Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Özet

Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılarak primer immün hücrelerin zarlarında protein difüzyonunu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yazıda, floresan etiketleme için antikorların kullanımı gösterilmektedir.

Özet

Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS) yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip biyolojik membranların içindeki moleküllerin difüzyon çalışmak için güçlü bir tekniktir. FCS hücre zarındaki floresan etiketli moleküllerin moleküler konsantrasyon ve difüzyon katsayısının ölçmek olabilir. Bu teknik, (gerçek ölçüm süresi boyunca sonucu etkileyen işlemleri olmadan IE) sürekli halde bağışıklık hücrelerinin plazma membranında moleküllerin moleküler difüzyon karakteristiklerini yeteneğine sahiptir. FCS çok endojen proteinler için tipik bir seviyede ifade edilen proteinleri difüzyonunu çalışmak için uygundur. Burada, birincil lenfositleri üzerinde hücre zarı proteinlerinin difüzyon oranını belirlemek için basit ve sağlam bir yöntem olduğunu göstermiştir. antikor lekeli canlı hücreler ve kazanılmasından sonra sık görülen gözlemlere ölçümleri gerçekleştirmek için etkili bir yoldur açıklanmıştır. son gelişmelerverilmedi-kararlı floresan boyalar geliştirilmesinde ölçümler sırasında yoğun ağartıcı olmayan boyalar, uygun ilgi antikorlar eşleştirilmesiyle kullanılabilir. Buna ek olarak, bu hücre zarlarında ifade edilen proteinlerin genel bir özelliğidir yavaş difüzyon kişiler tespiti için verir. Oluşturulan otokorelasyon eğrileri moleküler konsantrasyon ve difüzyon parametreleri ayıklamak için analiz prosedürü vurgulanır. Özet olarak, FCS ölçümleri için temel protokol sağlanmıştır; o konfokal mikroskopi anlayışı ile ancak böyle moleküler difüzyon oranları gibi dinamik parametrelerini, ölçme teknikleri başka hiçbir önceki deneyimi ile immünolojistler tarafından takip edilebilir.

Giriş

Birçok bağışıklık hücreleri fonksiyonlarını moleküler difüzyon ve zarlar içinde etkileşimler güveniyor. Biyolojik zarlar karmaşıktır ve hücre membranları ¹ içindeki proteinlerin geçiş yayılma hızını etkileyebilir immün hücrelerin fonksiyonu için önemli olabilir birçok faktör. Son zamanlarda, doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait, doğal öldürücü (NK) hücreler, lenfosit, NK hücreleri ² durumuna bağlı olarak, hücre zarı iki çalışılan protein ayırıcı difüzyon sergilediklerini göstermiştir.

Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), biyolojik zarlar içinde moleküler difüzyon oranları miktarının kapasitesine sahip bir tekniktir. Bu floresan sabit hacimde molekülleri etiketli ortalama difüzyon oranı, bir konfokal mikroskop tipik odak bildirir. Bu moleküler hareketi üzerine ortaya floresan dalgalanmaların ölçülmesine dayanırkararlı halde bir sistem. FCS yaygın çözelti içinde ve lipid zarlar içinde hem de floresan boyalar ve proteinlerin difüzyon incelemek için kullanılmıştır. Difüzyon hızını etkileyen diğer çıkış parametreleri de dolaylı olarak, bu şekilde incelenebilir (örneğin, protein ya da hücre membranları üzerinde moleküllerinin etkileşimleri konformasyonel değişiklikler) ^{3, 4.} FCS tek-molekül tespiti için olasılığını sağlayan yüksek duyarlılığı nedeniyle diğer tekniklerle karşılaştırıldığında göze çarpıyor. Bu, çoğu proteinin ⁵ 'nın endojen ekspresyonunun seviyeleri tipik milimolar aralığına nanomolar, moleküler konsantrasyonları için çalışır. çoğu diğer teknikler sadece protein ekspresyon düzeyleri hakkında nispi bilgi verirken Ayrıca, FCS, çalışılan hacmi içindeki proteinlerin mutlak sayısının bir yaklaşım verebilir. membranlar fluo dahil olan diğer yöntemler moleküler difüzyon oranlarını ölçmek için(Sıkı bağlamak) photobleaching sonra rescence kurtarma, tek parçacık izleme (SPT), çoklu iğne deliği FCS ve görüntü korelasyon yöntemleri. Sıkı bağlamak ve görüntü korelasyon yöntemleri genellikle moleküllerin ¹⁰ mutlak sayısı hakkında bilgi vermeyin topluluk teknikleri vardır. SPT ile karşılaştırıldığında, FCS verimi nüfusun ortalama karakterize açısından yüksektir. lazer odak içinde mevcut moleküllerin ortalama difüzyon oranı oldukça tek moleküllerin oranından daha ölçülür çünkü analizi de daha az talep ediyor. Özel mikroskoplar ¹¹ mevcut değilse, standart SPT etiketleme tek moleküllerin tanımlanmasına olanak sağlamak için çok düşük olması gerektiğinden Ayrıca, SPT, konsantrasyonları hakkında herhangi bir bilgi veremem. Öte yandan, FCS çalışılan moleküller mobil olmasını gerektirir. Bu sadece çok yavaş hareket eden herhangi bir farazi hareketsiz kesirleri veya molekülleri tespit olmayacaktır. moleküllerin difüzyon oranı ouzun edinimi süresi yaklaşık onda biri doğru FCS ölçümlerinin ^{3, 12} temsil olmayacak daha odak içinde bulunur. Bu nedenle, FCS tarafından kaydedilen difüzyon katsayıları to-hareketsiz-yakın ve çok yavaş fraksiyonlar yanı sıra dikkate alınır FRAP ve SPT gibi tekniklerden rapor difüzyon oranlarından daha hızlı olma eğilimindedir. SPT da olacak FCS daha moleküler nüfus içerisindeki difüzyon oranlarının değişkenliği daha ayrıntılı bir açıklama verecektir.

FCS heyecanlı hacmi içinde zamanla floresan dalgalanma rakamlarla. Membran ölçümleri durumunda, bu zarın aydınlatılmış bölgeye çevirir. Bu yazıda, bu tür dalgalanmalar Brown difüzyon sergileyen molekülleri tarafından uyarılan ve böylece ve uyarma hacminin dışında hareket gerçeğini kullanmaktadır. fluctua için birkaç olası kaynak vardırBu tür bağlayıcı unbinding tüm hücre zarı ligandı ya da hareket, yanıp sönen veya flüoroforlar, çevresel etkiler bir triplet halinin varlığı olarak floresans sinyalinde yonlar. Bu farazi hata kaynakları sonuçları doğru ^{12, 13} yorumlamak amacıyla bir FCS deney tasarımı dikkate alınması gerekir. Tipik olarak, biyolojik zarların yanal difüzyon oranları zar proteinleri arasında proteinler ve hücre iskeletinin arasında hem kalabalık ve etkileşimleri nedeniyle düşüktür. Tarihsel, zarlarında FCS kullanımı dolayısıyla uyarma odak ¹⁴ boyunca uzatılmış geçiş zamanlarında ağartma önlemek için gerekli olan foto stabil fluorophores, eksikliği engel olmuştur. Ancak, bugün, uygun foto stabil boyalar için pek çok seçenek vardır. detektör ve diğer donanım önemli gelişmeler de floresan prote algılanmasına izinins ve alt parlaklık boyalar. Burada, antikor etiketli ilgili protein flüoresan ile etiketlenmiş olan fare primer lenfositleri kullanılarak FCS uygulama için temel protokol, tarif edilmektedir. difüzyon katsayısı ve moleküler yoğunluğu elde etmek için otokorelasyon eğrileri uygun bir yaklaşım da gösterilmiştir. protokol kolayca moleküllerin difüzyon çalışması için teknikler daha önce hiç deneyimi olan immünolojistler tarafından takip ediliyor amaçlamaktadır. Ancak, konfokal mikroskopi temel bir anlayış beklenmektedir (referans ^15'e bakın, bu temel anlayış kazanmak için). Bu protokol, nispeten kolay bir şekilde, diğer süspansiyon hücreleri hücre hatları ve primer hücreler hem de adapte edilebilir. Daha tecrübeli FCS kullanıcılar için, daha rafine analiz yöntemleri olan bazı tartışmalar anlatılmıştır, mevcuttur.

