Yöntem makalesi

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

DOI:

10.3791/54771

⸱

25 Ocak 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Interactions Arbres – Microorganismes, UMR1136, INRA Université de Lorraine, 2Ecologie et Ecophysiologie Forestières - PTEF, UMR 1137, INRA Université de Lorraine, 3Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel biyofilm sık sık mantar yüzeylerde oluşturacak ve metabolik işbirliği, rekabet veya avlanma gibi çok sayıda bakteri-mantar etkileşim süreçleri, dahil edilebilir. biyofilm çalışma çevre bilimleri, gıda üretimi ve tıp gibi birçok biyolojik alanlarda önemlidir. Ancak az sayıda çalışma Kısmen onları soruşturma zorluğu, bu tür bakteriyel biyofilmlerin odaklanmıştır. literatürde tarif analizleri nitel ve nicel biyofilm yöntemlerin çoğu abiyotik yüzeyleri üzerinde ya da epitelyal hücrelerin tek bir tabakası homojen ince biyotik yüzeyler üzerinde oluşturan biyofilm için uygundur.

Lazer tarama konfokal mikroskopi (LSCM) sıklıkla in situ ve in vivo biyofilmlerinde analiz etmek için kullanılır iken hyphe'nin bakteri biyofilm uygulandığında, bu teknoloji sayesinde kalınlığı ve hifal şebkd üç boyutları, çok zor olurorks. Bu eksikliği gidermek için, biz mantar kolonileri içinde hifal katmanların birikimini sınırlamak için bir yöntem ile mikroskopi birleştiren bir protokol geliştirmiştir. Bu yöntemi kullanarak, biz de LSCM ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak birden fazla ölçeklerde hyphe'nin bakteriyel biyofilm gelişimini araştırmak için başardık. Bu rapor mikroorganizma kültürleri, bakteri biyofilm oluşumu koşulları, biyofilm boyama ve LSCM ve SEM görselleştirme dahil olmak üzere protokol açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mantarlar ve bakteriler en çok karasal ortamlarda yaşayacakları çünkü birbirleri ile etkileşim için birçok fırsat var. Çeşitliliği ve bunların aynı anda her yerde nedeniyle, bu etkileşimler biyoteknoloji, tarım, gıda işleme ve tıp 1, 2 gibi birçok biyolojik alanlarda önemlidir. Moleküler etkileşimler ortaklar arasındaki alışverişi sağlamak yakınlığı belli bir derecede gerektirir ve bazı durumlarda, ortak bir fiziksel ilişki fonksiyonel etkileşim 3 için gereklidir. Bakteri ve mantar arasındaki ortak bir fiziksel ilişki mantar yüzeyleri 4 üzerinde bakteri biyofilmlerin oluşumudur. Bakteri hücreleri ve hyphe'nin arasındaki bu doğrudan temas, çeşitli biyolojik süreçlerde katılan samimi etkileşimleri izin verir. Örneğin, ilaç, Fırsatlar başarıyla Pseudomonas aeruginosa biyofilm çalışmadatunistic mantar patojen Candida albicans biyofilm oluşumu ve virülans 5 arasındaki bağlantı içgörüler sağlayabilir. Tarımda, çalışmalar karışık biyofilm bir mantar ile ilişkili o zaman bitki büyüme destekleyici Bu bakteriler ve biyo bakteriler bir verimlilik artışı olduğu ileri sürüldü. Karışık bir biyofilm 6 kavak mantarı ile birlikte, örneğin, Bradyrhizobium elkanii N2 -fixing aktivitesi arttırmıştır. Son olarak, bio-temizlenmesi için, bakteri, mantar karışık biyofilm kirli sitelerinin 7 iyileştirme, 8 kullanılmıştır.

