Yöntem makalesi

ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

DOI:

10.3791/54719

⸱

17 Kasım 2016

 ,  , 
1Department of Biology, York University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, iki yeni açık kaynaklı ImageJ eklentisi aracılığıyla hemositometre ve migrasyon/invazyon mikrograflarının miktar tayinini açıklamaktadır: Hücre Konsantrasyonu Hesaplayıcısı ve migrasyon tahlili Sayacı. Ayrıca, görüntü alma ve kalibrasyon protokollerini açıklar ve eklentilerin giriş gereksinimlerini ayrıntılı olarak tartışır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlık ImageJ National Institute güçlü, serbestçe kullanılabilir görüntü işleme yazılımı paketidir. ImageJ çeşitli biyolojik partiküller saymak için etkili bir şekilde kullanılabilir kapsamlı parçacık analizi algoritmaları. hücre örneklerinin çok sayıda sayım yaparken, hemositometre zaman açısından bir darboğaz sunar. Aynı şekilde, ImageJ eklentisi Cell Counter ile göç / işgali deneyleri gelen zarları sayma doğru olsa da, bilek ağrılarına sebep için son derece emek yoğun sübjektif ve rezil. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz otomatik hemasitometre (ya da bilinen hacim) ve göç / işgali hücre sayımı tek görev için ImageJ içinde iki eklentileri geliştirmiştir. Her iki eklentileri minimum arka plan ile yüksek kalitede mikrograflar elde etmek yeteneğine güveniyor. Bunlar, kullanımı kolay ve sayıları kalibrasyonunu yardımcı olmak için yerleşik analiz araçları ile geniş örneklem boyutları hızlı sayım ve analiz için optimize edilmiş. Çekirdek prensibini birleştirerekotomatik sayım algoritması ve sonrası sayma analizi ile Cell Counter s, bu büyük ölçüde göç deneyleri doğruluk kaybı olmaksızın işlenebilir kolaylığını artırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro hücre sayımı olarak doku kültürü deneyleri, geniş bir aralık içinde bir önemli temel bir tekniktir. Doğru bir kültürde hücre sayısının belirlenmesi deney tekrarlanabilirlik ve standardizasyon 1,2 için gereklidir. Hücre sayımı bir hemasitometre kullanarak yanı sıra otomatik çeşitli yöntemler, kendi avantajları ve dezavantajları 3,4,5 her kullanılarak elle yapılabilir. hücre sayımı için otomatik yöntemlerin çoğu iki sınıfa Coulter prensibini kullanın veya akım sitometri olanların birine ait. Coulter sayaçlar hücre sayısını ve boyutunu belirlemek için hücreler elektriksel direnç yararlanmak. Onlar akış sitometrelerinde daha hızlı, doğru ve ucuzdur. Ancak, nadiren manuel sayım 3 ile karşılaştırıldığında nedeniyle önemli ölçüde eksiksiz tek hücre sayımı için kullanılır. Öte yandan, sitometre akış pahalıdır fakat, hücre sayımı, hücreler şekil, st analizi maddesi olarakkezlerinin ve ölçüm dahili hücre 4,5 işaretleme kalemler. Bu iki ilke birini kullanın makineler birçok üretici edinilebilir. Otomatik yöntemler elle sayım için gerekli zamanın bir kısmı ile geliyor ama pahalı makineler 6 kullanırken manuel sayım uygun fiyatlı ama zaman alıcı ve önyargı tabidir.

Diğer yaygın hücre kültür işlemleri in vitro hücre motilite deneyleri, yani, hücre göçü ve yayılması 7 bulunmaktadır. Yer değiştirmesine ve istilasma deneyler genellikle bir kemotaktik yanıtı yanıt olarak, hücre motilitesinin ve invazyon araştırmak için kullanılır. Buna ek olarak, yaygın olarak birden fazla hücre tipleri 7-11 embriyonik gelişimi, farklılaşma, enflamatuvar yanıtı ve metastazı çalışma için kullanılır. Bir göç testinin gözenekli zarından göç veya işgal Hücreler iki farklı şekilde belirlenebilir. İlk olarak, bir floresan boya ile boyanması, ayrışma ile sağa solaBir floresan okuyucu 12 kullanılarak membran ve miktarının m. Miktar, bu yöntemin bir sınırlaması bir kayıt membran muhafaza edilebilir ve daha fazla analiz 13 imkanı olmasıdır. Taşınan ikinci ölçümü yöntemi / sabit ve kristal viyole, toluidin mavisi veya hematoksilen olarak sitolojik boyalar ile daha sık floresan boya veya, ile boyanmış hücrelerin işgal edildi; Daha sonra hücreler elle çok zaman alan bir görev 12,13 olan bu membranların ters mikroskopik görüntüleri kullanılarak ölçülür.