Protokol

FCS 1. Boyama

1. Üreticinin protokolü ¹⁶ uyarınca, manyetik boncuk etiketleme kullanarak dalak lenfositlerden fare NK hücreleri izole. Aşağıdaki adımları için numune başına 2-3 x 10 ⁵ hücre kullanın.
   NOT: Hücreler tek başına birincil antikorlar kullanılarak etiketli böylece, el değmemiş bırakarak, hedef hücre popülasyonunu zenginleştirmek için negatif seçim kullanın. Fareler ² hücre izolasyonu hakkında daha ayrıntılı bilgi için referans ^2'ye bakın.
2. Fc reseptörleri eksprese eden mürin hücreleri için, fosfat tamponlu salin (PBS) ve örnek başına% 1 fetal inek serumu (FBS) 25 ul 5 mg / ml antikor klonu 2.4G2 ile Fc reseptörleri bloke eder. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
3. Antikor karışımı hazırlanması.
   1. Kullanım antikorlar doğrudan bir foto stabil fluorofora birleşmiş. Eğer iki farklı proteinlere karşı iki antikor(örneğin, 488 ve 633 lazerler ² heyecan, daha sonra protokol sırasıyla, "yeşil" ve "kırmızı" lazerler ve fluorophores olarak adlandırılan çapraz konuşma minimize etmek iyi ayrılmış emisyon spektrumları sahip kullanılan, kullanım fluorophores vardır ).
      NOT: foto stabil fluorophores etiketli ticari antikorlar seçilir biyomarkerların için mevcut değilse, fluorophores için eşlenik etiketsiz antikorlar üreticinin talimatlarına göre. Bu çalışmada kullanılan antikorlar için malzemeler tabloya bakınız.
   2. protein ya da PBS +% 1 FBS içinde ilgi proteinlerine karşı flüoresan etiketli antikorlar seyreltilmesiyle bir antikor karışım hazırlayın. Örnek başına 50 ul son hacim olması için her bir örnek, antikor karışımı ekleyin. Karanlıkta 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
      NOT: antikor, bir doyurucu bir konsantrasyonda kullanılır sağlamak için önceden antikor konsantrasyonunun optimize, tipik haliyle1-10 ug / ml olmuştur.
4. Kuluçkadan sonra, 250 ml PBS ilave edilerek hücrelerin yıkanması, 3 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj. süpernatant atın.
5. Adımı tekrarlayın 1.4.
6. PBS +% 1 FBS, 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri. buz üzerinde ve edinimi kadar karanlıkta saklayın.
   Not: Murin NK hücreleri kadar 10 saat boyunca buz üzerinde tutulmalıdır.

Mikroskop odacıklı coverglass Slaytlar 2. Hazırlık

NOT: mikroskop için optimize edildiğini kapak cam kalınlığı, # 1 veya # 1.5 ya Kullan odacıklı coverglass slaytlar veya yemekler. Mikroskop, belirli bir kalınlık için hizalanmış değilse bu bedel bilinmiyorsa, ya da, mikroskop yaka halka geçerli coverglass kalınlığı ¹⁷ için optimize edilmesi gerekmektedir.

1. 1:10 oranında damıtılmış su ile poli-L-lisin ile seyreltilir. bölmelere seyreltildi poli-L-Lizin 200 ul ilave edin ve 20 dakika boyunca inkübe edin.
2. KaldırAspirasyon ile poli-lizin, L-ve en az 20-30 dakika süreyle oda sıcaklığında kapaksız bırakarak odası hava kurumaya bırakın.

3. FCS Sistemi Başlangıç

NOT: Diğer mikroskopi kurulumları ve yazılım paketleri de kullanılabilir, ancak bu protokol, (/ Reaktifler Tablo Malzemeler bakınız) Belirli bir mikroskop sistemi ve yazılım anlamına gelir.