LSCM bu minimum ön işlemlerin ile sulu biyofilm oturma, böylece, biyofilm yapısını ve organizasyonunu korumanın bir üç boyutlu gözlem izin verdiği için biyofilm çalışma özellikle uygundur. Böylece, LSCM biyofilm analizi, özellikle det, çok bilgilendiriciolgun biyofilm gelişmesine yapıştırma aşamasından, biyofilm zaman sürecini ve karakteristik aşamaları 9, 10 saptanmasını ermin. Aynı zamanda, özellikle biyofilm yapısı ve matris 11, 12 görselleştirmek veya biyofilm boyutu 13, 14 ölçmek için adapte edilir. Bu yöntem, bir mantar ipliksi kolonisi bakteri biyofilm okuyan, abiyotik veya ince biyotik yüzeylerde biyofilm incelemek için uygun olmasına rağmen hala çok zordur. Gerçekten de, çoğu ipliksi mantarlar kültür kalın, karmaşık, üç boyutlu ağlar kurmak. Kalın nesneler konfokal mikroskobu ile görüntülü olabilir olsa bile, lazer penetrasyon zayıflama ve floresan emisyon genellikle 50 mikron 15 derinliğe üzerinde nihai görüntülerin kalitesini düşürür. Ayrıca, mantar kolonileri sert değildir çünkü, benT biyofilm bozmadan mikroorganizmaları ele almak zordur. Ancak örnekler kalınlığı, mantar hyphae'nin bakteri biyofilmlerin birkaç mikroskopik analizleri genellikle bu nedenle sadece az sayıda hif 16, 17, 18 ihtiva eden, mantar kolonisi küçük bir bölümü üzerinde gerçekleştirilir. Bütün bu mantar koloni içinde biyofilm heterojen dağılımı durumunda analiz içine önyargıları getirebilir ve böylece mantar kolonisi üzerinde biyofilm dağılımını açıklamak için yeteneğimizi sınırlar ve.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, büyüme ve mantar hyphae'nin bakteri biyofilm analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, Pseudomonas ectomycorrhizal basidiomiset grubu mantarın Laccaria bicolor S238N bölgesinin hifler üzerinde BBc6 fluorescens biyofilm oluşumunu çalışmak için uygulanmıştır. Bu iki orman-toprak mikroorganizmaları daha önce karma oluşturmak için tarif edilmiştirbiyofilm benzeri yapılar 19, 20. Bu yöntem, kolaylıkla daha başka bir filamentli mantar / bakteri sistemlere adapte edilebilir. Burada sunulan yöntem LSCM ve SEM görüntüleme ile çok ince mantar kolonilerinin büyümesi sağlayan, bir mantar kültürü yöntemi kombinasyonuna dayanmaktadır. Bu biyofilm nitel karakterizasyonu için izin iki mikroorganizma arasındaki etkileşimin görüşlerini ölçek mikro (mikron aralığında) almak ve (mm aralığı) mezo bize izin verdi. Biz de numuneler nano ölçekli düzeyinde (nm aralığında) de biyofilm yapısal analizini izin, SEM ile görülebilir olduğunu gösterdi.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel ve Fungal Kültürler 1. Hazırlık

  1. Mantar kültürleri hazırlanması
    1. Petri kapları ile aynı çapa sahip selofan membranlar hazırlayın ve 30 dakika boyunca EDTA (deiyonize su içinde 1 g / L) içinde kaynatın. deiyonize su ile yaprak durulayın ve iki kez otoklav.
    2. mantar agar aşılayarak bir mantar öncesi kültür hazırlayın EDTA önceden tedavi selofan membran ile kaplı uygun agar ortamı üzerinde takar. koloniler çapı yaklaşık 1 cm elde etmek için uygun bir büyüme sıcaklığında inkübe edin.
      1. L. bicolor S238N için + diNH4 tartrat 0.5 g KH 2 PO4 1 g, MgSO 4 0.5 g .7H 2, O, Maltoz D 5 g yapılan Pachlewski P5 agar ortamı üzerinde 5 gün boyunca 25 ° C'de inkübe , Glikoz D + 20 g,% 10 Tiamin-HCl 1 mi, 1 seyreltilmiş 1/10 mi mikro çözeltisi (6 g / L demir sülfat, 0.27 g / L molibden trioksit, 8.45 g / L, borik asit, 5 g / L adamganese sülfat; 5 g / L bakır sülfat; 2.27 g / l çinko sülfat), deiyonize su ile 1 L'ye yapılan; ve agar 20 g; pH 5.5.
    3. Mantar ön kültür kaynaktan, kolonilerin radyal genişlemesini desteklemek için düşük karbonlu bir agar ortamı içeren EDTA önceden muamele edilmiş selofan zar ile kaplı yeni agar plaka inoküle.
      1. Petri kabı aşılamak için, hafifçe bir neşter ile ön kültürden bir mantar kolonisi (hücreleri aynı fizyolojik durumu var) ve yeni agar plaka hif aktarmak dış alanı çizebilir.
      2. Yeni koloniler çapı yaklaşık 1 cm kadar optimum büyüme sıcaklığında inkübe edin. L. bicolor S238N için p20 agar ortamı (Dinh 4 tartrat, 0.25 g, 5 gün boyunca 25 ° C'de inkübe; KH 2 PO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.25 g glikoz D + 1 g % 10 Tiamin-HCl, 0.5 mi, 1/10 seyreltilmiş mikro çözeltisi (CF 1.1.2 0.5 mi.1), deiyonize su ile 1 L'ye yapılan; ve agar 20 g; pH 5.5).
        Not: nedeniyle selofan öncesi kültüre, ikinci kültür merkezi fişler agar ortamı içermez. Bu fişler agar ve analiz önyargıları oluşturabilir besin tanıtmak beri agar fişler, biyofilm daha fazla analiz için çıkarılmalıdır. Sadece mantar Bu aşaması, muhafaza ve agar plakaları üzerinde yayılır ve sporlar ya da donmuş stoktan yayılır mantarlar için gerekli değildir türlerin.
  2. Bakteri kültürlerinin hazırlanması
    1. (Kullanılan gerginlik bağlı olarak ya da herhangi bir başka uygun bir ortamda), sıvı Luria-Bertani (LB) ortamı içinde 25 ml uygun bir agar ortamı üzerine bir kültürden 2 ila 3 bireysel bakteriyel koloniler, toplamak ve aşılanması için steril bir döngü kullanın. P. BBc6 fluorescens için hafifçe çalkalanarak 28 ° C (~ 150 rpm) bir gecede kültürü kuluçkaya yatmaktadır.
      Not: soyunun kullanılmasımikroskobik gözlemler önce çift boyama (mantar ve bakteri) yerine getirilmesinin önüne geçen, çünkü GFP gibi floresan protein, ile etiketlenmiş, tercih edilir. Zamanlama, karıştırma hızı, ve kuluçkalama sıcaklığı kullanılan soyu geç üstel büyüme bir kültür elde etmek için olan hedef bağlıdır.

