Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve

20.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54767

⸱

23 Ağustos 2016

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Özet

Ortaya çıkan bir patojen olan Zika Virüsü (ZIKV), fetal gelişimsel anormallikler ve mikrosefali ile bağlantılıdır. Etkili bir enfeksiyöz hücre kültürü sisteminin kurulması, ZIKV replikasyonu çalışmalarının yanı sıra aşı ve ilaç geliştirme çalışmaları için de çok önemlidir. Bu çalışmada ZIKV ile ilgili çeşitli virolojik analizler gösterilmiş ve tartışılmıştır.

Özet

Zika Virüsü (ZIKV), mikrosefali, göz kusurları, ve bozulmuş büyüme gibi fetal gelişim anomalileri bağlı ortaya çıkan bir patojendir. ZIKV Flaviviridae ailesinin bir RNA virüsüdür. ZIKV esas sivrisinekler tarafından iletilir, ama aynı zamanda fetal dikey geçiş yanı sıra cinsel temas için maternal tarafından yayılır. Bugüne kadar, virüs tarafından enfekte olanlar korumak için hiçbir güvenilir tedavi veya aşı seçenekleri vardır. tekrarlanabilir etkili Zika virüsü enfeksiyon hücre kültür sisteminin geliştirilmesi ZIKV çoğaltma gibi aşı ve ilaç geliştirme moleküler mekanizmalarının incelenmesi için kritik önem taşır. Bu bağlamda, virüs üretimi ve büyüme analizi için bir memeli hücresi bazlı in vitro Zika virüs kültür sistemi açıklayan bir protokol burada rapor edilmektedir. viral titresi ölçmek için bir hücre tek ve plak deneyi ile ilgili Zika virüsünün plakların oluşumu ile ilgili ayrıntılar sunulmaktadır. Viral genomun replikasyonu kinetiğive çift kollu bir RNA genomu replicatory ara belirlenir. Bu kültür platformu, interferon-a (IFN-α) tanımlanmasında ortaya çıkan küçük sitokin kümesinin bir kütüphanede karşı ekran için kullanılmıştır, IFN-β ve Zika viral büyüme potent inhibitörleri olarak, IFN-γ. Özetle, bir in vitro enfeksiyon Zika viral kültür sistemi ve çeşitli virolojik deneyler büyük ölçüde daha viral patogenez mekanizmaları ve viral virulans evrimini durulaştırmada araştırma toplum yararına potansiyeline sahip bu çalışmada, ortaya konmuştur. Antiviral IFN-alfa ayrıca enfekte hamile kadınlar da dahil olmak üzere yüksek riskli toplumlarda Zika virüs enfeksiyonları için profilaktik, maruziyet sonrası profilaktik ve tedavi seçeneği olarak değerlendirilebilir.

Giriş

Zika Virüsü (ZIKV) mikrosefali ve kötü gebelik 1,4 çıktıları ile ilişkili önemli bir patojendir. ZIKV gibi Dengue, Batı Nil, ve St Louis ensefalit virüsleri gibi nörolojik bozukluklara neden olabilir tıbben ilgili flavivirüslerin kümesine aittir. Viral başlıca bulaşma ek olarak, cinsel iletim de 5,6 rapor edilmiştir, sivrisinek vektörü Aedes aegypti tarafından ve. ZIKV nedeniyle sivrisinek vektör genişleyen coğrafi dağılımı ve doğum kusurları ile güçlü korelasyon büyük bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir. ZIKV ilk Zika ormanda bir sentinel rhesus maymun 1947 yılında izole edilmiştir, Uganda ve ilk insan olgusu 1952 7,8 bildirildi. ateş, döküntü, baş ağrısı, konjunktivit ve kas / eklem ağrısı gibi hafif belirtileri olan mevcut ZIKV ile enfekte bireyler. Enfekte hamile kadınlar gelişmekte olan fetus 1'e ZIKV iletebilir. ZĐKV enfeksiyonu da Guillain-Barre sendromu, periferik sinir oto-immün demiyelinasyon hastalığı 9 ile bağlantılı olmuştur.