1. FCS korelatör ile konfokal lazer tarama mikroskobu açın. "Uzman" modunda yazılımı açın. 40X suya daldırma merceği seçin.
2. "Acquire" sekmesi altında, basın "Yapılandırma" ve "Tarama" düğmeleri "Yapılandırma Kontrolü" ve "Tarama Kontrolü" pencere (Şekil 1 pencereler A ve B, sırasıyla) açın. "Confocor" sekmesi altında, basın "Tedbir" "Ölçme" penceresi (Şekil 1'de pencere C) açmak için.
3. FCS kaydetmek için bir klasör oluşturunölçümleri. "Dosya" sekmesi altında "Yeni" tıklayarak yeni bir resim veritabanı başlatın.
4. "Lazer" düğmesini kullanarak, halojen lamba ve heyecan verici fluorophores hakkında lazerler açmak (örneğin, "kırmızı" uyarma lazer için "yeşil" uyarma lazer ve 633 nm uyarma için 488 nm).
5. Uygun uyarma ve emisyon filtreleri seçin ve ilgili dedektörleri etkinleştirin.
   1. "Yapılandırma Denetimi" penceresinde, kullanılacak uyarma lazer, uyarma ve emisyon filtreleri, ışık yolu ve dedektörler de dahil olmak üzere, görüntü yakalamak için ayarları belirtin.
   2. Benzer şekilde, "Sistem Yapılandırması" sekmesi altında, "Ölçme" penceresinde FCS ölçümleri için gelen ayarları belirtin. görüntüleme ve FCS için mümkün olduğunca benzer ayarları kullanın.
   3. Yeşil channe için "Ch1" kutusunu işaretleyerek FCS kayıtları için algılama kanalları etkinleştirmekl ve "Ölçme" penceresinde kırmızı kanal için "Kn2".
      NOT: Ayarlar standart konfokal görüntüleme deneyde olduğu gibi, kullanılan fluorofor (ler) için optimize edilmelidir. sonraki deneylerde, aynı FCS ayarları, eski FCS dosyasını açarken kullanıcı arayüzü üstündeki "Confocor" açılır menüsünü kullanarak ve seçerek yeniden kullanılabilir "Açık dosya." Gelişmekte olan satın alma penceresinde Basın "Yeniden". Benzer şekilde, görüntü alma ayarları kaydedilmiş görüntü açarak basarak yüklenebilir "Yeniden kullanım."
6. Lazer FCS ölçümleri yapmadan önce sabit olana kadar bekleyin. diyot lazerler daha hızlı stabilize iken bu gaz lazerler için 30 dakika kadar sürebilir. beklerken iğne deliği ayarlayın.

4. İğne Deliği Ayarı

1. Antikorlar üzerindeki etiket eksitasyon ve emisyon spektrumlarına tekabül fluorophores veya floresan boyaların 0.2-0.5 uM çözelti hazırlayın.^{fluorophores, 19} difüzyon katsayıları ¹⁸ bilinen gerekir.
2. Bir bölmeli coverglass slayt iyi olarak merkezinde yeşil lazeri tarafından uyarılır florofor ile bir çözelti 50 ul damla koyun. 40X su objektif distile su bir damla koyun ve slayt yerleştirin. görünür ışık başlatmak ve bulmak ve fluorofor damla odaklanmak için oküler kullanmak için "Vis" düğmesine basın.
   NOT: slaytlar mikroskop hizalama etkileyebilir arasındaki cam kalınlığı varsayılan küçük farklılıklar beri, daha sonra hücre ölçümleri için aynı slayt kullanın.
3. odak içinde de sıvı damla (alttan 10-100 mikron) yerleştirin.
4. "Ölçme" penceresinde, "Toplama" sekmesini seçin. Basın "Pozisyonlar" altında "Geçerli konum" (Şekil 1 pencere C).
5. Aynı pencerede "Sistem Yapılandırma" sekmesine dönün. yüksek s ayarlayınYeşil lazer ower.
   NOT: Bir yüksek lazer güç doygunluk gücü (lazer güç daha da arttırılırsa, yani floresan sinyal doğrusal artmaz) anlamına gelir. 1 mW sisteminin ayarları güç veya maksimum lazer gücünün% 5-10 civarında, genellikle yeterlidir.
6. tuşuna basarak sinyal kararlılığını test "Başlat". Bu akım ölçümü için zaman iz ve otokorelasyon eğrisi görüntüleyen ayrı bir pencere açılacaktır. floresan sinyal zamanla yüksek kararlı olup olmadığını kontrol edin ve kHz ziyade Hz aralığında gösteren dalgalanmalar.
7. "Ölçme" penceresinde "Ey ayarlayın" düğmesini seçin. Doğru algılama kanalı (Ch1 veya Ch2) seçilebilir olup olmadığını kontrol edin. Basın "AutoAdjust X" Elde edilen eğri net bir maksimum görünmüyor, veya maksimum kenarında ise, yine "kaba" seçeneğini seçip "AutoAdjust X" işareti. x-yönünde sonuçlanan ekran bittiğinde, sa yapmak"AutoAdjust Y." tuşuna basarak Y me
8. Her iki net maxima var ve değerler ölçümler arasında değişen değildir kadar "AutoAdjust" tuşuna basarak ayar X ve Y arasında "kaba" ve alternatif De-seçin.
9. Hücreler, iki farklı flüorofor ile etiketlenir ise kırmızı flüorofor çözeltisi ilave edilmiş bir bölmeye hareket eder. kırmızı lazer için yüksek lazer gücü seçin ve tekrar kırmızı uyarma ve algılama kanalı için 4.6-4.8 adımları tekrarlayın.
   NOT: X ve Y değerleri tek bir iğne deliği hem algılama kanalları için kullanılan sistemlerde kanallar arasında saparsanız, ara değerleri seçin ve değişiklikleri kabul etmek için OK tuşuna basın. Burada, X = 79 ve y = 189 de maksimumlar ile 488 nm lazer ve X = 80 ve y = 188, değerleri X = 80 ve y = 189 de maksimumlar ile 633-nm lazer için seçildi. 488 nm veya 633 nm heyecan fluorophores etiketli iki antikorun uyarılması için 488 nm ve 633 nm lazerler kombinasyonu beri, iyi bir seçimdiremisyon spektrumları ² üst üste yoksa çapraz konuşmak için riski en aza indirilmiştir.

