Yöntem makalesi

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve

20.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54767

⸱

23 Ağustos 2016

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Özet

Ortaya çıkan bir patojen olan Zika Virüsü (ZIKV), fetal gelişimsel anormallikler ve mikrosefali ile bağlantılıdır. Etkili bir enfeksiyöz hücre kültürü sisteminin kurulması, ZIKV replikasyonu çalışmalarının yanı sıra aşı ve ilaç geliştirme çalışmaları için de çok önemlidir. Bu çalışmada ZIKV ile ilgili çeşitli virolojik analizler gösterilmiş ve tartışılmıştır.

Özet

Zika Virüsü (ZIKV), mikrosefali, göz kusurları, ve bozulmuş büyüme gibi fetal gelişim anomalileri bağlı ortaya çıkan bir patojendir. ZIKV Flaviviridae ailesinin bir RNA virüsüdür. ZIKV esas sivrisinekler tarafından iletilir, ama aynı zamanda fetal dikey geçiş yanı sıra cinsel temas için maternal tarafından yayılır. Bugüne kadar, virüs tarafından enfekte olanlar korumak için hiçbir güvenilir tedavi veya aşı seçenekleri vardır. tekrarlanabilir etkili Zika virüsü enfeksiyon hücre kültür sisteminin geliştirilmesi ZIKV çoğaltma gibi aşı ve ilaç geliştirme moleküler mekanizmalarının incelenmesi için kritik önem taşır. Bu bağlamda, virüs üretimi ve büyüme analizi için bir memeli hücresi bazlı in vitro Zika virüs kültür sistemi açıklayan bir protokol burada rapor edilmektedir. viral titresi ölçmek için bir hücre tek ve plak deneyi ile ilgili Zika virüsünün plakların oluşumu ile ilgili ayrıntılar sunulmaktadır. Viral genomun replikasyonu kinetiğive çift kollu bir RNA genomu replicatory ara belirlenir. Bu kültür platformu, interferon-a (IFN-α) tanımlanmasında ortaya çıkan küçük sitokin kümesinin bir kütüphanede karşı ekran için kullanılmıştır, IFN-β ve Zika viral büyüme potent inhibitörleri olarak, IFN-γ. Özetle, bir in vitro enfeksiyon Zika viral kültür sistemi ve çeşitli virolojik deneyler büyük ölçüde daha viral patogenez mekanizmaları ve viral virulans evrimini durulaştırmada araştırma toplum yararına potansiyeline sahip bu çalışmada, ortaya konmuştur. Antiviral IFN-alfa ayrıca enfekte hamile kadınlar da dahil olmak üzere yüksek riskli toplumlarda Zika virüs enfeksiyonları için profilaktik, maruziyet sonrası profilaktik ve tedavi seçeneği olarak değerlendirilebilir.

Giriş

Zika Virüsü (ZIKV) mikrosefali ve kötü gebelik 1,4 çıktıları ile ilişkili önemli bir patojendir. ZIKV gibi Dengue, Batı Nil, ve St Louis ensefalit virüsleri gibi nörolojik bozukluklara neden olabilir tıbben ilgili flavivirüslerin kümesine aittir. Viral başlıca bulaşma ek olarak, cinsel iletim de 5,6 rapor edilmiştir, sivrisinek vektörü Aedes aegypti tarafından ve. ZIKV nedeniyle sivrisinek vektör genişleyen coğrafi dağılımı ve doğum kusurları ile güçlü korelasyon büyük bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir. ZIKV ilk Zika ormanda bir sentinel rhesus maymun 1947 yılında izole edilmiştir, Uganda ve ilk insan olgusu 1952 7,8....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: iş akışının şematik taslağı Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Hücreler

  1. Zika virüs üretimini ve viral replikasyon döngüsü analizi için Vero hücreleri kullanır.
  2. Tam,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, penisilin (100 birim / ml), streptomisin ihtiva eden büyüme ortamı (100 birim / ml) ve 10 mM HEPES hazırlayın.
  3. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de belirtilen tam büyüme ortamı ile kültür Vero hücreleri.

