (üçgenler) barındıran FLPe-ifade vektörü ile nucleofection (NF) tarafından transfekte edilir (2A kendini yararak peptidler ile bağlantılı) ve RMCE donör vektörü, wHIch yükselticisiz bir puromisin direnç geni ihtiva eder (raptetme alıcı - SA- Puro R) ve değişken bir deney kaseti (x). Sağ: Puromisinin (kırmızı üçgen) ve FIAU (mavi çizgi) ile seçim tamamlanmasından sonra elde edilen yeni RMCE hattı (RMCEL). (B) RMCE bir kurucu TdT eksprese eden verici ve donör DNA ve FLPe DNA'nın farklı oranları kullanılarak (0: 1, 2: 1, 2: 0) fluoresan mikroskobu ile kontrol (GFP - yeşil floresan, TdT - kırmızı flüoresan), farklı olarak zaman noktalarında. D 2 ve 6: ölçekli çubukları 100 mikron temsil etmektedir. D 10: ölçekli çubukları 200 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2:. RMCE Lines Karakterizasyonu (A) Tayini RMCE byakım sitometri. GFP ve TdT sentezleme WT hattı, ana hücre soyu (MCL) gösterilmiştir ve yeni üretilen RMCE hattı D 15 sonrası nucleofection bir yapısal TdT-ekspresyon vektörü (CAGGS TdT) ile ya da GFP ile vericiler, bir GOOSECOID promotör ile tahrik edilir (GSCp GFP, kesin endoderm işaretleyici) veya bir AAT promotör (APOeAATp GFP, hepatosit işaretleyici). RMCE (B) Onay (5 '/ 3' JA RMCEL), ana hücre hattı (MCL) kaset (5 '/ 3' JA MCL), ve rasgele entegrasyon eksikliği olmaması (5 '/ 3' / FLPe RI ) PCR ile gösterilen primer çiftleri kullanılarak. Donör RMCE vektörü (+ RI), FLPe ifade vektörü ve hiçbir şablon kontrolü (NTC) kullanıldı - RMCE hatları (5 1) WT, MCL, DNA. Değiştirilmiş Şekil (Ordovas ve ark., 2015) 13. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

= "1"> sayfa içinde figure-results-3
. AAVS1 Left RMCE ile Hedefleme RMCE-uygun Usta Hücre Hattı ve Gene Karşılaştırılması Şekil 3. Nesil: Gen hedefleme ana hücre hattı üretimi için Şekil 1A açıklanan bir donör (kaset ile birlikte transfekte edilir değiştirilmemiş WT hücreleri kullanır MCL) ve özel optimize ZFNs. süreç tam karakterizasyon 3 aya kadar sürer tamamlayın. Sağ: RMCE FLPe vektörleri ile vericinin kotransfeksiyonu ile gerçekleştirilir, ve tam olarak karakterize hattı 15 D oluşturulur. AAVS1 Gen hedefleme verimliliği önceki çalışmalarda 1,2 kadardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ays "> medya Bileşenler Nihai konsantrasyon hESC ortamı DMEM-F12, HEPES % 80 Serum yerine ortamı % 20 L-Glutamin 146 mg / ml MEM Olmayan Esansiyel Amino Asitler Çözümü (100x) 1x 2-merkaptoetanol 0.1 mM Penisilin / Streptomisin % 0.1 İnsan bazik FGF 4 ng / ml IMEF kültür ortamı DMEM yüksek glikoz Fetal bovin serumu (FBS) % 15 Penisilin-Streptomisin % 0.1 L-Glutamin, 200 mM 4 mM MEM esansiyel olmayan aminoAsitler Çözelti (100x) 2 kere 2-merkaptoetanol 0.1 mM Aranın kaplanması hESC ortamı 100% KAYA önleyicisi (Y-27632) 10 uM

Tablo 1. Ortam terkip.