5. Ücretsiz fluorofor Transit Zaman ölçün

Not: Bilinen bir difüzyon katsayısı ile birlikte, bir fluorofor odaklama (TauD) içinden geçiş süresi; belirlenerek, algılama hacminin büyüklüğü ve odak içinde hücre zarının nedenle bölge, hesaplanabilir. TauD hesaplanması adımı 7,2 açıklanmaktadır.

1. Iğne deliği ayarı için kullanılan aynı çözümlerini kullanarak, "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere C) "Toplama" sekmesi altında 30 sn x 2 tekrarlar için satın alma süresini ayarlayın.
2. "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere B) "Başlat" tıklayarak bir ölçüm başlayın.
   1. ya da yakın başlayan her uyarma lazer ve çözüm karşılık gelen fluorofor, bir lazer güç dizi gerçekleştirmekgüç doyurarak ve her ölçüm için yarı yarıya azalır. "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere C) "Sistem Yapılandırması" sekmesinde lazer gücünü değiştirin. Bir ölçüm başlatmak için "Başlat" düğmesine basın.
      NOT: Alt aralığında yaklaşan hücre ölçümleri için lazer gücünü ekleyin ²⁰ (örneğin, objektif önce, 16, 8, 4, ve 2 uW gücü ölçün). Sistem lazer ayarları çıktı uyarma daha genel yüksek ve mikroskop ve uyum kalitesine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Bu sistemde, yukarıdaki güç aralığı yaklaşık 60-500 uW sistem ayarları gücüne tekabül eder. Amaca önce yeni bir mikroskop kullanılır ilk kez güç çıkışını ölçmek için bir güç metre kullanılması tavsiye edilir. Lazerin mevcut maksimum güç "Ölçme" penceresinin "Bilgi" butonu altında bulunur.
   2. mol başına sayıları bir yere yazınmajuscule: Her bir lazer güç ölçümü (CPM, birim kHZ).
   3. İki algılama kanalı kullanılıyorsa, çapraz konuşmak için otokorelasyon eğrisi görüntüleyen penceresini kontrol edin. tespit FCS kırmızı algılama kanalı olarak otokorelasyon ve yeşil algılama kanalı olarak algılama değerlendirmek için sadece kırmızı fluorophores bir çözüm ölçmek için sadece yeşil fluorophores içeren bir solüsyon kullanın. Genel bir kural olarak, uygun fluorofor belirli sinyalin% 5'in altında "yanlış" florofor algılanır CPM tutun.
   4. değerleri kullanılan lazer gücü ile doğrusal ölçek olmadığını kontrol edin. En yüksek lazer gücünde CPM Doygunluk (yani doğrusal bir ilişki beklenen biraz daha düşük değerler) kabul edilebilir.
      NOT: CPM hemen hemen tüm mikroskop sistemleri ve ortak fluorophores için en yüksek lazer gücü için de 10'un üzerinde olmalı ve hassas sistemler için önemli ölçüde daha yüksek olabilir. Yeni konjuge floresan antikor kullanıldığı ilk kez bir performansantikor FCS ölçümü serbestçe beklenen CPM ölçmek için çözüm olarak difüzyon. Ölçümden önce, kaplama, oda sıcaklığında 1 saat boyunca (0.5 mg / ml PBS içinde seyreltilmiş) polietilen glikol ile aşılanmış poli-L-lisin 200 ul ölçüm odası. bir pipet ile sıvı çıkarın ve havayla kurumaya odacığı sağlar. dondurucuda (en fazla 2 hafta) buzdolabında stok solüsyonu ve toz stok kaydedin. mikroskopta, PBS içinde 1-10 ug / ml antikor seyreltin. Takip 4,2-4,4 ve bu protokolde 6.7 adımları tekrarlayın. yüzey yapışkan olmayan çözelti ile kaplanmış ise, antikorlar, cam yüzeyi ile etkileşime ve süratli bir şekilde boşaltılabilir.