kılavuzu hücre sayımı dezavantajlarını aşmak için, hücre konsantrasyonu ve göç deneyi için iki güvenilir ve doğru otomatik hücre sayaçları geliştirilmiştir. Bunlar otomatik hücre sayıcı algoritmaları Oracle'ın Java bilgisayar dili kullanarak bir eklenti olarak ImageJ için geliştirilmiştir. ImageJ Hea Ulusal Enstitüsü tarafından geliştirilen bir kamu ve yaygın kullanılan görüntü işleme aracıdırinci (NIH) 14,15; böylece, ImageJ için bu eklentileri yazma biyolojik topluluk içine kolay entegrasyon kolaylaştırır.

hücre sayımı otomasyonu elle sayım kıyasla yüksek üretim ve tekrarlanabilirlik sağlar. Diğer uygun yazılım ve eklentiler görüntü analizi 5,16,17, hücre konsantrasyonu Hesap eklenti aracılığıyla hücre konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilir, ancak hızlı ve aynı zamanda hücre ve tedavi dilüsyonları işleyebilir. Ayrıca, bu iki sayaçları tüm sonuçlar ve hesaplamalar kaydedilir ve ihraç edilebilir. Bu yazıda anlatılan iki eklentileri diseksiyon kapsamı kullanımı yoluyla canlı hücre görüntüleme ve göç tahlil membranların için büyük görüş alanı (tüm membran yakalama) görüntüleme için bir faz kontrast mikroskop kullanımı için optimize edilmiştir. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins: eklentileri yükleme talimatları indirmek için serbestçe kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bileşik Mikroskop ve Kamera Ayarı (Hücre Konsantrasyon Hesaplama)

  1. Işık ayar düğmesi ile tam ampul parlaklığını artırmak 4X objektif lens geçmek ve faz kontrast filtreleri seçilmiş olduğundan emin olun.
    NOT: koyu arka plan ile doku kültürü için herhangi bir ters faz kontrast mikroskop, örneğin, PhP faz kontrast, standart mikroskop ve kamera prosedürleri takip kullanılabilir.
  2. mikroskop yazılım içinde, varsayılan değerlere görüntü yakalama ayarlarını.
    NOT: Bu ayarların yerini bulmak için mikroskop kullanım kılavuzuna başvurun.
    1. 'Parlaklık', 'kontrast' ve% 100 'doygunluğu' ve 'gama' ve 1.0 'kazanç' olarak ayarlayın.
      NOT: yazılıma bağlı olarak, 'parlaklık' ve 'kontrast' bir% 0 değeri yerine% 100 varsayılan.
    2. Set görüntüler siyah ve beyaz yüksek çözünürlüklü availabl kullanarak çekileceke (1600 x 1200 piksel (px) veya daha fazla).
      NOT: Siyah ve beyaz ayar kullanılamaz ise% 0 'doyma' yeterlidir.
  3. Mikroskop sahneye bir standart hemasitometre yerleştirin ve (Şekil 1A) 'de gösterildiği gibi bir görüntü yakalamak; Bu 'Ses Kalibrasyon görüntü "dir. gerektiği gibi poz zamanlamasını ayarlayın.