tahlil ileri Ters amplikon PCR Döngüsü
5'JA MCL CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC CGTTACTATGGGAACATACGTCA 1.1 Kb 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ° C (-0.5 ° C / çevrim), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ° C, 30 '' - 72 ° C, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
3'JA MCL TAACTGAAACACGGAAGGAG AAGGCAGCCTGGTAGACA 1.4 Kb 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ° C (-0.5 ° C / çevrim), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ° C, 30 '' - 72 ° C, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
5'JA RMCEL CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC 1.1 Kb 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ° C (-0.5 ° C / çevrim), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ° C, 30 '' -72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
3'JA RMCEL TTCACTGCATTCTAGTTGTGG AAGGCAGCCTGGTAGACA 1.5 Kb 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ° C (-0.5 ° C / çevrim), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ° C, 30 '' - 72 ° C, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
5'RI Donör GTACTTTGGGGTTGTCCAG TTGTAAAACGACGGCCAG 0.5 Kb 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ° C, 30' '- 72 ° C, 30' '] X25 - 72 ºC, 5'
3'RI Donör CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC ACACAGGAAACAGCTATGAC 0.5 Kb
RI FLPe CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG GTATGCTTCCTTCAGCACTAC 0.65 Kb 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ° C, 30' '- 72 ° C, 30' '] X25 - 72 ºC, 5'

PCR Genotiplendirme. Ordovas ve diğ., 2015 13'ten Modifiye için kullanılan Tablo 2. Primer ayarlar.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

güvenli liman loci Gen düzenleme yöntemleri hPSCs içinde transgenesis geliştirmek için çok önemli bir araçtır kalır. AAVS1 güvenli bir liman karakteri son zamanlarda bazı uygulamalarda 13,18 sorgulanmıştır rağmen, bu lokus şu anda en iyi insandan türetilmiş hücre soylarında, özelliği kalır. hPSCs kendi sınırlamaları Farkındalık güvenilir veri elde etmek için yardımcı olabilir. Bu nedenle, AAVS1 de gain- ve zarar-fonksiyon çalışmaları veya içinde ve kararlı bir genetik arka arasında bir izogenik bağlam gerektirir faktörlerin uyarılabilir / konstitütif ekspresyon için, örneğin, yararlı bir site olduğu tahmin edilmektedir.

AAVS1 odağı ZFNs, Talen veya CRISPR / Cas9 1,2,19 kullanarak birçok grup tarafından hedef olmuştur. Bu nükleazlar önemli ölçüde belirli bir lokusunda homolog rekombinasyon etkinliğini artırmaktadır. Ancak süreç ekrana ve tam rastgele INTEG serbest doğru hedeflenen klonlar, karakterizerasyon ve pluripotensini korumak ve (optimize gen düzenleme araçlarını kullanarak) 3 ay (Şekil 3) kadar sürebilir bütünlüğünü genom. Son iki hedef dışı nükleaz aktivitesi ile üretilen mümkün mutasyonlar neden olabilir. Burada kullanılan RMCE sistemi, ancak, rekombinaz spesifik hedef diziler AAVS1 lokusuna önceden hazırlanmış bir kez, iki hafta içinde bu amaca ulaşmak için, hızlı, verimli ve zarif bir yöntem sunmaktadır. Pozitif / negatif seleksiyon ve uygun bir seçim programının kullanımı RMCE tarafından AAVS1 lokusunda gen düzenleme basitleştirilmesi katkıda bulunan ana faktörlerdir.

Yeni transgenik hatların Genotipik karakterizasyonu anlamlı (hayır klonal tarama gerekli) azalır ve hedef dışı nükleaz aktivitesi ile ilişkili karakterizasyonu nedeniyle FRTS için FLPe özgüllüğüne vazgeçilebilir hale getirilir. karakterizasyonu da göstererek, rutin RMCE deneylerinde azaltılabilirTam kaseti değişimi ve rasgele entegrasyon eksikliği ile yeterli PCR (Şekil 2B) ile gösterilmiştir, çünkü ana hücre hattı (Şekil 2A) GFP ekspresyonu tamamen kaybedilmesi ve Southern blot 13. pozitif / negatif seleksiyon kullanımı da önceki raporlar ile temel fark oluşturmaktadır. Daha önce AAVS1 veya diğer lokusundakı ya hPSCs bölgesindeki RMCE açıklanan çeşitli gruplar, tek bir pozitif seçim adımı 7,14,16 kullanılabilir. koloni taraması eşit klonal düzeyde doğru entegrasyon ve rasgele entegrasyon yokluğunu göstermek amacıyla yapılmalıdır, çünkü bu, nükleazlara ile yapılan gen düzenleme üzerinde önemli bir teknik avantaj teşkil etmez.