Mantar Kolonisi Bakterilerin in vitro biyofilm N 2. Hazırlık

  1. Santrifüj bakteriyel 3 dakika boyunca 5000 x g'de kültürü ve steril 0.1 M potasyum fosfat tampon maddesi (25 g / L KH 2 PO 4 ve 2.78 g / l K 2 HPO 4, pH 5.8), 25 ml pelet askıya. Bir kere yineleyin ve aynı tamponla 10 9 hücre / ml nihai bakteri konsantrasyonu ayarlanır.
  2. Bakteriyel süspansiyon (veya negatif kontrol için, steril 0.1 M potasyum fosfat tamponu), 5 ml ile 6 mikroplakanın doldurun.
  3. Fung selofan membran kestiSteril bir jilet ile al kültürü her membran üzerinde tek bir mantar kolonisi ile selofan kareler elde etmek. Dikkatle forseps kullanılarak katı ortamdan hif ihtiva selofan kareler kaldırmak ve bakteriyel süspansiyonunu içeren mikroplaka bir kuyu selofan ihtiva hif kare aktarın.
  4. mantar kolonileri hala selofan bağlı iken yavaşça mikroplağı sallamak; Daha sonra, plaka fungal koloniler bırakarak, selofan sayfaları çıkarın.
  5. çalışılan mikroorganizmalar için uyarlanmış bir ısıda hafif bir çalkalama (~ 60 dak) mikroplaka inkübe edin.
    Not: inkübasyon süresi, analiz edilecek biyofilmin ve sahne oluşturulması hızına bağlıdır. P. BBc6 / L fluorescens. bicolor, erken evre biyofilm almak için 30 dakika boyunca 20 ° C'de inkübe edilmiş ve 16 st kadar biyofilm olgun alır.