Zika viral genomun uzunluğu yaklaşık 10.8 kilobaz olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA molekülü içerir. genomun yapısı, bir protein-kodlama bölümünü eteklendiren kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCR) ile 5'NCR-Cı-prM-e-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3'NCR olarak düzenlenmiş 6. Tek bir poliprotein (3419 aa) o eş ve post-translasyonel 10 daha küçük peptidler halinde bölünmüş olan çevrilmiştir. 5'NCR ve 3'NCR RNA kök döngü yapıları Hem viral genomun çeviri ve replikasyon başlamasından kritik bir rol oynar. genomun yapısal bileşenleri kapsid, membran ve zarf proteinlerinin oluşmaktadır. yapısal olmayan proteinleri genom replikasyonu için kritik öneme sahiptir.

Şu anda, Zika viral suşları üç ana genotipler ayrılır: Batı AfrikaDoğu Afrika ve Asya 6,10-13. Bu teklif edildiğini daha sonra daha 12 gelişti Batı Afrika ve Asya'ya yayıldı Doğu Afrika soy. Asya genotip Amerika'da mevcut salgınlar sorumludur. Zika virüsü sivrisinek ve memeli hücrelerinde hem de kültürlenebilir. Primer dermal fibroblastlar, olgunlaşmamış dendritik hücreler, kortikal nöral projenitör hücreleri, Vero hücreleri, Zika viral enfeksiyona 10,14,15 duyarlıdırlar. Hem tip I ve tip II interferonlar cilt fibroblastlar 15 ZIKV büyümesini sınırlamak için gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı, bir memeli hücre kültür sistemi, üretim ve Asya genotip ZIKA virüs tipi PRVABC59 deneyleri için aşamalı bir ayrıntılı protokol sağlamak ve ilaç geliştirme ortamı olarak, bu enfeksiyon kültür sisteminin kullanılmasını göstermek için vardır. Bu kaynak büyük ölçüde daha i aydınlatmak için Zika viral ve nörolojik araştırma toplum yararına potansiyeline sahipViral patogenez ve viral virulans evrimi ts mekanizmaları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: iş akışının şematik taslağı Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Hücreler

  1. Zika virüs üretimini ve viral replikasyon döngüsü analizi için Vero hücreleri kullanır.
  2. Tam,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, penisilin (100 birim / ml), streptomisin ihtiva eden büyüme ortamı (100 birim / ml) ve 10 mM HEPES hazırlayın.
  3. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de belirtilen tam büyüme ortamı ile kültür Vero hücreleri.

2. Zika Virüs Üretimi

  1. T-75 balonuna% 0.25 tripsin kullanılarak% 80 hücre yoğunluğunda Vero hücreleri hasat ve hücreleri saymak.
    1. T-75 kültür şişelerinde ortamı aspire ve 2 ml fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkayın.
    2. % 0.25 tripsin 2 ml ilave edilir ve 5 dakika için 37 ° C 'de balon inkübe edin.
    3. Tripsin etkisiz hale getirmek için bir büyüme ortamı içeren serum 8 ml ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı suspend hücreler 15 ml tüp hücreleri transferi vb.
    4. hücrelerin 10 ul çıkarın ve% 0.4 tripan mavisi eşit miktarda karıştırın. hücre sayım odası slayt hazırlanan karışımı yükleyin ve otomatik kan sayım cihazının kullanıldığı sayımları canlı hücre elde.
  2. T-160 şişesi içine 30 ml hacim içinde 7.000.000 hücre toplam tohum.
  3. Ertesi gün, şişesi başına 10 ml serum serbest kültür ortamı Zika virüs inokulum (0.1 İçişleri Bakanlığı 0.01) enfeksiyon uygun bir çokluğu hazırlar.
  4. T-160 şişesi harcanan Ortamı çıkarın ve taze hazırlanmış viral inoculum (10 mi) ilave edin.
  5. 4-6 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inoküle şişeleri inkübe edin. yavaşça her saatte yan şişeleri eğerek inokulum yayıldı.
  6. İnkübasyonun tamamlanmasından sonra, her şişenin sıcak serum desteklenmiş büyüme ortamı (30 mi) ile inokulum değiştirin. Ardından bir sonraki 96 saat boyunca viral kültür devam ediyor.
  7. içinde ilerlemesini doğrulamaBir faz kontrast mikroskobu kullanarak ve 40X ve 200X büyütmede gerektiği gibi görüntüleri (Şekil 2) almak hücre tek tabaka viral plakların görünümünü gözlemleyerek Fection.