Birden HESC / iPSC satırlarında RMCE sisteminin kullanımı her bir bağımsız hattının AAVS1 lokusunda tarif FRT içeren kasetin preintegration gerektirir. Bununla birlikte, bir kez oluşturulanonun hız ve basitlik mümkün teknik olarak çok zaman alıcı olacaktır aksi takdirde yukarıda belirtilen uygulamalar için tanımlanan izogenik ayarlarında yarı yüksek verimlilik genetik ekranlar geliştirmek için yapar. Buna ek olarak, tüm RMCE vektörleri ZFNs ile lokusunu hedeflemek için kullanılabilir pZ AAVS1 gen hedefleme vektörü içinde inşa edilmiştir, ancak TALENS veya CRISPR / Cas9 da bildirilmiştir. RMCE Vector ikilik veya FRT olmayan hPSCs bir kararlı transgen için birden fazla satır üretmek için son derece yararlıdır. Örneğin, tek bir vuruş ideal sonuçları doğrulamak için birden çok hPSC hatları test edilmesi gerekir RMCE tarafından gerçekleştirilen belirli bir genetik ekran başarılı gösterdi. Birden RMCE-müsait ana hücre hatlarının yokluğunda, nükleazlar kullanılması isabet hedefleme doğrudan gen gerçekleştirilebilir. RMCE vektörleri ikili karakteri yarar Grubumuzun 20 tarafından kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, gen rötuşu hastanın türevi içinde gerçekleştirilmiştirFrontotemporal Demans (FTD) PROGRANULIN (PGRN) ifade eksikliği yol açan bir mutasyon taşıyan iPSCs. PGRN seviyeleri restore eden bir kaset bölgesinin AAVS1 lokusunda ZFNs aracılı sokulması ile gen tamamlama, mutasyon varlığı ile ilişkili kortikogenezin kusurlu fenotipi giderilmiştir. Buna ek olarak, benzer bir dizisi, eksojen PGRN ifadesi için bir kontrol olarak kullanılmak üzere WT hESC RMCE göre oluşturuldu.

Rekombinant kolonilerin yokluğunda, RMCE verici vektör transfeksiyon kontrol edilmesi. % 30 daha üstün transfeksiyon verimliliği yukarıda belirtilen sonuçlar. Alt transfeksiyon verimliliği rekombinasyon verimliliği azaltmaktadır. Son olarak, RMCE sistemi AAVS1 lokusunda elde edilmiş, fakat herhangi bir başka mahale uygulanabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.O., IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04 ve Aragon Hükümeti FMI048/08 tarafından finanse edildi; IWT bursu SB-121396 tarafından RB; MP, FWO 1288714N tarafından; ve R.S. Hollanda Diyabet Vakfı tarafından. N.H., J.V., K.C. ve Q.C. IWT bursları SB-121396, SB-101230, SB-91228 ve SB-093228 tarafından desteklendi. C.M.V.'ye finansman FWO G.0667.07, G.0975.11 ve KU Leuven'den (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO'dan (266777) sağlandı.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DR4 Fare Embriyonik Fibroblastları (MEF)AMS bioGSC-6204Gbesleyicilerde hPSC kültürü
CF-1 MEF, mitomisin-C ile muamele edilmişAMS BioGSC-6001M
EmbryoMax %0.1 Jelatin ÇözeltisiMilliporeES-006-BiMEF kaplama
DMEM/F-12, HEPESGibco31330-038
Nakavt Serum Replasmanı