2. Görüntü Ses Kalibrasyon

  1. Açık ImageJ ve Eklentiler menüsünden, Hücre Konsantrasyon Hesaplama (CCC) eklentisi, örneğin, Eklentiler> Analiz> 'Hücre Konsantrasyon Hesaplama' başlar.
    1. Sağ tarafının 'Görüntü Ses Kalibrasyonu' paneli görünür değilse, bunu göstermek için 'kalibre' üzerine tıklayın.
  2. ImageJ, 'Get Görüntü Dimension' düğmesine adım 1.3 ( 'Dosya'> 'Aç') dan ve CCC tıklama 'Cilt Kalibrasyon görüntüsünü' açın.
    NOT: Bu, hem Görüntü dolduracaktır Genişlik veotomatik piksel görüntü çözünürlüğü ile Yükseklik metin kutuları.
  3. ImageJ, seçim araçları 'Düz Hat Aracı' sonraki seçin ve tıklayıp imleci sürükleyerek (Şekil 1B) gösterilmiştir -Kare hemositometre birincil (P) tüm uzunluğu boyunca düz bir çizgi çizin.
    1. Düz çizgi ölçümleri içeren Sonuçları penceresini görüntülemek için 'M' tuşuna basın. CCC 'P-kare Uzunluk' metin (Şekil 1B) içine Süre sütunundaki değeri yazın.
    2. çıkışına 'Resim Volume hesaplayın' düğmesine Görüntü Ses metin içine resim hacmini tıklayın. Görüntünün hacmi zaten bilinen Alternatif olarak, Görüntü Ses metin içine nL hacim yazın.
  4. 'Kaydet' butonuna tıklayın.
    NOT: Eklenti şimdi kalibre edilir.

3. Kamera Pozlama Kalibrasyon

  1. için aşağıdaki hücre hasathemasitometre bir odasına hemasitometre, yük hücreleri 10 mcL yoluyla sayma ve mikroskop sahneye yerleştirin.
  2. hemasitometre arka plan çizgileri kaybolur, böylece adım 1.2 den aynı ayarları kullanarak, pozlama süresini ayarlayın.
    1. Hücrelerin iç merkez enine hücre bölümüne değil, kutuplar içinde odağı belirten hücre zarı daha koyu olacak şekilde odağı ayarlayın.
    2. Dahası hücreler aşırı pozlanmış olmayacak şekilde pozlamayı ayarlayın ve (Şekil 1C) tasvir benzemektedir.
      NOT: Biraz görünür hemositometre hatları kabul edilebilir. Doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlamak için bu ayarları kaydetmek veya kayıt tavsiye edilir.

4. Görüntü Alma

  1. Her hücre örneği için, hemasitometre her iki kanadında içine yük 10 uL istatistiksel çıkarsama gücünü 2 artırmak. Mikroskop sahnede hemasitometre yerleştiringörüntüleme için.
    NOT: Her resmin çözünürlük ve büyütme 'Ses Kalibrasyon görüntü' aynı olmalıdır. eklenti seçilen herhangi bir klasörün tüm görüntüleri sayar; tutmak görüntüler aynı klasörde birlikte sayılacak.
    1. Bir dosya adı otomatik artış işlevi varsa, açın ve her resim yeteneğini artırmak için ele geçirdikten sonra gösterilen olmadığından emin olun.
      NOT: El tasarruf ve büyük ölçüde süreci yavaşlatacak her görüntüyü kapatarak. otomatik artışlı fonksiyonunun kullanılabilirliği hakkında bilgi almak için mikroskop kullanım kılavuzuna başvurun.
    2. daha fazla (5-10) doğruluğunu artırmak için tavsiye edilir, ancak hemasitometre merkez bölgenin en az üç örtüşmeyen görüntüler çekin.
      NOT: Hücreler her iki noktada yoğunluğunda artış eğilimi olarak üst ve odaların alt alanlarını hem kaçının. Her bölme için görüntülerin aynı sayıda alır. Bu sayım sırasında eklenti düzgün işlemesi için gereklidir.