Biyofilm Format 3. Lazer Tarama Konfokal Mikroskop Analiziiyon

  1. örnek hazırlama
    1. Güçlü bir tuz çözeltisi (NaCI, 17 g / L) 17, 5 ml ile dolu yeni bir 6-çukurlu mikro-aktararak mantar durulama hif elektrostatik bağlı planktonik bakterilerin ve bakteri kaldırmak için; nazikçe 1 dakika sallayın.
    2. yavaşça, 2 dakika için sallayın, steril 0.1 M potasyum fosfat tampon maddesi 5 ml ihtiva eden yeni bir 6-yuvalı mikroplakaya mantar transfer ve taze potasyum fosfat tamponuna mantar aktarın.
    3. Elde edilen bölüm, mantar kolonisi yaklaşık yarısını içerecek şekilde, potasyum fosfat tamponu içinde tutarken mantar kolonisi kısmı kesilmiş bir neşter ile görüntülenmek üzere.
    4. örnek leke için, uygun bir floresan boya (analizin amacı ile ilgili olarak) ihtiva eden steril su ile dolu bir Petri kabı transfer ve karanlıkta inkübe edilir.
      1. Mantar ağ görselleştirmek için, örneğin, kullanımı, Kongo Kırmızı (% 0.1 nihai eşncentration, inkübasyondan 5 dakika) ve Alexa Fluor 633 (10 ug / ml nihai konsantrasyonda konjüge, buğday tohumu agglutin (WGA) lektin, inkübasyon 10 dakika) ya da FUN1 (10 uM son konsantrasyon, kuluçkalama 10 dakika).
      2. ticari olarak temin edilebilir bir çok hücreye nüfuz edici DNA, boyalar arasında bir DNA özgü flüoresan sonda ile bakteri hücreleri Counterstain olmayan bir floresan etiketli bakteri kullanarak. Örneğin, DAPI (0.25 ug / ml nihai konsantrasyon, kuluçkalama 10 dakika) kullanın.
      3. Matris proteinleri görselleştirmek için, bir protein leke 21 kullanın.
    5. Boyamadan sonra, steril 0.1 M potasyum fosfat, 10 ml ihtiva eden bir Petri kabı kapağı aktararak örnek yıkayın ve hafifçe 1 dakika çalkalayın.
    6. Yarım Petri kabı kapağı bir slayt batığın ve ince slayt üzerinde yüzer kesim bölümü getirmek. Sonra, yavaş yavaş numune nazikçe slayt üzerinde yerleşmek için izin tampon çözeltisinden slayt kaldırmak.
      Not: Bu adım için, bu biyofilm rahatsızlık önlemek için yavaşça devam etmek çok önemlidir.
    7. Son olarak, numune, anti-solma montaj orta 10 ul bir cam lamel ile örtün.
      Not: slayt hazırlandıktan sonra, mikroskobik analiz kısa sürede yapılmalıdır (en fazla 30 dakika içinde) biyofilm yapısı değişiklik önlemek için.
  2. Konfokal mikroskopik analiz
    1. görüntüleme yazılımı bağlanmış bir 10X veya 40X objektif lens ile konfokal lazer mikroskop altında slaytlar inceleyin.
      Not: Burada, bir çoklu ışın tarama konfokal mikroskop 405, 488, ve 561 nm eksitasyon lazerler, bir Gaasp PMT detektörü ve 10X 0.3 NA ve 40X 1.2 NA hedefleri ile donatılmış kullanılmıştır.
      1. Talep edilen veri tipine ve zaman kısıtlar uyarlanmış parametreleri kullanılarak görüntüleme gerçekleştirin. kullanılan leke ve üreticinin recommendati göre lazer uyarma / emisyon dalga boylarında kullanınons. mantar kolonisi ve biyofilm küresel 3D görüşlerini almak için kiremit tarama ve Z-yığın fonksiyonları bir arada kullanın.
        Not: Şekil 3 Görüntüler aşağıdaki parametreleri kullanılarak elde edildi: 8-bit / piksel, ortalama = 2 = 1.58 mikro-sn, fayans çevrimiçi dikiş (% 10 kapsama, eşik = 0.7) ile 5x5 görüntüleri taramak piksel bekleme; Z adımlı = 2 um.
    2. 3D veri görselleştirme için birçok ücretsiz veya ticari yazılımlarla (bu 3D rendering için birçok seçenek sunan) birini kullanın.
      1. Örneğin, parlak alan kanalını çıkarma, 2D maksimum yoğunluğu projeksiyonları olarak Z-yığın verilerini görüntülemek parlaklık ve kontrast ayarı ve kompozit bir görüntü oluşturmak için kanalları birleştirmek. Varsa, Z-yığın ekstremitelerde sinyali olmadan dilimleri ortadan kaldırır. Sonra, bir 2D maksimum yoğunluk projeksiyonu gerçekleştirmek ve RGB renk içine sonucu dönüştürmek. Görüntüler s elde etmek için ImageJ yazılım 22 "Z projesi" işlevini kullanın2B maksimum yoğunluğu projeksiyonları burada tepkiyle karşılanmıştır.

4. Elektron Mikroskobu Analizi

  1. Adım 3.1.2 hariç, LSCM için tarif edildiği gibi örnekleri hazırlamak durulama adımlarından sonra steril su yerine potasyum fosfat tamponu ile biyofilm aktarın. Bu SEM görüntü alma karıştırmayı olur dehidratasyon adımı sırasında tuz kristallerinin oluşumunu önler.
  2. Bir örnek sahibine biyofilm aktarın ve aşırı su çıkarmak; Sadece örnek karşılamak için küçük bir su film tabakası sağlar.
  3. değişken basınç taramalı elektron mikroskobu (VP-SEM) odasına örnek aktarın; Bir Peltier soğutma sahnede ° C -50 dondurma; ve yavaş dondurma-kurutma için, doğrudan SEM odası içinde, 15 saat süre ile belirlenen değişken basınç 100 Pa ile sağlar.
  4. Dondurarak kurutma işlemi tamamlandıktan sonra, numune almak ve yüksek vakumlu film kaplama sistemi içine aktarın. Platinu 2 nm ile kaplayın örnekm argon plazmanın (2.5 x 10 -2 mbar, 35 mA) altında (kuvars ölçümü).
  5. yüksek "lens" çözünürlüğü dedektörü ve 1 kV elektronik yüksek gerilim kullanarak bir alan emisyon tabanca (FEG) ile donatılmış bir SEM ile kaplanmış örnek gözlemleyin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fungal kültür ve biyofilm hazırlık genel şematik prosedürü, Şekil 1 'de verilmiştir. Kültür yöntemi bize kalın mikro ve mezo ölçekli izin hif birkaç katman içeren 20 ila 50 mikron LSCM kullanarak sulandırılmış yaşam biyofilm analizleri mantar koloniler elde etmek için izin verdi. Yöntemin uygulama P. yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesi biyofilm (- 4 Şekil 2) oluşumu boyunca L. bicolor hifler üzerinde BBc6 biyofilm fluorescens izin verdi.