Gibco10828-028
L-GlutaminSigma AldrichG8540hESC ortamı
için L-Glutamin, 200 mMGibco25030-081iMEF ortamı
için 2-Merkaptoetanol, 50  mMGibco31350-010
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)Gibco11140-035
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15140122
Çözelti İçinde İnsan temel FGFPeprotech100-18C
Y-27632VWR688001-500
DMEM Yüksek GlikozGibco41965-039 
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma AldrichF7524
Tripsin-EDTA (%0.05), fenol kırmızısıGibco25300-054hPSC besleyicilerde kültür
Matrigel, hESC nitelikliVWR734-1440
mTeSR1 komple orta kitiKök hücre teknolojileri05850Besleyicisiz kültür için
StemPro Accutase Hücre Ayrışma ReaktifiGibcoA1110501Besleyici içermeyen kültür için
Çözelti içinde Y-27632VWR56726
İnsan Kök Hücre Nükleofektör Kiti 2LonzaVVPH-5022
Puromycine DihidroklorürGibcoA11138-03
FIAU (Fialuridin)ABX2910
Higromisin BSigma AldrichH3274
pFLPe: Puromisin RMCE donörlerini çıkarmak için pCAGGS-FLPe'den (MES4488, Açık Biyosistemler)
-pZ donöründen AAVS1 < / em >puromisin vektöründen (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich) modifiye edildi 13< / sup
>5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Hücre SüzgeciFalcon352235
PureLink Genomik DNA kitiInvitrogenile
GoTaq Flexi DNA PolimerazPromegaM8298
AgarozSigmaA9539
SYBR Güvenli DNA Jel LekeInvitrogenS33102
Nükleofektör 2b CihazıLonza (Amaxa)AAB-1001
NükleoSayıcı NC-100KemometecNC-100
BD FACS KantoBD Biyoloji Bilimleri337175
NucleoCassetteChemometec941-0002
modifiye edildi K182001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat. Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
  2. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Baer, A., Bode, J. Coping with kinetic and thermodynamic barriers: RMCE, an efficient strategy for the targeted integration of transgenes. Curr. Opin. Biotechnol. 12 (5), 473-480 (2001).
  5. Sakurai, K., et al. Efficient integration of transgenes into a defined locus in human embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 38 (7), e96(2010).
  6. Irion, S., et al. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  7. Di Domenico, A. I., Christodoulou, I., Pells, S. C., McWhir, J., Thomson, A. J. Sequential genetic modification of the hprt locus in human ESCs combining gene targeting and recombinase-mediated cassette exchange. Cloning Stem Cells. 10 (2), 217-230 (2008).
  8. Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat. Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
  9. Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol. 25 (11), 1298-1306 (2007).
  10. Simth, J. R., et al. Robust , Persistent Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Is Achieved with AAVS1-Targeted Integration. Stem Cells. 26, 496-504 (2008).
  11. DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
  12. Qian, K., et al. A simple and efficient system for regulating gene expression in human pluripotent stem cells and derivatives. Stem Cells. 32 (5), 1230-1238 (2014).
  13. Ordovás, L., et al. Efficient Recombinase-Mediated Cassette Exchange in hPSCs to Study the Hepatocyte Lineage Reveals AAVS1 Locus-Mediated Transgene Inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  14. Du, Z. -W., Hu, B. -Y., Ayala, M., Sauer, B., Zhang, S. -C. Cre recombination-mediated cassette exchange for building versatile transgenic human Embryonic Stem Cells lines. Stem Cells. 27, 1032-1041 (2009).
  15. Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high β-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (1), 73-78 (2011).
  16. Ramachandra, C. J., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange at the AAVS1 locus in human embryonic stem cells using baculoviral vectors. Nucleic Acids Res. 39 (16), e107(2011).
  17. Takata, Y., Kondo, S., Goda, N., Kanegae, Y., Saito, I. Comparison of efficiency between FLPe and Cre for recombinase-mediated cassette exchange in vitro and in adenovirus vector production. Genes to Cells. 16 (7), 765-777 (2011).
  18. Mizutani, T., Li, R., Haga, H., Kawabata, K. Transgene integration into the human AAVS1 locus enhances myosin II-dependent contractile force by reducing expression of myosin binding subunit 85. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (2), 270-274 (2015).
  19. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  20. Raitano, S., et al. Restoration of progranulin expression rescues cortical neuron generation in an induced pluripotent stem cell model of frontotemporal dementia. Stem Cell Reports. 4 (1), 16-24 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombinase mediated Cassette ExchangeAAVS1 LocusHuman Pluripotent Stem CellsFLPe RecombinasePuromycin SelectionFIAU SelectionNucleofection TechniqueFlow Cytometry AnalysisPCR CharacterizationIsogenic Settings

Related Articles