2. Zika Virüs Üretimi

  1. T-75 balonuna% 0.25 tripsin kullanılarak% 80 hücre yoğunluğunda Vero hücreleri hasat ve hücreleri saymak.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Sonuçlar

    Bir Zika viral suşu, Asya genotip (PRVABC59 GenBank erişim numarası KU501215) Bu çalışmada 12 kullanılmıştır. % 80 birleşme Vero hücreleri de novo Zika viral enfeksiyon araştırmak için kullanıldı. Viral üretiminde ve daha sonra virolojik karakterizasyonu için, erken geçit (P3) Zika virüsü kullanılmıştır. Viral plaklar enfeksiyon ikinci gününde gözlendi. Başlangıçta enfekte olan hücre serbest Zika, viral yavrularıyla tek tabakalı kültürü (Şekil 2) görü.......

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Tartışma

    Burada, in vitro Zika virüsü kültürü için bir aerodinamik protokol sunulmuştur. Virüs kültürü genişleyen titresi ölçmek ve sağlanan genom replikasyonu ölçülmesi için en uygun uç noktalarının belirlenmesi de dahil olmak üzere kritik adımlar. Zika virüsü enfeksiyon ajanlarını işlerken, biyogüvenlik prosedürleri sıkı takip edilmelidir, bir insan patojeni, yani. Bir maymun böbrek hücre çizgisi, Vero çeşitli virolojik ölçümlerde göstermek için kullanılmıştır. Zika viral replikasyon kinetiği, çeşitli doku ve tür hücr.......

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Açıklamalar

    Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

    Teşekkürler

    ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri'nden (CDC) Dr. Aaron Brault ve Dr. Brandy Russell'a Zika viral suşunun PRVABC59 sağladıkları için teşekkür ederiz. Yale Üniversitesi'nden Nicholas Ten'e bu el yazmasını kopyaladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cedars-Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Programatik Araştırma Ödülü tarafından V.A. tarafından desteklenmiştir.

    ....

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)Sigma Yaşam BilimleriD5796
    HEPESYaşam Teknolojileri15630080
    GlutamaxYaşam Teknolojileri35050061
    %2,5 Tripsin, 10x [-] Fenol Kırmızı   Corning25-054-C1
    Tripan Mavi Leke %0.4YaşamTeknolojileriT10282
    Kontes – Otomatik Hücre SayacıThermoFisher ScientificC10227
    Kontes hücre sayımı ve oda slaytlarıThermoFisher ScientificC10283
    Rneasy Mini KitQiagen74104
    Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
    fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2 İngilizce & Bilimsel Danışmanlık Kft.
    Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594Yaşam TeknolojileriA11020
    SUPERSCRIPT III RT Yaşam Teknolojileri18080085
    SYBR QPCR SUPERMIX, ROX ILEYaşam Teknolojileri11744500
    QuantStudio12K Flex Gerçek Zamanlı PCR SistemiThermo Fischer4471088
    RNase İçermeyen DNasePromegaM6101
    Vero Hücre Hattı ATCCCCL-81
    Zika viral suşu PRVABC59Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC)
    IL-6Peprotech200-06                         
    IL-1 alfa             Peprotech200-01A                   
    TNF-alfaPeprotech300-01A                   
    İnterferon alfa A   Ar-Ge D Sistemleri11100-1
    İnterferon betaPeprotech300-02BC
    İnterferon gamaPeprotech300-02
    Santrifüj 5415REppendorf5415R
    Santrifüj 5810REppendorf5810R
    Nikon Eclipse Ti İmmünofloresan Mikroskobu, Nikon Intenselight C-HGFIile NikonZiyareti İstek
    10010200 için Nikon

    Kaynaklar

    1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
    2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
    3. Mlakar, J., et al.....

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Yeniden basım ve izinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

    İzin iste

    Etiketler

    Viral Titre AnaliziPlak Olu umuGenom Replikasyonunterferon TedavisiSitokin TaramasVero H crelerimm nositokimyaRT qPCR

    İlgili makaleler