Biyofilm mezo ölçekli analizi P. biyofilm heterojen dağılımı L. bicolor S238N ve hif (Şekil 2 ve 3) üzerine BBc6 fluorescens gösterdi. Mezo-ölçekli analizi de zamanla biyofilm oluşumunun takibi (Şekil izin3) Sadece bazı bakteri hifler (Şekil 3a bağlı edildiği erken safhalarında) ile ilgili), kalın, olgun bir biyofilm (Şekil 3b oluşumuna. Mezo ölçekli görüntüleri yüksek çözünürlüklü bizi koloni mimarileri (- d Şekil 3c) elde etmek amacıyla aynı görüntülerde mikro ölçekli analizi gerçekleştirmek için izin verdi.

Belirli etiketleme ile kombine mikro ölçekli analiz biyofilm karakterizasyonu bir adım daha ileri gitmek sağladı. Burada, proteinlerin çoğu sınıfları etiketler SYPRO Ruby 23, numune (Şekil 4) uygulanır ve matriks proteinlerinin mevcudiyetini göstermektedir edildi.

Son olarak, biyofilm yapısının daha detaylı bilgi için dehidrasyon ve kaplamanın (Şekil 5) sonra aynı numune SEM görüntüleme ile elde edilmiştir. SEM görüntüleme Resimnanoölçekli seviyesine erişim, böylece matris yapısına erişim sağlayarak.

figure-results-1
Şekil 1: mantar kültürü ve biyofilm hazırlık Genel şematik prosedür. Bu rakam analizleri örnek mikroorganizma kültürleri, yöntemin temel adımları açıklar. Daha fazla detay protokolde verilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: mantar kolonisi üzerinde BBc6 biyofilm yeniden bölme. Numune 10X büyütmede etkileşim 18 saat sonra görüntülendi. Görüntü 3D konfokal mikroskopi görüntüleri 2D maksimum intensite projeksiyon yoluyla elde edilmiştir. figu gri ızgaraYeniden mozaik pozisyonları göstermektedir. L. bicolor hifler Kongo Kırmızısı (kırmızı) ve bakteri ile GFP etiketli (yeşil) vardır boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: L. bicolor hifler üzerinde BBc6 biyofilm oluşumunun erken ve geç evreleri. Bu görüntü 3D konfokal mikroskopi görüntüleri 2D maksimum intensite projeksiyon yoluyla elde edilmiştir. Görüntüleme 40X büyütmede yapılmıştır. (A) etkileşim 2 saat sonra yeniden bölmek biyofilm. Etkileşim 14 saat sonra (b) Biyofilm yeniden bölme. (C), beyaz bir dikdörtgen genişleme (a) dır. (D) 'de beyaz bir dikdörtgenin Büyütme (B). GFP-ta mantar hyphae'nin Kongo Kırmızısı (kırmızı) ve bakteriler ile boyanır olangged (yeşil). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: L. bicolor hifler üzerinde BBc6 biyofilm Matris boyama. (A) etkileşim 16 saat sonra Biyofilmlererde. (B) de beyaz bir dikdörtgenin Büyütme (a) dır. Görüntüleme 40X büyütmede yapılmıştır ve bu görüntülerin 3D konfokal mikroskopi görüntü 2D maksimum yoğunluk projeksiyon ile elde edildi. Bakteri GFP etiketli (yeşil), mantar FUN1 (koyu yeşil) ile boyandı, ve proteinler S. Ruby (kırmızı) ile boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 5: L. bicolor hifler üzerinde BBc6 biyofilm SEM görüntüleme. SEM görüntü alma EHT, 2360X gerçekleştirildi: 1kV. görüntüleme önce, numune yavaşça SEM bölmesine dondurarak kurutuldu ve platin kaplanmış. Yeşil oklar bakteriyel biyofilmlerin işaret ve sarı oklar hyphe'nin işaret etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel biyofilmler birçok ortamda elde edilir ve 1950'lerden beri incelenir, bu da onları analiz etmek için bir dizi yöntemin geliştirilmesine yol açar24. Biyofilmleri ölçmek ve izlemek için kullanılan klasik yöntemler arasında mikro titre tahlilleri ve en yaygın kullanılan yöntem olan kristal mor (CV) boyama yer alır. Bu yöntemler hızlı, düşük maliyetli ve kullanımı kolaydır25 ve özellikle toplam biyofilm biyokütlesini ölçmek veya canlılık ve matris niceleme deneyleri yapmak için yararlıdır. Öte yandan, biyofilm çalışmalarında "omik" yöntemler de yararlıdır ve biyofilmlerin nicel ve fonksiyonel analizlerine izin verir26,27. Mikro titre plakası ve "omik" yöntemlerinin avantajlarına rağmen, biyofilmlerin bazı temel özellikleri bu tekniklerle yakalanamaz ve bu sürecin tam olarak anlaşılmasını engeller. Bu tür özellikler, hem biyofilmlerin işleyişini hem de oluşum dinamiklerini anlamak için anahtar veriler olan matris yapılarını, bakteri koloni mimarilerini, hücre/hücre etkileşimlerini ve kolonizasyon modellerini içerir. Mikroskopinin bu özellikleri yakalama kapasitesine rağmen, ipliksi mantarlar üzerindeki bakteriyel biyofilmlerin mikroskopi analizi hala azdır. Bunun başlıca nedeni, genellikle kalın, karmaşık, üç boyutlu ağlardan oluşan koloniler oluşturan ipliksi mantarların büyümesidir. Mantarlar üzerinde bakteriyel biyofilm oluşumu çeşitli ortamlarda yaygındır ve çeşitli alanlarda önemli ölçüde yer alır4 (örneğin, tıp, tarım ve çevre); bu nedenle, araştırmalarını kolaylaştırmak için yeni yöntemler geliştirmek çok önemlidir. Bu amaçla, çok ince mantar kolonileri oluşturmak için bir yöntemi bakteriyel biyofilmlerin mikroskobik görüntülemesiyle birleştirdik. Ek olarak, bu biyofilmleri niteliksel olarak analiz etmek için bir dizi mikroskopi aracı önerdik. Yöntemin başarısı, çok ince hif kolonileri üretme ve uygun boyaları uygulama yeteneğine bağlıdır. Bu noktalar aşağıda tartışılmaktadır.

