Subretinal Space erişim için bir alternatif ve Onaylı Enjeksiyon Yöntemi yoluyla Bir transkleral Posterior Yaklaşım

Summary

Subretinal enjeksiyonlar, proteinler ve viral vektörler gibi büyük terapötik ajanları fotoreseptörlere ve retina pigment epiteline iletmek için en yaygın tekniktir. Farelerde, minimum ikincil hasar ve hızlı iyileşme süreleri ile subretinal boşluğu başarılı bir şekilde hedefleyen alternatif bir yöntem burada açıklanmaktadır.

Abstract

Subretinal enjeksiyonları başarıyla doğrudan fotoreseptör maruz kalma ve retina pigment epitel (RPE) sahiptir interfotoreseptör / subretinal bölmeye proteinlerin terapötik girişimlerin viral ajanlar, ve hücreleri sunmak için insanlar ve kemirgenler hem de kullanılmıştır. plazminojen subretinal enjeksiyonları yanı sıra son klinik öncesi ve klinik çalışmalarda ileri retina hastalığı olan bireylerin viral vektörlerin ve kök hücreleri sunma güvenliğini ve / veya etkinliğini göstermiştir. retina hastalıkları, özellikle de kalıtsal retinal distrofilerin fare modelleri, bu tedavilerin test etmek için gereklidir. Kemirgenlerde en yaygın enjeksiyonundan retinaya bir anterior küçük transkorneal ya transkleral kesiler kullanmaktır. Bu yaklaşımla, enjeksiyon iğnesi altında yatan RPE ve yerleştirilmesine bozarak nörosensöriyel retina nüfuz kolayca nick lens, lens kesafeti ve non-invaziv IMAGI bozulmasını nedenng. Bir transkleral yoluyla subretinal alan erişme, posterior yaklaşım bu sorunları önler: iğne retina penetrasyon olmadan, optik sinir yaklaşık 0.5 mm sklerasına geçer ve vitrözü kesintiye önler. Tali hasar odak sklerotomili ve geçici, seröz retina dekolmanı etkileri ile bağlantılı olduğu sınırlıdır. yöntemin basitliği, göz yaralanması en aza indirir hızlı retina yatıştırıldı ve iyileşme sağlar ve düşük başarısızlık oranı vardır. retina ve RPE minimal hasar etkinliğinin net değerlendirme ve terapötik ajanların kendilerini doğrudan etkileri için izin verir. Bu yazıda, viral vektörler, farmakolojik ajanlar hedef yüksek etkinlik, en az hasar ve hızlı bir iyileşme ile farelerde retina altı alana hücreleri ya da uyarılmış pluripotent kök (IPS) kök hücreler için kullanılabilecek yeni bir retina altı enjeksiyon tekniği tarif etmektedir.

Introduction

Subretinal enjeksiyonları fotoreseptör ve altta yatan RPE ^1,2 üzerindeki etkilerini incelemek için farelerin retina hücresel ve viral ajanlar sunan birincil yolu vardır. Farelerde en subretinal enjeksiyon protokolleri transkorneal veya ekvatora bir transkleral enjeksiyon sitesi anterior (Şekil 1) kullanın. Bu yaklaşım nicklemek ve lens bileşke bulanıklığı, retinada ve iris, retina kanaması, önemli retina dekolmanı ve kalıcı subretinal ödem ^3-9 camsı, penetrasyon bütünlüğünün bozulması içeren doğal kollateral hasara neden olabilir. Deneysel manipülasyonlar terapötik girişimlerin ^3,7,10,11 etkilerini değerlendirmek amacıyla bu etkileri aşmak gerekir. Bu çalışma, bu komplikasyonları önler posterior transkleral enjeksiyon yöntemi ayrıntılı bir açıklamasını ve doğrulama sağlayan travmayı en aza indirir ve alt hedefleme yüksek bir başarı oranına sahiptirretina alanı.