5. Görüntü Sayım ve çözeltiler

  1. CCC, 'Hücreler Kont' tıklayın ve Dizin Seç iletişim kutusunu gözlemleyin. Bir klasör seçin sayılacak.
  2. Bir klasörü seçtikten sonra örneklem sayısı giriş kutusuna dikkat edin. Odasının başına alınan görüntülerde, yani 4.1.2 numarasını girin ve 'Tamam' düğmesine tıklayın. eklenti artık alfabetik sıraya göre seçilen klasördeki tüm jpg, tiff ve png görüntüleri sayacaktır.
    NOT: 'Örnek Görüntüleyici' düğmesine tıklamak sayılan örnekleri hakkında bilgi görüntüleyen örnek Görüntüleyicisi penceresini getirecektir. Örnek konsantrasyon odasının başına alınan tüm görüntülerin ortalama konsantrasyonu. birimsiz konsantrasyonlu örnekleri, örneğin bir ilaç veya küçük molekül tedavi ek olarak, bu listeye eklenebilir.
    1. konsantrasyonları aynı örneklerin (bölüm 4) sayar içinde önemli ölçüde değişebilir, eğer hücre örnekleri anlatmak.
      NOT: Tüm için dilüsyonları hesaplamak için to sayılır-örnekleri, CCC otomatik formül C1 V 1 = C 2 V 2 kullanır.
  3. İlave bir 96-yuvalı plakanın + 1, 30 kuyu içine tohum 200 uL başına 15,000 hücre senaryoyu kullanın:
    1. 'Ul' bitişik açılan kutu birimi değiştirme, 15.000 C2 etiketin sağında ve 200 konsantrasyon hacmi metin için metin kutusunu ayarlayın.
      NOT: eklenti sonuçta hücre / ml konsantrasyonu hesaplar.
    2. Emin hacim açılan kutu V2 seçti (son hacim) yapmak ve sağa metin hacim birimi birleşik giriş kutusunda 'uL' seçerek, 6200 (200 uL x (30 + 1)) girin.
  4. sol alt liste kutusuna şu anda girilen seyreltme eklemek için 'Hesapla Seyreltme tıklayın.
    Not: eklenen her seyreltme için her bir örnek için çözülecek ve sağa üç diyagram gösterilir. Her giriş çift tıklayın genişletmek için.
  5. tıklanması to Örnek Görüntüleyici 'düğmesinin altındaki' Kaydet 'düğmesine tüm örnek veriler ve dilüsyonları dosyaya yazmak için.
  6. NOT: Bu veriler 'Load' tıklayıp kaydettiğiniz dosyayı seçerek herhangi bir zamanda telafi edilebilir.

6. Göç ve işgali (Sayaç)

  1. Standart Boyden çemberinin yöntemi 7-9 ile göç ve istila testlerini gerçekleştirmek.
  2. Hücreler göç etmiş sonra / işgal dikkatle tersini hafifçe dokunarak insert içinde ortamı çıkarın. Fitil uzakta herhangi bir aşırı medya bir kağıt havlu kenarı dokunarak zarın altına yapıştırılır.
    NOT: Bu yapışmış hücreleri çıkarmak olabilir, havlu membran kendisi dokunmayın.
  3. Fix ve farklı çözümün ~ içeren her satırında kurmak 24 plaka 500 ul bildirilen 7-9 olarak hücreleri leke, örneğin, sabitleyici, Leke 1, Leke 2 ve çift distile su (GKD 2 O). 1x PBS t ikinci bir tabak dolduruno kesmeden önce de ekler yerleştirin.
  4. Inversiyon hücreleri uzak sürüntü önce suyu boşaltın GKD 2 O ile dolu kuyulara içine yerleştirerek ekler yıkayın ve GKD 2 O. ile elemanını doldurun.
  5. zara zarar verilmemesine zar özen göstererek üst un-göç / un-işgal hücreleri çıkarmak için temiz bir pamuk aplikatör kullanın. membran kenarlarında eksiksiz olması.
  6. temiz bir cam slayt üzerine membran (alt tarafı yukarıya) aktarmak dikkatli bir şekilde jilet veya neşter kullanılarak membran kesin ve.
  7. altında ve membran üzerine monte çözeltinin küçük bir damla ekleme ve ince kapak kayma ile kaplayın.
    NOT: sayım doğruluğunu korumak için montaj çözümü içinde kabarcığı kaçının.