Biyofilmlerin karmaşık yapıları nedeniyle, işlevlerini anlamak çok ölçekli bir yaklaşım gerektirir28,29. Biyofilmlerin dağılım modelleri, bakteri koloni mimarisi ve matris yapısı ve bileşimi farklı ölçeklerde (yani mezo ölçekli ve mikro ölçekli) analiz edilir. Ayrıca, nano ölçekli çözünürlük, hücre/hücre fiziksel etkileşimlerine ve matrisin nano yapısına erişim sağlar. Böylece geliştirilen yöntem, mantar kolonisi üzerinde oluşan bakteriyel biyofilmlerin çok ölçekli bir analizini kolayca sağlar.

Çoğu çalışmada, biyofilmlerin LSCM analizleri mikro ölçekle sınırlıdır, mezo ölçek genellikle optik koherens tomografi30,31,32 ile gerçekleştirilir. Burada sunulan yöntem, LSCM ile hem mikro hem de mezo ölçekli analizlere olanak sağlar. Her iki analizin numunenin aynı bölgesinde ve hatta aynı görüntü üzerinde yüksek çözünürlüklü yeni nesil konfokal mikroskoplar kullanılarak birleştirilmesinin faydasını göstermektedir (Şekil 3). Böylece, farklı ölçeklerde farklı yöntemlerle toplanan derlenmiş verilerle bağlantılı sorunlar burada önlenir.

Bu analiz kombinasyonu, mantar kolonisi üzerindeki biyofilm yeniden bölünmesine, gelişen biyofilm boyunca bakteri kolonisi mimarisine ve matris yapısına eşzamanlı olarak erişim sağladı. Mezo ölçekli analiz, mantar kolonileri üzerindeki bakteriyel biyofilmlerin heterojen bir dağılımını gösterdi (Şekil 2 ve 3). Bu gözlem, mantar kolonisinin yalnızca küçük bir bölümünün görüntülenmesine izin veren protokollerle mümkün olmazdı, bu da tüm koloniyi temsil etmesi gerekmez. Bu nedenle, genellikle ihmal edilse de, mezo ölçekli analiz, biyofilm dağılım modelleri hakkında değerli bilgiler verebilir.

Son olarak, geliştirilen yöntem, taramalı elektron mikroskobu da dahil olmak üzere farklı mikroskopi teknikleriyle numuneleri analiz etmek için kullanılabilir. Burada nano ölçeğe ulaşmak ve biyofilm içindeki bakteriyel uzamsal organizasyonu elde etmek için SEM kullanıldı. İnce mantar kolonilerinde çok iyi performans gösterirken, SEM yalnızca yüzey görüntülemeye izin verdi. Bununla birlikte, LSCM'nin aksine, SEM, numune dehidrasyonu ve çoğu zaman iletken bir metal ile kaplama gerektiriyordu. Bu dehidrasyon işlemi, uygun şekilde yürütülmediğinde biyolojik yapıları değiştirebilir ve optimizasyon gerektirebilir. Burada, yavaş liyofilizasyon kullanılarak numune dehidrasyonu kullanıldı33. Bununla birlikte, numunelere hem LSCM hem de SEM uygulanması, numunenin aynı yerinde bağıntılı mikroskopi yapılmasına izin verecektir.