Farelerde subretinal alan hedefleme Enjeksiyonlar genellikle gerçekleştirmek çok zordur ve çoğu araştırmacı vektör yanlış bir konuma teslim edilir veya önemli retina hasarı tam retina dekolmanı ⁶ örneğin, var olduğu başarısız girişimleri yüksek frekanslı karşılaşıyoruz. Çünkü enjeksiyon komplikasyonlar analize dahil gözlerin sayısı genellikle fare çalışmalarında rapor değil, ama bizim kendi deneyim ve diğer araştırmacılar ile tartışmaya başarısız enjeksiyon sayısı% 50 kadar yüksek olabilir ve deneyime bağlı olarak değişebilir ve enjeksiyonları gerçekleştiren araştırmacının yetenekleri. Enjeksiyon başarısı genellikle direkt fundus görüntüleme ve / veya optik koherens tomografi (OKT) ^7,9 değerlendirilir. Farelerde subretinal enjeksiyon için yüksek başarı oranları ile kolayca hakim yöntem deneme hızlandırmak ve tre klinik öncesi çalışmalarda maliyetini düşürebilirABD'de körlüğün başlıca nedenleridir retina hastalıkları için atments.

Arka, burada açıklanan transkleral subretinal enjeksiyon tekniği klinik ve klinik öncesi protokoller ^9,12 bir uyarlamasıdır. enjekte edilen farelerde yapılan girişimsel olmayan tanı değerlendirmeler hafif ve son derece lokalize hasara göstermek ve ek teminat objektif, retina ve RPE hasarı yoksundur. böylece bu çalışmalarla ilgili maliyetlerin azaltılması, - (% 90 ya da daha iyi 80) Ayrıca, nispeten daha az uygulama ile, bir deneyci yüksek başarı oranı ile bu sonuçlar elde edebilirsiniz. Bu prosedür klinik öncesi çalışmalarda fotoreseptör ve / veya RPE, hücresel viral veya farmakolojik tedavi edici girişimler sunmak için ve kolayca deneysel müdahaleleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Protocol

Hayvanlar: Los Angeles, California Üniversitesi (UCLA) yetiştirilen Yabani tip C57Bl / 6J fareler. 17 haftalık ve erkek ve dişi fareler dahil - Bütün hayvanlar 11 arasında idi. Tüm fareler grubu yerleştirilmiştir, yiyecek ve su ad libitum 12:12 aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu. Bütün deneyler Oftalmik ve Vision Research Hayvanların Kullanım UCLA ve Vizyon Araştırma Derneği ve Oftalmoloji Tablosu kurumsal kurallarına uygun olarak yapıldı.

NOT: Tüm ilaçlar ve enjekte ajanlar Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) notu bulunmaktadır.

1. Cerrahi Hazırlık

1. tuzlu karışımı 100 mg / kg ketamin ve 8 mg / kg ksilazin ve intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi. Fare hiçbir ayak tutam veya kornea dokunmatik refleksleri böyle bir derinliğe anestezi uygulayınız.
2. Bir dolaşan su pedi ile 37.0 ° C vücut ısısını korumak.
3. % 2.5 fenilefrin göz d öğrencileri dilateROPS ve trim bıyık görselleştirme kolaylaştırmak için. Bıyık nedenle, bıyık o gözle bloklar açık erişim, değil bıyık tabanına sadece bir bölümünü kaldırmak gerekir kırparak, fare önemli duyusal girdi sağlamaktadır. Bizim tecrübelerimize göre, fareler bu işlemden sonra normale iyileşme göstermektedir. Metilselüloz göz uygulayın kuruluğunu önlemek ve anestezi kaynaklı geçici katarakt ¹³ en aza indirmek için düşer.
4. Cerrahi (yani, betadin ve etanol veya sıcak boncuk) öncesinde aletleri sterilize.
5. Görselleştirme yapılacaksa, steril bir ortamda seyreltilmiş fluoresein (% 0.01,% 0.9 tuz kullanılarak) hazırlayın (örneğin, biyo-güvenlik kabini) (aşağıdaki bölüm 3).

