ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

Summary

Bu makale, iki yeni açık kaynaklı ImageJ eklentisi aracılığıyla hemositometre ve migrasyon/invazyon mikrograflarının miktar tayinini açıklamaktadır: Hücre Konsantrasyonu Hesaplayıcısı ve migrasyon tahlili Sayacı. Ayrıca, görüntü alma ve kalibrasyon protokollerini açıklar ve eklentilerin giriş gereksinimlerini ayrıntılı olarak tartışır.

Abstract

Sağlık ImageJ National Institute güçlü, serbestçe kullanılabilir görüntü işleme yazılımı paketidir. ImageJ çeşitli biyolojik partiküller saymak için etkili bir şekilde kullanılabilir kapsamlı parçacık analizi algoritmaları. hücre örneklerinin çok sayıda sayım yaparken, hemositometre zaman açısından bir darboğaz sunar. Aynı şekilde, ImageJ eklentisi Cell Counter ile göç / işgali deneyleri gelen zarları sayma doğru olsa da, bilek ağrılarına sebep için son derece emek yoğun sübjektif ve rezil. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz otomatik hemasitometre (ya da bilinen hacim) ve göç / işgali hücre sayımı tek görev için ImageJ içinde iki eklentileri geliştirmiştir. Her iki eklentileri minimum arka plan ile yüksek kalitede mikrograflar elde etmek yeteneğine güveniyor. Bunlar, kullanımı kolay ve sayıları kalibrasyonunu yardımcı olmak için yerleşik analiz araçları ile geniş örneklem boyutları hızlı sayım ve analiz için optimize edilmiş. Çekirdek prensibini birleştirerekotomatik sayım algoritması ve sonrası sayma analizi ile Cell Counter s, bu büyük ölçüde göç deneyleri doğruluk kaybı olmaksızın işlenebilir kolaylığını artırır.

Introduction

In vitro hücre sayımı olarak doku kültürü deneyleri, geniş bir aralık içinde bir önemli temel bir tekniktir. Doğru bir kültürde hücre sayısının belirlenmesi deney tekrarlanabilirlik ve standardizasyon ^1,2 için gereklidir. Hücre sayımı bir hemasitometre kullanarak yanı sıra otomatik çeşitli yöntemler, kendi avantajları ve dezavantajları ^3,4,5 her kullanılarak elle yapılabilir. hücre sayımı için otomatik yöntemlerin çoğu iki sınıfa Coulter prensibini kullanın veya akım sitometri olanların birine ait. Coulter sayaçlar hücre sayısını ve boyutunu belirlemek için hücreler elektriksel direnç yararlanmak. Onlar akış sitometrelerinde da....

Protocol

1. Bileşik Mikroskop ve Kamera Ayarı (Hücre Konsantrasyon Hesaplama)

1. Işık ayar düğmesi ile tam ampul parlaklığını artırmak 4X objektif lens geçmek ve faz kontrast filtreleri seçilmiş olduğundan emin olun.
   NOT: koyu arka plan ile doku kültürü için herhangi bir ters faz kontrast mikroskop, örneğin, PhP faz kontrast, standart mikroskop ve kamera prosedürleri takip kullanılabilir.
2. mikroskop yazılım içinde, varsayılan değerlere görüntü yakalama ayarlarını.
   NOT: Bu ayarların yerini bulmak için mikroskop kullanım kılavuzuna başvurun.
   1. 'Parlaklık', 'kontrast' ve% 100 'doygunluğu' ve 'gama' ve....