6. Hücre Ölçümleri

1. Antikor-etiketlenmiş hücre süspansiyonu (adım 1.5) ve 8 oyuklu odacıklı coverglass sürgünün bir kuyuya saydam Roswell Park Memorial Institute ortamı 1640 (RPMI), 150 ul PBS +% 1 FCS hücre 125 ul ekle. LeFCS ölçümleri başlamadan önce en az 20 dakika süreyle ölçüm sıcaklığında karanlıkta hücreleri ave.
   NOT: Bu yerleşmek ve kuyuların dibine takmak ve ölçüm sıcaklığına hücreleri ve çözüm dengelenmesi hücreleri sağlamaktır.
2. "Tarama Kontrol" penceresinden (Şekil 1, pencere B), zoom 1 set ve "Hızlı XY" düğmesine basarak hızlı bir XY tarama başlatın. hücreler hala açıkça görülebilir iken mümkün olduğunca düşük olması, böylece lazer gücünü değiştirin. membran açıkça tanımlanmış ve sitoplazmasında hiçbir floresan sinyali yoksa ortalama parlaklık, bir yuvarlak hücre görüntüsünü ortalamak. Hücre görüntünün en kapsar kadar yakınlaştırmak.
3. Geçerli hücre, ekstrüzyon veya aşırı parlak noktalar hareketli veya görüntüler dalları ise yeni bir hücre seçin. Aynı deney sırasında çekilen tüm hücreler için aynı zoom ve lazer gücünü tutun.
   NOT: Bir karıştırdı zar aynı zamanda gelecek apo belirtisi olabilirpitozis.
4. hücre zarının üzerine odaklanır. "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere C) "Toplama" sekmesinde, aktive ederek FCS ölçümü için bir konum seçmek "Crosshair." Alternatif olarak, "LSM Image" sekmesini seçin lsm görüntüde aranan ölçüm nokta işareti ve basın "konumunu ekleyin."
   Not: Hücre membran üst spesifik olmayan poli-L-lisin bağlı flüoresan antikor ya da florofor etkisinde edilmez. Ancak, hücre (sonuçları görmek) Ölçüm sırasında hareket olmadığını tespit etmek önemlidir.
5. "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere C) "Toplama" sekmesinde, tekrar başına 10 sn olarak belirlenmiştir "Tedbir Time" ile, 6-10 kadar tekrar sayısını ayarlayın.
6. "Ölçme" penceresinin "Sistem Yapılandırma" sekmesine dönün. "L altında FCS ölçümü için lazer gücünü ayarlamaaser "düğmesine basın. objektif önce, 1 ve 10 uW ²⁰ aralığında, hücre ölçümleri için düşük güç kullanırlar.
   NOT: Tavsiye edilen değerler hücrelere sinyal algılama ve fotohasar arasında bir trade-off vardır. adım 5.2.1 Not Ekle bu değerler karşılık gelen lazer gücünün yüzdesini görmek.
7. "Ölçüm" penceresi (pencere C) "Başlat" düğmesine basarak bir FCS ölçümü başlatın. (Örnek, Şekil 3A'da alt panel gösterilmiştir), ilk 10 saniye sırasında birden fazla% 30 oranında yoğunluğu iz bir düşüş ile tespit edildiği üzere önemli hücre ağartıcılar ölçüm başında, başka bir hücre ve daha düşük taşıma gelecekteki ölçümler için lazer güç.
   1. sinyalinin kaybolması durumunda, Z-yönünde odağı ayarlamak. Ölçüm tamamlandıktan sonra, hücre hala merkezli olduğunu ve hücre zarı ölçüldü olduğunu kontrol etmek için "Tarama Denetim" penceresi (Şekil 1, pencere B) kullanın. inci eğerE hücre ölçümü atmak, taşındı.
   2. Ölçüm görüntülenen otomatik korelasyon penceresinde, elle yakınlaştırma manevraları, ağartma, büyük kümeler veya diğer eserler (Şekil 3 örneklere bakınız) ihtiva bireysel tekrarlar silin. Onları işaretleme sağ tıklayarak ve seçerek bunu yapın "Sil." .fcs biçiminde son dosyayı kaydedin. Hücre başına en az dört tekrarlar kaydedin.
8. İsteğe bağlı olarak, "Tarama Kontrol" penceresini kullanarak (görünen zarın tüm çevresi ile birlikte), orta bölümünde bir hücrenin bir görüntü elde. ağartma önlemek için FCS ölçümden sonra görüntüyü yakalamak. görüntü yakalama başlatmak için "Tek" düğmesine basın.
9. FCS odak konumlandırma için "pozisyon ekle" kullanıyorsanız, tıklayın sonraki hücreye geçmeden önce "konumunu Kaldır".
10. hücreler canlı throughou tutmak için ölçüm 2 saat, en fazla sonra hücre süspansiyonu yeni kana değiştirmeDenemeyi t.