2. Enjeksiyon Sitesi Hazırlama

1. Uygun enjeksiyon hacmi (örneğin, 0,3-1,0 ul) ile bir şırınga (örneğin, 5 ul şırınga) hazırlayın.
2. Göz di açıkça görülebilir yukarı bakacak ve böylece fare yerleştirinmikroskop ssecting.
3. Yavaşça ince uçlu forseps ile zamansal konjonktivayı tutam. kavisli Vannas makas kullanılarak yaklaşık 90 derecelik bir çember boyunca bir kesi olun.
4. altta yatan Tenon kapsülü ile adımı yineleyin 2.3.
5. burundan dünya dönerken ince uçlu forseps ile çevreleyen bağ dokusu rezeke. optik sinir yaklaşık 0,5 mm zamansal enjeksiyon yerinde doğru çalışın. retro-orbital sinüs bozmamak için büyük özen kullanın.

3. Sklerotomi ve Subretinal Enjeksiyon

NOT: Bu prosedür öğrenme sırasında% 0.9 Saline% 0.01 floresein enjeksiyon görselleştirme yardımcı olmak için kullanılması tavsiye edilir. floresein topografik dağılımı etkili bir fundus görüntüleme (aşağıda bölüm 4'e bakınız) ile belgelenebilir.

1. yavaşça 22.5 derecelik oftalmik bıçak ile Göz yuvası çizilerek enjeksiyon yerinde küçük bir skleral kesi yapmak. Bu kesi shouSadece iğne ucu sklera geçmesine izin verecek kadar büyük olması ld.
2. 5 açılı eğimli 33 G iğne (takın -. Konik bakan ve retinaya açılı paralel olan sklerotomili içine 10 ° (istenilen hacim enjekte örneğin, öğrenme amaçlı% 0.01 Floresein 0.3 1.0 ul).
   Not: iyice her enjeksiyondan önce müsait bir çözücü ve DI suyla art arda yıkama ile temizlenerek şırınga sterilliğini korumak.
3. İğneyi hareket ettirmeden ve hatta basınçla pistonu yavaşça (over ~ 3 saniye) basın.
   NOT: İğne subretinal alan olduğunda Medyumu ederken, hafif bir direnç hissedilecektir. İğne sklera veya RPE nüfuz etmediği takdirde iğne retina ve yüksek direnç deler eğer minimum dirençle hiçbir olacaktır.
4. geri akışı en aza indirmek için iğne çekilerek önce birkaç saniye bekleyin.
5. Steril tamponlu tuzlu su ile göz durulayın ve göz h sağlamakgeri normal pozisyonuna döndürülmüş olarak.

OCT ve Fundus Görüntüleme tarafından Retina Dekolmanı 4. Değerlendirme

1. enjeksiyondan hemen kalitesini değerlendirmek için enjeksiyondan sonra ve uygun zamanda Ekim görüntüleme gerçekleştirmek retinal yapıyı değerlendirmek için gerekli post-enjeksiyon işaret ediyor.
   Not: Benzer çalışmalarda OKT kullanımına örnekler, daha önce ^7,14 tarif edilmiştir.
   1. Ayarlayın ve enjeksiyon siteyi hedef Ekim görüntüyü aynı hizaya getirin. enjeksiyon yeri orta hat ve optik sinir başı temporal 0,5 mm olmalıdır. optimal merkezli dekolmanı çerçevesinin dışında ise gerekli ya da değil tekrarlayın.
2. Retina dekolmanı görselleştirmek ve en-yüz fundus görüntüleme ^7,14 ile enjeksiyon alanını boya.
   Not:, OCT görüntüleme sistemi mevcut değilse, uygulama için bir vektör ile floresan bir miktar enjeksiyon floresein anjiyo gerçekleştiren bir fundus kamera ile görselleştirme sağlayacakAynı uyarma dalga boyları kullanarak ve filtreler engelleme grafisi. hiper-floresan lokalize alanlar damarsal altında görünecek ve subretinal alan doğru hedeflenmiş ise damarsal keskin ve belirgin sınırları olacaktır. enjeksiyondan bleb kenarı hipo floresan hiper geçiş ile sınırları çizilmiş olacaktır. Çeşitli enstrümanlar fare için bu yeteneği sağlar; Burada kullanılan enstrümantasyon başka yerde ¹⁴ tarif edilmiştir.