Results

Hücre Konsantrasyon Hesaplama

Şekil 1 CCC kalibrasyon ve sayılabilir görüntü alımı genel sürecini sunmaktadır. Şekil 1A ve 1B piksel P-kare uzunluğu P-kare kalibrasyon görüntü ve hesaplama betimliyor. CCC, aşağıdaki formül kullanılarak, belirli bir hacim içinde hücre konsantrasyonunu belirler:

Discussion

Kritik Adımlar, sorun giderme ve Sınırlamalar

Otomatik hesaplama yöntemleri doğası, parçacık analizi, özellikle bu, bu parçacıkları tanımlamak için matematiksel yetenek gerektirir. Sonuç olarak, Hücre Konsantrasyon Hesaplama ve göç tahlil sayacı hem doğruluğu yakalanan görüntü hücresi örnek veya göç tahlil zarı benzer ne kadar yakından, yani resim netliği üzerinde majorly bağlıdır. Bu nedenle mümkün olduğunca en iyi olarak mikroskop ve ilgili yazılım kalibrasyon protokollerini takip etmek geliş.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Klasik Sıvı Ortam: RPMI 1640 - L-Glutamin	Fisher Scientific	SH3002702	Hücre kültürü ortamı ile
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Medya beslemesi
HTR8/SVneo trofoblast hücre hattı	Hücreler Dr. Charles Graham'dan (Kraliçe' s Üniversitesi, Kingston, Kanada)		Yazılım, herhangi bir hücre hattıyla çalışacak şekilde tasarlanmıştır.
Tripsin	GIBCO BRL	27250-018	10 &'da %0,20 (a/h) olarak hazırlanmış; M EDTA 1x PBS
Accutase	Yenilikçi Hücre Teknolojileri	AT104
10 cm hücre kültürü plakaları	SARSTEDT	833902	Doku kültürü ile tedavi edilmiş herhangi bir plaka uygun olacaktır
Transwell Polyester Membran Ekler - 8.0  &mikro; m	Fisher Scientific 7200150'den sipariş edilen		3422 24 oyuklu plakalar için; Gözenek boyutu: 8.0 ve mikro; m; 6,5 mm çap; 0,33 cm2 büyüme alanı
HARLECO Hematoloji Boyaları ve Reaktifleri, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore ve VWR	65044A, B, & C	Hemacolor leke seti, üç adet 500 ml (16,9 oz.) poli şişeden oluşur ve bir metanol fiksatif (Çözelti 1), bir eozin veya asit lekesi (Çözelti 2) ve bir metilen mavisi veya bazik leke (Çözelti 3) içerir
Pamuk Uçlu Aplikatör	Puritan Medical	806-WC
Tek kenarlı endüstriyel tıraş bıçakları	VWR	55411 - 055	Kalınlık: 0,30 mm (0,012 inç)
Mikroskop Slaytları - Önceden Temizlenmiş/Düz	Fisher Scientific	12550A3	Boyutlar: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Kapak Camları - Dikdörtgenler no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Kalınlık: 0,13 ila 0,17 mm; Boyut: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Montaj Ortamı	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo diseksiyon mikroskobu	Leica Microsystems Microsope		Leica mikroskop kamera Model MC170 HD ile donatılmıştır ve kamera yazılımı Leica App. Suite (LAS E2) Sürüm 3.1.1 [Yapı: 490]. Mikroskop parçaları:  LED3000 Spot Işık Aydınlatma Modeli: MEB126, Leica M80 Optik Taşıyıcı Model M80, Objektif akromat 1.0X, WD = 90   mm Modeli: MOB306 ve Objektif akromat 0.32X, WD = 303 & nbsp; mm Model: MOB315, Video Objektif 0.5X Model: MTU-293
Hemasitometre	Asistanı Almanya		0.100 mm Derinlik - 0.0025 mm2
Olympus ters ışık mikroskobu	Olympus Corporation	CKX41SF	Microsope ile donatılmıştır Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapiksel CMOS Renkli Kamera ve kamera yazılımı Infinity analizidir Sürüm 6.5.2
Laminer akış kabini 1300 Serisi A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Hücre kültürü çalışması için herhangi bir laminer akış kabini uygun olacaktır
Hücre kültürü inkübatörü	Thermo Scientific	Model: 370	Herhangi bir hücre kültürü inkübatörü uygun olacaktır - Hücreler nemli ortamda,% 5 CO2< / sub>, 37 ° C altında kültürlendi; C
ImageJ	NIH	Sürüm 1.50e	Minimum sürüm gereken
Java Runtime Environment	Oracle	Sürüm 1.8.0_66	Minimum sürüm gerekli