7. FCS Analizi

1. (Bu protokolde kullanılan yazılımlar için Malzemeler / Reaktifler Tablo bakınız) eğri uydurma yeteneğine sahip bir yazılımı .fcs dosyaları açmak.
   NOT: mikroskop ile geliyor FCS yazılımı temel montaj aşina olmak için iyi bir yerdir, ancak ek yazılım, iki boyutlu membran difüzyon sığdırmak için gereklidir.
2. İlk olarak, ücretsiz fluorofor ölçümleri analiz ederek uyarma birimin boyutunu belirler. Otokorelasyon eğrileri ²¹ 3 boyutlu serbest difüzyon eğriye uyacak.
   (Denk. 1)
   Not: parametrelerinin tanımlanması: N: korelasyon zaman, τ _D (TauD): odak hacmi, τ (Tau) floresan birimlerinin ortalama sayısı odak hacmi ortalama kalış süresi, T 1: florofor olasılığı olmak üçlü devlet, τ T: tekli-üçlü devlet geçişler için gevşeme zamanı, S: yükseklik oranı odak hacmi çapı genişliği için.
   1. TauD, moleküller odağı aktarmak için transit zamanı ayıklayın.
   2. Iğne deliği yarıçapı (ω) hesaplamak için kalibrasyon ^{18, 19} için kullanılan fluorophores TauD gözlenen ve yayınlanan difüzyon katsayıları (D) kullanın.
      (Denk. 2)
3. Hücre membranları üzerinde otomatik korelasyon eğrisi analizi.
   1. Moleküler difüzyon temsil eğrisinin bir kısmını görselleştirmek için bir zaman dilimi otokorelasyon eğrisinin dik yamaç önce başlayan ve 1 de eğri yakınlaşmaları sonra sona eren seçin (örneğin, 0.001 fare yüzey reseptörleri için 5 sn; Şekil 4).
   2. i kaydedildi bireysel tekrarlar ortalama otokorelasyon eğrisi oluşturmakn adımı 6.7.2.
   3. Her Denklem 3 ³ kullanılarak otokorelasyon eğrisi ortalama bir 2-boyutlu membran difüzyon eğriye uyacak.
      (Denk. 3)
      NOT: N heyecanlı zar alanı içinde ikamet eden moleküllerin ortalama sayısı aşağıdaki gibidir: Önemli çıkış parametreleri. Yoğunluk (N / um ²⁾ için Yeniden. τ _D (TauD) fokal alanı ortalama kalış süresi, zar (lar) ın, iki boyutluluğu ile sınırlıdır. Belirlenen iğne deliği yarıçapı (ω) ve Denklem 2. T1 üzerinden difüzyon katsayısı (mikron ² / sn) ortalama kalış süresini yeniden hesapla fluorophores üçüz durumda olması için olasılığıdır. parlaklık (CPM) N. tarafından ölçüm ortalama genel yoğunluğunu bölünmesiyle hesaplanır
   4. iyi bir uyum ilk denemede elde değilse, thi kadar değişkenler için başlangıç ​​değerleri ve / veya üst ve alt sınırları değiştirmeks elde edilir.
      NOT: Birincil hücre zarlarında protein difüzyon oranları için tipik alt-üst sınırları TauD için 10-500 msn T1 için% 0-100 ve TauT1 için 0,1-5 msn bulunmaktadır. Bu aralıklarla ortasında montaj için başlangıç ​​değerleri seçin. Tipik olarak 1 ms 1 saniye arasında bulunur difüzyon elde edilen flüoresan iniş-çıkışları temsil eden eğrinin parçası (bakınız Şekil 4). florofor bağlı olarak, bazen difüzyon parametresi daha kısa zaman ölçeklerinde otokorelasyon sebebiyet veren ikinci bir süreç mevcut olabilir. Bu (genellikle floresan proteinleri oluşabilir gibi) geçici karanlık devlet (üçlü) veya yanıp neden olur. Bir üçlü devlet Denklem 3'te muhasebeleştirilir ve sunulan model bu nedenle de bu gibi durumlarda iyi bir uyum sağlamalıdır.