figure-protocol-1
Şekil 2:. Çeşitli büyütme Vero hücrelerinin bir tek tabaka üzerinde Zika virüs tarafından oluşturulmuş Plaklar Aydınlık alan ve görüntüler 48 HPI de Zika virüs plakları göstermektedir. tek tabaka yuvarlak hücre odakları varlığını unutmayın. (Ölçek çubuğu = 50 um) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. 96 saat zaman noktasında ve santrifüj 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de süpernatan hasat hücre kültürü süpernatanları hücre debrisini uzaklaştırmak için.
  2. Dikkatle rahatsız pelet haline enkaz ve transfer t olmadan süpernatant kaldırmak15 ml tüpler o. 24.000 xg, ultra santrifüje (isteğe bağlı), viral parçacıklar konsantre gerçekleştirilebilir.
  3. -80 ° C 'de birden fazla alikotları viral kültür süpernatanlarının saklayın.

Plak Testi ile 3. Ölçme Zika Virüs Titre

  1. 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 ml hacim içinde oyuk başına 1 x 10 5 hücre Tohum naif Vero hücreleri.
  2. Ertesi gün, serumsuz ortam kullanılarak T-160 şişesi toplanan virüs kültürü yüzen maddelerinin seri seyreltil 10 kat hazırlar. Her harcanan medyayı iyi çıkarın ve üç kopya halinde Vero hücrelerinde üzerine hazırlanan inokulum 400 ul ekleyin.
  3. 37 aşılandı şişeler inkübe 4-6 saat boyunca% 5 CO2 ile ° C. yavaşça her bir saatte yana plaka eğerek inokulum yayıldı.
  4. İnkübasyonun sonunda, serum takviye ortamla inokulum (oyuk başına 2 mi) değiştirin.
  5. 48 saat sonrası aşılama at, bir faz Contr kullanılarak viral odağını saymakast mikroskop. ml başına plak oluşturucu birim (pfu) gibi viral titresi hesaplanır. Plak analizi için Şekil 3'e bakınız.
  6. Düzeltmek ve plakların açık bir görünüm için% 20 etanol içinde hazırlanmıştır% 4 formaldehit hücreleri ve% 0.1 kristal mor çözelti leke.