7. Kapsam ve Kamera Kurulumu Kesme

  1. mikroskop ışık kaynağı ve kamera açın.
    NOT: Ayrıntılı yönergeler için mikroskop kullanım kılavuzuna başvurun.
  2. Zekâmikroskop yazılım, set görüntü yakalama ayarlarını hin varsayılan değerlere.
    NOT: Bir ortalama fonksiyonu varsa, dört kişilik bir değer tavsiye edilir. Bu ortalama ve görüntü elde etme zamanı derecesi arasında iyi bir uzlaşma olduğunu. Aynı şekilde, keskinleştirme küçük bir derece görüntü vefa artabilir.
    1. 'Parlaklık', 'kontrast' ve% 100 'doygunluğu' ve 'gama' ve 1.0 'kazanç' olarak ayarlayın.
      NOT: yazılıma bağlı olarak, 'parlaklık' ve 'kontrast' bir% 0 değeri yerine% 100 varsayılan.
    2. maksimum ayarlarına ekran (gerçek zamanlı) ve çekim çözünürlüğü (1600 x 1200 px ve 2592 x 1944 px, sırasıyla).
      NOT: Ekran çözünürlüğü yenileme hızı çok yavaş ise gerektiği gibi ayarlanabilir. Alt kararlar daha zor doğru odaklanmak için yapmak, ancak yenileme hızını artıracaktır.
  3. Diseksiyon kapsamı aşaması için, beyaz bir katı backgro kullanımıund; siyah veya cam arka yetersizdir.
  4. sağa iki esnek LED ışıklar, tercihen yukarıda sahne ışık kaynağı kullanın ve sahnenin sol.
    NOT: ışık kaynağı olumsuz sonraki sayımların doğruluğunu etkileyebilir göç tahlil zarı içinde gözenekleri yanacaktır aşağıda sahnede A.
  5. sahneye tamamlanmış göç deneyi membran slayt yerleştirin. Tek bir membran kenarları sadece kameranın görüş alanı içinde olması için yazılım tarafından görüntülenen gerçek zamanlı görüntü baktığımızda, yakınlaştırma ayar düğmesi ile büyütmeyi ayarlayabilirsiniz.
    NOT: Bir cam levha üzerine slayt yerleştirilmesi üstünlük beyaz arka sahne daha kolay görüntüleme için slayt manevra yapar.
  6. Mümkün olduğunca yakından Şekil 2A tasvir ideal bir görüntü üretmek için ışık kaynağı pozisyonları (7.6.1) ve pozlama süreleri ayarlayın. parlaklığına bağlı olarak, 5-60 ms maruz kalma süreleri yeterli olmalıdır.
    NOT:Amaç görünür hücre kaybına yol açan mümkün olduğunca az arka plan rengi ve yani görüntü vefa, düşürmeden bir homojen aydınlatmalı membran aşırı maruz bir görüntü elde etmektir.
    1. slayt düşük açıda sol ve sağ ışık kaynağı yerleştirin. Bu arka plan leke ve kromatik sapmaları kaldırmak yardımcı olacaktır. diğer tam karşısında her ışık kaynağı tutmaya çalışın.
      NOT: pozisyona her ışık kaynağı manevra yaparken, diğer kapatın. Bu kendini daha kolay ve doğru zar üzerine aydınlatma alanını ortalamak için yardımcı olur.
  7. slayt ve beyaz dengesini mikroskop yazılımı tek bir düğmeye tıklama kullanarak görüntü çıkarın.
    NOT: Mikroskop şimdi kalibre edilir. ileride kullanmak üzere mümkün olduğunca çok sayıda ayarları kaydedin ve ışık kaynağı pozisyonları ve yoğunluğu dikkat ediniz.

8. Görüntü Alma ve Flatfield

  1. yazılım içinde, setyakalama klasör konumu ve yakalama membranı başına bir resim. Genel şablona aşağıdaki görüntüleri Adı: Ad - böylece 001.tif ve - örneğin ###, Denetim - 001.tif, Denetim - 002.tif Test ilaç.
    NOT: En iyi görüntü sonuçları elde etmek için, örneğin jpeg gibi diğer kayıplı formatlar üzerinde tiff gibi görüntü dosya türü kaydedin.
    NOT: Görüntüler hala sayılacaktır genel şablonu takip etmiyor ama otomatik gruplama ve düz Fielding tabi olmayacaktır.
    1. flatfield düzeltme isteniyorsa, her slayt için boş bir alan bulmak ve adlandırma kuralı aşağıdaki Boş görüntü çekmek: İsim - Boş.
      NOT: Boş bir hayır membran içerir ve arka plan aydınlatma temsil slaytta bir alandır.
    2. Hemen görüntüleme önce, lamel üzerinde baskı uygulayarak her membran düzleştirmek ve mümkün olduğunca çok sayıda tuzak kabarcıklarını çıkarmak.
  2. ImageJ, plugin gidin ve TC eklentisi açmak; Örneğin, Eklentiler>> & # Analiz39; Transwell Sayaç '.
  3. TC içinde, 'Flatfield' butonuna tıklayın ve Dizin Seç iletişim kutusunu gözlemleyin. Membran görüntüleri kaydedildi klasörü seçin.
    Not: Yukarıdaki genel şablonu ile kaydedilmiş Sadece görüntüleri otomatik olarak düzeltilir ve seçilen klasör içinde Flatfield adında yeni bir klasöre kaydedilir flatfield edilecektir. Bir flatfield düzeltilmiş görüntünün bir örnek için Şekil 2B bakın.