Yukarıda açıklanan avantajlara rağmen, bazı sınırlamalar mevcuttur. İlk olarak, her tür mantar için geçerli olmayabilir. Gerçekten de bu kültürleme yöntemi, katı ortamın yüzeyinde radyal olarak yayılan mantarlar için geliştirilmiştir. Bu yöntem, esas olarak hava hifleri (örneğin, Fusarium sp.) oluşturan mantarlar veya esas olarak agar içinde yayılan mikro-aerobik mantarlar için uygun olmayabilir. Ayrıca, selofanı parçalayan mantarlar da sorunlu olabilir (örneğin, Trichoderma sp.)olarak ayarlayın. İkinci olarak, boyama stratejisinin kritik bir nokta olduğunu ve lekenin biyofilmi bozmaması gerektiğinden leke seçiminin dikkatli yapılması gerektiğini unutmamak önemlidir. Örneğin, Calcofluor White'ın muhtemelen bu lekenin yüksek pH'ı nedeniyle kısmi biyofilm bozulmasına neden olduğunu fark ettik (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, bazı boyalar heterojen boyama üretirken (örneğin, Kongo Kırmızısı), diğerleri homojen boyama (örneğin, WGA lektin ile hücre duvarı boyama) üreterek heterojen bir görüntü kalitesi verdi. Ayrıca, bazı boyaların tam olarak spesifik olmayabileceğinin farkında olmak önemlidir. Örneğin, WGA sadece mantar hücre duvarlarını değil, aynı zamanda gram pozitif bakteri hücre duvarlarında N-asetilnöraminik asidi ve biyofilm oluşumu sırasında gram pozitif ve -negatif bakteriler tarafından üretilen adezinleri de boyar 34,35. Bu nedenle, çoklu lekelenmeyi önlemek için floresan protein etiketli bakteri ve/veya mantarların kullanılması önerilir. Birden fazla boya kullanılıyorsa, kimyasal olarak karışmamalı ve emisyon spektrumları örtüşmemelidir.

Mezo-ölçekli analizler geniş bir tarama alanı gerektirir ve bu nedenle LSCM zaman alıcı olabilir (numune kalınlığına bağlı olarak 40 dakika ila 1 saat) ve çok sayıda numunenin analizinde darboğaz oluşturabilir. Bununla birlikte, gerekli veri türüne bağlı olarak ayarlamalar yapılabilir. Görüntü kalitesini değiştirerek çekim süresini ve görüntü boyutunu azaltmak mümkündür. Örneğin, biyofilm genel rebölümlemesini analiz etmek için yüksek çözünürlük gerekli değildir.

Son olarak, Z yığını verilerini 2B veya 3B projeksiyonlar olarak görüntülemeyi seçerken bazı sınırlamaların dikkate alınması gerekir. İki boyutlu projeksiyonlar, verileri özetlemenin iyi bir yoludur, ancak derinlik bilgisi kaybolur ve üst üste binen yapılar gizlenir. Öte yandan, 3D projeksiyonlar farklı bakış açılarından görselleştirmeye izin verir, ancak mekansal karmaşıklık durumunda genellikle kötü işlenirler.