4. Zika Viral genom replikasyonu Deneyi

  1. 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 mi hacminde göz başına 1 x 10 5 hücre Tohum saf Vero hücreleri. üç kopya halinde serumsuz ortam kullanılarak, düşük ve yüksek titresi, Ertesi gün, viral inokulum (400 ul / göz, 0.01 ve 0.1 arasında MOI) hazırlanması. sahte enfeksiyon için, serumsuz ortam (400 ul / göz) kullanın.
  2. 3.4 adımları 3.2 tekrarlayın.
  3. 48 ve 96 saat zaman noktalarında, RNA ve immunositokimya (ICC) için numune toplayın.
    1. hasat RNA örnekleri için, ortamı çıkartın ve sonra lizatları iyi doğrudan her lizis çözeltisi 400 ul ekleyin ve toplamak.
    2. ICC, medya ve t kaldırmakTavuk her bir metanolün 1 mi ekleyerek hücreleri düzeltmek ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe plakası.
    3. hücre lizatından, üreticinin talimatlarına göre, bir RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole eder. Bir spektrofotometre kullanılarak RNA sayısal olarak.
  4. Hasat RNA'dan ZIKV genom içeriğini belirlemek için, iki aşamalı bir ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) uygulayın.
    1. RNA nın ters transkripsiyonunu için, ilk olarak, 0.2 ml tüp içinde izole edilmiş RNA 5 ug, dNTP (10 mM) 1 ul, 1 ul rastgele heksamer (250 ng) içeren bir 13 ul reaksiyon karışımı ayarlayın. 5 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir tüp inkübe ve daha sonra bir dakika süreyle buz üzerine yerleştirin. Daha sonra, ters transkriptazın 1 ul 5x iplik sentez tamponu 4 ul 0.1 M ditiyotreitol ve 1 ul ve reaksiyon karışımı RNaz inhibitörü 1 ul ekle. 50 ° C ve inactiv 60 dakika, ardından 25 ° C'de ek 5 dakika boyunca tüp inkübe15 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtılarak reaksiyon yedi.
    2. qPCR 2x yeşil boya süper karışımı 12.5 ul içeren DNA polimeraz ve Zika virüsü [için Zika virüs pan-genotip primerler (spesifik 10 mM bireysel primerlerin 1 ul sonuçlanan cDNA 1 ul kullanarak gerçekleştirin: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika virüsü Asya genotip PRVABC59 soyu primerler (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], ya da hepatit C virüsü (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') için veya hücresel ev bakıcısı geni GAPDH (: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3'), bir 25 ul reaksiyon hacmi içinde.
    3. çalışma durumunu 15 sn için 95 ° C, gerçek zamanlı PCR sistemi içinde 30 sn (40 döngü) 60 ° C ile PCR gerçekleştirin.
    4. Z normalleştirmek için döngü eşiğe göre (Ct) değeri GAPDH ifade düzeyini kullanmakika viral genomun ölçümü. GAPDH kıyasla Zika genomunun delta Ct (ACt) değerini hesaplayın ve 2 ACt değerini elde. Daha sonra, belirtilen zaman noktalarında enfekte olan ve olmayan hücreler arasında normalize Zika genom içerik oranı alınarak kat değişimi hesaplamak. ZIKV genom çoğaltma sonuçları için bakınız Şekil 4.
  5. metanol sabit hücreler kullanılarak ICC gerçekleştirin.
    1. (PBS içinde% 0.1 Triton-X 100,% 3 keçi serumu,% 3 BSA) 1 x PBS ile sabitlenmiş hücreler üç kez yıkayın ve ICC bloke tamponu ile bloklayın.
    2. bloke edici tampon içinde 100 ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe: 1 seyreltme fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2 (1 ug / ml) kullanın.
    3. 1x hücrelerin PBS ile yıkayın ve 1 de ikincil antikor keçi anti-fare IgG-594 (1 ug / ml) ekleyin: bloke tamponu içinde 1.000 seyreltme ve oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edin.
    4. Hoechst boyası kullanılarak çekirdekleri için 1x PBS ve leke hücreleri yıkayın ve100X büyütmede bir floresan mikroskop (Şekil 4) kullanarak hücrelerin gözlemleyin.

Zika virüs enfeksiyonuna karşı sitokin kütüphane tarama 5.