9. Yapılandırma Ayarları

  1. Bir göç deneyi membran ImageJ görüntü ( 'Dosya'> 'Aç') seçin ve Image> Adjust> 'Renk Eşiği ...' açın. Görüntünün filtre edilecek hangi renklerin ayarlamak için Renk Eşiği penceresini gözlemleyin.
    1. Pencerenin alt, 'RGB' (kırmızı, yeşil, mavi) olarak ayarlanmış Eşik yöntemi 'Shanbhag' için, 'Beyaz' Eşik renk ve renk uzayı at; seçtiyseniz işaretini kaldırın Koyu arka plan.
    2. üst ayarlayıntıklayıp 255 0 belirteçleri ve alt kaydırıcıları sürükleyerek sürgü (255 dip kaydırıcıları bırakın). Görüntü tamamen beyaz olduğundan emin olun.
  2. Sadece çekirdekler görünene kadar yeşil ve kırmızı üst sürgü ayarlayın.
    NOT: Kullanılan hücre leke üzerine tamamen değişecektir seçilen ayarlar. Şekil 2c 'ye bakınız.
  3. TC eklenti, giriş ilişkili Yapılandırma Ayarları 'RGB Eşik' metin kutularının içine RGB üst sürgü değerleri. 'Ekle / Değiştir' düğmesine tıklayın ve yapılandırmayı üzerine.
    1. 1 ile Çap Aralığı Alt ve Üst değerlerini bırakın - Infinity.
  4. Yapılandırma Ayarları panelinde, sabit sürücüye ayarları yazmak için 'Kaydet'i tıklayın.

10. Sayma Görüntüleri ve Kalibrasyon

  1. TC eklentisi (8.2) açın ve 'Klasör Kont' tıklayın ve Dizin Seç iletişim kutusunu gözlemleyin. klasörü seçin sayılacak birbitirmek için nd bekleyin.
  2. Her sayılan-numune otomatik olarak ana tabloya eklenir. Anahtar sütunlar 'Kont', 'Kalite' ve 'kalibre?' Vardır.
    NOT: un kalibre Sayısı sütunundaki 'Alan aralığı' görüntülenen alanda membranın başına parçacıkların sayısıdır.
    NOT: Kalite yaklaşık -0.8 1.7 arasında değişmektedir; Q ≥ 0.5 kabul edilebilir.
    1. bir onay işareti gözlemlemek 'kalibre?' bir görüntü kalibrasyonu için işaretlenir sütun halinde ideal bir ölçümlere kendi benzerliği dayalı.
      NOT: Kalite ve Kalibrasyon Hem geçerli ayarları muhtemelen yetersiz olduğu önerebilir. uygun 'Renk Eşik' ve 'Boyut Aralıkları' sonra seçilmiştir ve kalibrasyon hala orijinal denetlenmesine önerilen ve görüntüler geçerli saymak son belirleyici olmalıdır sayılır edin.
  3. Kalibrasyon için işaretlendi Tablo tüm Örnekleri seçin.
    1. t sağ tıklayınmasa basıp Recount o> 'boyutu Önerilen'. Bu önerilen asgari parçacık alanı ile görüntüleri anlatmak olacaktır.
    2. Tekrar sağ tıklayın ve 'Show Plot' seçeneğini seçin. parçacık alanlarının frekans dağılım grafiği gözlemleyin. İdeal görüntü yani uzun sağ kuyruklu normal dağılım, çan eğrisi benzeyen bir grafik olacak. Şekil 3B bakın.
    3. örnek, sağ tıklayarak seçerek ve anlatmak> 'Manuel ayarları seçerek, gerekirse alt Boyut aralığı ayarlayın. manuel ayarlar iletişim gözlemleyin. İstediğiniz ayarları girin ve yeni ayarlarla görüntüyü anlatmak için sayın tıklatın.
  4. Elle sayımı ayarlamak sağ tablo tıklayarak, örnekleri seçin ve 'sayımları ile Açık görüntü' seçin. eklenti tarafından sayılan her parçacık temsil kırmızı işaretleri ile orijinal görüntü gözlemleyin.
    NOT: Recount> ne kadar iyi kontrol etmek yararlı olabilir 'Show ikili görüntü sayılır' individual hücreler renk eşikleme ile çözümlenir ediliyor.
    1. bir sayı eklemek için, 'Ctrl' ve sol tıklama tutun. numunelerin toplam sayısı eklenecek imleç konumda bir işaret gözlemleyin. bir işaretçi kaldırmak için, sağ görüntüyü tıklatın. eklenti imleç yakın işaretleyici kaldıracaktır.
    2. belirteçlerin bir grubu kaldırmak için, faiz (ROI) bir bölge seçmek için ImageJ bir seçim aracını kullanın. 'Ctrl' tutarken, resmi sağ tıklayıp ROI içindeki tüm belirteçler silinecektir. 'Kont' sütunundaki hücre sayısını dikkate alınız.