Sonuç olarak, yapısal düzeyde hifler üzerindeki bakteriyel biyofilmlerin karakterizasyonu için bir yöntem bildirdik. Metodoloji diğer uygulamalara genişletilebilir. Gerçekten de bu yöntem, mantar hifleri üzerinde oluşan bakteriyel biyofilmlerin fonksiyonel veya kimyasal karakterizasyonunun gerçekleştirilmesine izin verir. Mevcut floresan raportör sistemlerinin çok çeşitli olması nedeniyle, LSCM analizi birden fazla amaç için kullanılabilir29. Örneğin, floresan mikroskobu, pH gradyanını36 veya biyofilmlerdeki molekül difüzyonunu37 izlemek için kullanılabilir. Ek olarak, yöntem çok türlü biyofilmlerde topluluk analizine izin verir. Örneğin, spesifik bakteri gruplarını hedefleyen floresan in situ hibridizasyon, çok türlü biyofilmlerde 38,39 spesifik bakteriyel yeniden bölünmeyi incelemek için özellikle yararlıdır. Son olarak, biyofilmlerin21 matris bileşimini karakterize etmek için çok sayıda floresan boya kullanılabilir. Burada proteinler, aralarında matris proteinleri de dahil olmak üzere çok çeşitli proteinleri boyayan Sypro kullanılarak hedeflendi (Şekil 4), ancak diğer boyalar, ekzopolisakkaritler veya hücre dışı DNA gibi diğer önemli matris bileşenlerinin görselleştirilmesine izin verir. İlginç bir şekilde, tüm bu analizler açıklanan yöntem kullanılarak mezo ölçekte gerçekleştirilebilir. LSCM canlı numuneler üzerinde gerçekleştirilebildiğinden, özellikle ince mantar kolonileri için uygun olan örneğin kapak boşluğu odaları kullanılarak hızlandırılmış görüntüleme elde etmek de mümkündür. Biyofilm oluşumu karmaşık, dinamik bir süreç olduğu için bu seçenek özellikle ilginçtir. Son olarak, nicel bir amaç için, rapor edilen yöntem, bu nicelemeyi mezo ölçekli görüntülerde mümkün kılarak otomatik nicel analizin doğruluğunu artırabilir. Bu, biyofilm heterojenliğinin ve istatistiksel sorunların üstesinden gelebilir29.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı tarafından Mükemmeliyet Laboratuvarı ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), Genomik Bilim Programında Bitki-Mikrop Arayüzleri Bilimsel Odak Alanı ve DOE Bilim Ofisi'ndeki Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi aracılığıyla desteklenmiştir. Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı, DE-AC05-00OR22725 sözleşmesi kapsamında Amerika Birleşik Devletleri Enerji Bakanlığı için UT-Battelle, LLC tarafından yönetilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6 kuyulu Falcon Doku Kültürü Plakaları FisherScientific08-772-332.2 ve 3.1 Kongo'da
RedFisher ScientificC580-253.1.4.1 EĞLENCE'de Kullanılan
1 Hücreli LekeThermo Fisher ScientificF70303.1.4.1
Buğday Tohumu Aglütininin, Alexa Fluor 633 EşlenikThermo Fisher ScientificW214043.1.4.1'de Kullanılır
DAPI çözümüThermo Fisher Scientific622483.1.4.2'de Kullanılan
Propidium iyodürThermo Fisher ScientificP35663.1.4.3 FilmTracer'da Kullanılan
SYPRO Yakut Biyofilm Matris proteini LekeThermo Fisher ScientificF103183.1.4.4'te
Fluoromount-G Slayt Montaj Ortamı FisherScientificOB100-013.1.7'de Kullanılır
LSM780 Axio Observer Z1Zeiss3.2.1
ZEN 2.1 lite siyah yazılımında kullanılır 3.2.1
Yüksek Vakumlu Kaplayıcıda Kullanılan Zeiss Leica EM ACE600Leica
GeminiSEM-FEG'deZeiss4'te Kullanılan
Kullanılan Kullanılan 4 Kullanılan

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75 (4), 583-609 (2011).
  2. Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine. Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).
  3. Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14558-14563 (2009).
  4. Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations. 13, 235-245 (2007).
  5. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
  6. Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. Can mushrooms fix atmospheric nitrogen? J. Biosci. 29 (3), 293-296 (2004).
  7. Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications. World J Microbiol Biotechnol. , 739-743 (2008).
  8. Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater. Chem. Ecol. 00 (0), 1-10 (2014).
  9. Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water. Appl. Environ. Microbiol. 71 (11), 7301-7309 (2005).
  10. Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface. J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94 (1), 149-156 (2010).
  11. Flemming, H., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Publ. Gr. 8 (9), 623-633 (2010).
  12. Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin. BMC Res. Notes. 5, 244(2012).
  13. Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells. Mol. Cell. Probes. 28 (1), 1-5 (2014).
  14. Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP. BMC Ecol. 6, (2006).
  15. Murray, J. M. Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination. Cold Spring Harb. Protoc. 6 (12), 1399-1437 (2011).
  16. Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species. FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).
  17. Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions. PLoS One. 6 (10), (2011).
  18. Balbontín, R., Vlamakis, H. Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization. Microb. Biotechnol. Publ. , (2014).
  19. Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176 (1), 22-36 (2007).
  20. Deveau, A., Brulé, C., et al. Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Environ. Microbiol. Rep. 2 (4), 560-568 (2010).
  21. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy. Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).
  22. Rasband, W. S. imagej. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
  23. Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics. 2 (5), 486-498 (2002).
  24. Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann. di Ig. 25 (1), 31-42 (2013).
  25. Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  26. Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. Time to "go large" on biofilm research: Advantages of an omics approach. Biotechnol. Lett. 31 (4), 477-485 (2009).
  27. Koerdt, A., Orell, A., et al. Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis. J. Proteome Res. 10 (9), 4105-4119 (2011).
  28. Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8 (3), 203-208 (2009).
  29. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
  30. Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 11 (3), 34001(2006).
  31. Janjaroen, D., Ling, F., et al. Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces. Water Res. 47 (7), 2531-2542 (2013).
  32. Derlon, N., Koch, N., et al. Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration. Water Res. 47 (6), 2085-2095 (2013).
  33. Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy. Scanning. 34 (1), 26-36 (2012).
  34. Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34 (1), 1-4 (2007).
  35. Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (4), 1-45 (2015).
  36. Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  37. Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 56 (6), 3349-3358 (2012).
  38. Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH). PLoS One. 6 (3), (2011).
  39. Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155 (8), 2603-2611 (2009).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fungal HiflerKonfokal MikroskopiTaramal Elektron MikroskopiBiyofilm Olu umuBiyofilm BoyamaMikroskopi ProtokolBiyofilm G rselle tirme

İlgili makaleler