  1. De 12 oyuklu plaka kullanılarak göz başına 1 x 10 5 hücre naif Vero hücreleri tohumu. Hücreler (6 saat Ekim sonrası) birleştirildikten sonra, biyolojik çiftleri belirtilen konsantrasyonlarda (2 ml hacim / oyuk) her bir sitokin ekleyin. Araç (PBS) tek başına kontrol içerir.
  2. 12 saat tedavi sonrası, Zika viral enfeksiyon (kuyu başına 0.1 400 ul İçişleri Bakanlığı) gerçekleştirin. enfeksiyon (sahte) olmadan negatif kontrol kuyuları yer alır.
  3. 4 saat sonrası enfeksiyon, sitokin muamele ortam (2 mi) ile, viral aşının değiştirin. Ek 44 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
  4. 48 saat sonrası enfeksiyon, bir faz kontrast mikroskop kullanılarak viral plaklar sayısı ve 40X büyütmede (Şekil 5) ile enfekte hücrelerin temsili görüntüler elde.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bir Zika viral suşu, Asya genotip (PRVABC59 GenBank erişim numarası KU501215) Bu çalışmada 12 kullanılmıştır. % 80 birleşme Vero hücreleri de novo Zika viral enfeksiyon araştırmak için kullanıldı. Viral üretiminde ve daha sonra virolojik karakterizasyonu için, erken geçit (P3) Zika virüsü kullanılmıştır. Viral plaklar enfeksiyon ikinci gününde gözlendi. Başlangıçta enfekte olan hücre serbest Zika, viral yavrularıyla tek tabakalı kültürü (Şekil 2) görü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, in vitro Zika virüsü kültürü için bir aerodinamik protokol sunulmuştur. Virüs kültürü genişleyen titresi ölçmek ve sağlanan genom replikasyonu ölçülmesi için en uygun uç noktalarının belirlenmesi de dahil olmak üzere kritik adımlar. Zika virüsü enfeksiyon ajanlarını işlerken, biyogüvenlik prosedürleri sıkı takip edilmelidir, bir insan patojeni, yani. Bir maymun böbrek hücre çizgisi, Vero çeşitli virolojik ölçümlerde göstermek için kullanılmıştır. Zika viral replikasyon kinetiği, çeşitli doku ve tür hücr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri'nden (CDC) Dr. Aaron Brault ve Dr. Brandy Russell'a Zika viral suşunun PRVABC59 sağladıkları için teşekkür ederiz. Yale Üniversitesi'nden Nicholas Ten'e bu el yazmasını kopyaladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cedars-Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Programatik Araştırma Ödülü tarafından V.A. tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)Sigma Yaşam BilimleriD5796
HEPESYaşam Teknolojileri15630080
GlutamaxYaşam Teknolojileri35050061
%2,5 Tripsin, 10x [-] Fenol Kırmızı   Corning25-054-C1
Tripan Mavi Leke %0.4YaşamTeknolojileriT10282
Kontes – Otomatik Hücre SayacıThermoFisher ScientificC10227
Kontes hücre sayımı ve oda slaytlarıThermoFisher ScientificC10283
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2 İngilizce & Bilimsel Danışmanlık Kft.
Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594Yaşam TeknolojileriA11020
SUPERSCRIPT III RT Yaşam Teknolojileri18080085
SYBR QPCR SUPERMIX, ROX ILEYaşam Teknolojileri11744500
QuantStudio12K Flex Gerçek Zamanlı PCR SistemiThermo Fischer4471088
RNase İçermeyen DNasePromegaM6101
Vero Hücre Hattı ATCCCCL-81
Zika viral suşu PRVABC59Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC)
IL-6Peprotech200-06                         
IL-1 alfa             Peprotech200-01A                   
TNF-alfaPeprotech300-01A                   
İnterferon alfa A   Ar-Ge D Sistemleri11100-1
İnterferon betaPeprotech300-02BC
İnterferon gamaPeprotech300-02
Santrifüj 5415REppendorf5415R
Santrifüj 5810REppendorf5810R
Nikon Eclipse Ti İmmünofloresan Mikroskobu, Nikon Intenselight C-HGFIile NikonZiyareti İstek
10010200 için Nikon

Kaynaklar

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311(2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Viral Titre AnaliziPlak OluşumuGenom Replikasyonuİnterferon TedavisiSitokin TaramasıVero HücreleriİmmünositokimyaRT-qPCR
Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.