11. Tasarruf / Sonuçlar açma ve CSV İhracat

  1. > 'Kaydet sonuçları' TC, menü çubuğuna gidin ve 'Dosya' üzerine tıklayın. Sonuçları Kaydet iletişim kutusunu gözlemleyin. bir ad ve hedef seçin ve 'Kaydet'i tıklayın.
    1. 'Aç Sonuçları', ana tabloda görüntülenen tüm verileri içeren bir dosya yüklemek includin için> 'Dosya' kullanıng arsa.
      NOT: Sonuçlar dosya görüntüleri kaydedilir dizinleri kaydeder orijinal görüntüleri başarısız olur fonksiyonları 'sayıları ile Açık görüntü', 'Aç orijinal görüntü' ve kaydettikten sonra taşınır ise..
    2. Görüntü dizini sıfırlamak örnekleri seçmek için, sağ tablosunu tıklatın ve 'görüntü dizini Reset' seçeneğini seçin. Dizin Seç iletişim kutusunu gözlemleyin. Yeni klasörü seçin ve görüntüler varsa, dizinleri sıfırlanır. Sonuçlar dosyasını yeniden kaydedin.
  2. menü çubuğunda bir Virgülle Ayrılmış Değerler (CSV) dosyasına kaydetmek için '.csv Export' 'Dosya'> gidin. Bu ortalama ile istatistiksel gruplar halinde organize örneklerin sayısı ve ortalamanın standart hatası ile bir dosya oluşturur; onun düzeni ortak grafik programlarında hızlı grafik için tasarlanmıştır.
    NOT: İstatistiksel gruplar TC içinde oluşturulan gruplara dayanmaktadır.
    1. Numuneler genel adlandırma şablonu izlerseniz, gr olmak örnekleri seçmekouped, sağ tıklayın ve 'Otomatik gruplama' seçeneğini seçin. Bu aynı gruba aynı 'Adı' ile örnekleri ekler. Her iki kontrolleri 'Tedavi' grubun 'Denetim' ve tedaviler eklenebilir: 1, Kontrolü - - 2, Tedavi - - 1, Tedavi 2 örnek Kumandanın Kullanılması.
    2. grup adına çift tıklayarak gruplara elle numunenin 'Grup' hücre ve yazmaya örnekleri ekleyin. Seçin örnekleri sağ tıklayın ve 'Gruba ekle', bu gruba eklenecek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre Konsantrasyon Hesaplama

Şekil 1 CCC kalibrasyon ve sayılabilir görüntü alımı genel sürecini sunmaktadır. Şekil 1A ve 1B piksel P-kare uzunluğu P-kare kalibrasyon görüntü ve hesaplama betimliyor. CCC, aşağıdaki formül kullanılarak, belirli bir hacim içinde hücre konsantrasyonunu belirler:

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritik Adımlar, sorun giderme ve Sınırlamalar