Sonuçlar

Tipik bir sonuç membran proteinleri için 400 msn 10 milisaniye aralığındaki bir geçiş süresi olan bir otokorelasyon eğrisi oluşturur. Molekül sayısı, endojen olarak ifade edilen proteinleri yaklaşık 200 mikron ² başına 0.5 arasında değişebilir. CPM beklenenden daha düşük değildir olduğunu dikkatlice kontrol ediniz. Bu arka plan sinyalinin bir etkisi olduğu anlamına gelebilir. Genel bir kural olarak, analiz için kabul edilir hücreler üzerinde CPM sinyali serbestçe aynı lazer gü...

Tartışma

FCS Bu protokol bağışıklık hücrelerinin (murin, insan ya da diğer türlerin) her türlü yüzey moleküllerinin moleküler dinamiklerini değerlendirilmesi için de kullanılabilir. aşağı canlı hücrelerde tek-molekül çözünürlüğü FCS önlemler uzay-zamansal moleküler dinamik. Moleküler yoğunluğu, hem de ilgi konusu olan proteinlerin difüzyon hızı ve kümelenme dinamiği, otomatik korelasyon eğrisi elde edilebilir.

floresan etiketleme başarılı FCS deneyler için önemli hususlardan biridir. Hücre zarı üzeri...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MACS NK Hücre İzolasyon Kiti fare II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	NK hücrelerinin negatif seçimi
Fetal Sığır Serumu	Sigma-Adlrich	F7524	Isı ile İnaktive
Edilmiş Fosfat Tamponlu Salin	-		Evde üretilmiştir
Roswell Park Memorial Enstitüsü orta 1640	PAA Hücre Kültürü Şirketi	E15-848	Şeffaf orta
Antikor klonu 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Fc reseptörlerini bloke etmek için.
Anti-Ly49A antikoru			antikoruna evde konjuge edilen monoklonal antikor
	BD Pharmingen	558915	MFP488
Klon 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Floresan boya
Poli-L-Lizin	Sigma-Aldrich	P8920	Damıtılmış suda seyreltilmiş (1.10)
Poli-L-Lizin (20 kDa), polietilen glikol (2 kDa) ile aşılanmış,	SuSoS AG	PLL(20) -g [3.5] -PEG (2)	PBS (pH 7.4) ila 0.5 mg / ml ile seyreltilmiştir.
Rhodamine 110 klorür	Sigma-Aldrich	432202	Bilinen difüzyon katsayısı: 3.3 & kez; 10 & eksi; 10 m2/sn 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Bilinen difüzyon katsayısı: 4.4 & kez; 10 < sup> & eksi; 10< / sup> m < sup>2< / sup> / sn 20< / sup>
Konfokal mikroskop ve nbsp;	Zeiss	LSM510
Yazılımı: Confocor 3	Zeiss
Yazılımı: Eğri uydurma araç kutusu ile Matlab	Matlab	Sürüm R2013b
Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı	Termo-bilimsel	155411	8 kuyu, 1.0 borosilikat alt