Otomatik hesaplama yöntemleri doğası, parçacık analizi, özellikle bu, bu parçacıkları tanımlamak için matematiksel yetenek gerektirir. Sonuç olarak, Hücre Konsantrasyon Hesaplama ve göç tahlil sayacı hem doğruluğu yakalanan görüntü hücresi örnek veya göç tahlil zarı benzer ne kadar yakından, yani resim netliği üzerinde majorly bağlıdır. Bu nedenle mümkün olduğunca en iyi olarak mikroskop ve ilgili yazılım kalibrasyon protokollerini takip etmek geliş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü tarafından CP'ye (OR 142730 ve OR 89931) desteklenmiştir. Jelena Brkic'e ImageJ'deki ikili parçacık analizi hakkındaki ilk fikri için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HyClone Klasik Sıvı Ortam: RPMI 1640 - L-GlutaminFisher ScientificSH3002702Hücre kültürü ortamı ile 
Fetal bovian serum (FBS)GIBCO BRLP00015Medya beslemesi
HTR8/SVneo trofoblast hücre hattıHücreler Dr. Charles Graham'dan (Kraliçe' s Üniversitesi, Kingston, Kanada)Yazılım, herhangi bir hücre hattıyla çalışacak şekilde tasarlanmıştır.
TripsinGIBCO BRL27250-01810 &'da %0,20 (a/h) olarak hazırlanmış; M EDTA 1x PBS
AccutaseYenilikçi Hücre TeknolojileriAT104
10 cm hücre kültürü plakalarıSARSTEDT833902Doku kültürü ile tedavi edilmiş herhangi bir plaka uygun olacaktır
Transwell Polyester Membran Ekler - 8.0  &mikro; mFisher Scientific 7200150'den sipariş edilen3422 24 oyuklu plakalar için; Gözenek boyutu: 8.0 ve mikro; m; 6,5 mm çap; 0,33 cm2 büyüme alanı
HARLECO Hematoloji Boyaları ve Reaktifleri, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3EMD Millipore ve VWR65044A, B, & CHemacolor leke seti, üç adet 500 ml (16,9 oz.) poli şişeden oluşur ve bir metanol fiksatif (Çözelti 1), bir eozin veya asit lekesi (Çözelti 2) ve bir metilen mavisi veya bazik leke (Çözelti 3) içerir
Pamuk Uçlu AplikatörPuritan Medical806-WC
Tek kenarlı endüstriyel tıraş bıçaklarıVWR55411 - 055Kalınlık: 0,30 mm (0,012 inç)
Mikroskop Slaytları - Önceden Temizlenmiş/DüzFisher Scientific12550A3Boyutlar: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Kapak Camları - Dikdörtgenler no. 1Fisher Scientific12-545EKalınlık: 0,13 ila 0,17 mm; Boyut: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Montaj OrtamıFisher ScientificSP15-500
Leica Stereo diseksiyon mikroskobuLeica Microsystems MicrosopeLeica mikroskop kamera Model MC170 HD ile donatılmıştır ve kamera yazılımı Leica App. Suite (LAS E2) Sürüm 3.1.1 [Yapı: 490]. Mikroskop parçaları:  LED3000 Spot Işık Aydınlatma Modeli: MEB126, Leica M80 Optik Taşıyıcı Model M80, Objektif akromat 1.0X, WD = 90   mm Modeli: MOB306 ve Objektif akromat 0.32X, WD = 303 & nbsp; mm Model: MOB315, Video Objektif 0.5X Model: MTU-293
HemasitometreAsistanı Almanya 0.100 mm Derinlik - 0.0025 mm2
Olympus ters ışık mikroskobuOlympus CorporationCKX41SFMicrosope ile donatılmıştır Lumenera Infinity 1-2
2.0 Megapiksel CMOS Renkli Kamera ve kamera yazılımı Infinity analizidir Sürüm 6.5.2
Laminer akış kabini 1300 Serisi A2Thermo Scientific Model: 1375Hücre kültürü çalışması için herhangi bir laminer akış kabini uygun olacaktır 
Hücre kültürü inkübatörüThermo Scientific Model: 370Herhangi bir hücre kültürü inkübatörü uygun olacaktır - Hücreler nemli ortamda,% 5 CO2< / sub>, 37 ° C altında kültürlendi; C 
ImageJNIHSürüm 1.50eMinimum sürüm gereken
Java Runtime EnvironmentOracleSürüm 1.8.0_66Minimum sürüm gerekli
m Gözenek boyutu Costar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752(2008).
  2. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
  3. Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
  4. Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. Animal Cell Culture. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).
  5. Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
  6. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).
  7. Scott, W. N. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).
  8. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).
  9. Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
  10. Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
  11. Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
  12. Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
  13. Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
  14. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/ (2007).
  15. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
  16. Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
  17. Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
  18. Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).
  19. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
  20. Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , Available from: https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hemositometre AnaliziMigrasyon DeneyiPartik l AnaliziOtomatik Say mG r nt KalibrasyonuRenk E iklemeH cre Konsantrasyon Hesaplay cTC Eklentisi

İlgili makaleler