5. Post-operatif Bakım

1. Enjekte gözün kornea yüzeyine üçlü antibiyotik göz krem ​​kalın bir kat uygulayın.
2. kurtarma için temiz yalnız kafeslerde fareler yerleştirin. Onlar tamamen iyileşti kadar ameliyat geçiren fareler bir araya etmeyin.
3. Anestezi kurtarma sırasında solunum ve sıcaklığını izlemek. Onlar sternum yatma koruyabilirsiniz kadar hayvan izleyin.
4. Ek uygun post-operatif izleme gerçekleştirmekve ameliyat sonrası ağrı tedavisi için karprofen bir deri altı enjeksiyon (5 mg / kg) de dahil olmak üzere tedavi.

Elektroretinografi tarafından Retina Fonksiyonun 6. Değerlendirmesi (ERG)

1. ERG analiz ön enjeksiyon gerçekleştirmek ve uygun zamanlarda retina fonksiyonlarını değerlendirmek için gerektiği gibi enjeksiyon sonrası. Enjeksiyon subretinal boşluğa yapılmış ise, retina dekolmanı 72 saat içinde çözmelidir.
   1. Daha önce ^14,15 açıklandığı gibi önce ve enjeksiyondan sonra retina fonksiyonlarını değerlendirmek için standart ERG tekniklerini kullanın.

7. 3D İmar ve Bleb Hacim Ölçümü

NOT: yüksek kontrast görüş çerçevesinde tüm dekolmanı kapsayan birlikte Ekim taramaları kullanım için optimum olan. ImageJ / Fiji ^17,18 ve Imaris kullanıldı, ancak diğer yazılım kullanılabilir.

1. ilgi b-tarama İhracat, ImageJ / Fiji ve kırpma (Görüntü> Kırpma) Ekim sc bölümü ithalatBir dikdörtgen seçim aracı kullanılarak modellenmiştir edilecek.
   1. Kontrast ayarlayın (Görüntü>> Parlaklık / Kontrast ayarlama) ve bir çizgi ile iki bölüm bağlayarak herhangi bir eksik sınırları betimlemek.
   2. fotoreseptör tabakası RPE yayılan çizgi aracı (tutma vardiya) ile düz bir çizgi çizin. Tedbir (Ölçü> Analiz) çizgisinin uzunluğu adımı 7.8 için maksimum dekolmanı boyutu elde etmek için.
2. İthalat "Gray RGB" eklentisi ve MATLAB Compiler Runtime kullanılarak (Malzeme Tablo bakınız) 3D-rekonstrüksiyon yazılımı çerçeveleri kırpılmış.
3. Ekim tarama (x, y, z) kalibrasyon parametrelerini kullanarak (Görüntü Özellikleri altında) voksel boyutunu ayarlayın.
4. dördüncü kanal oluşturmak için, her kanala eşit ağırlık ile (Görüntü Özellikleri altında) "RGB Gray" eklentisi, yürütün. Orijinal Kırmızı-Yeşil-Mavi kanalları silin.
5. kontrast değişikliği kullanarak gri kanal ters çevirin. Mağaza Görüntü.
6. "Bir Ekle'yi tıklayınew yüzeyi "3D-Görünüm sekmesinde düğme ve yüzey yaratma güdümlü 4 adım süreci başlar.
   1. Yüzey seviye detay (adım 4 1) ayarlayın.
      NOT: Bizim tecrübelerimize göre 12,0 8.0 en etkili menzili oldu.
   2. (Arka plan seçimi altında) maksimum küre boyutunu 7.1.2 ölçülen maksimum dekolmanı boyutu biraz daha az olarak ayarlayın. gri kanal inversiyon (adım 4 2) yüzey oluşturmak ve geri.
   3. retinanın dış olumsuz alanlarda ve dekolmanı yüzey teması (4 adım 3) gelmiyor bu yüzden maksimum değere eşik ayarlayın.
   4. Voksellerden sayısına filtre tipini ayarlayın ve büyüklüğüne göre dekolmanı sitede negatif boşluk izole. yüzeyi (adım 4 4) bitirin.
      NOT: sıyrılma yüzeyinin hacmi istatistikleri sekmesinde hacim altında bulunur.

Results

yaklaşım transkleral subretinal enjeksiyonları 0.3 ul (n = 18), 0.5 ul (n = 8) ve% 0.01 fluoresein 1.0 ul (n = 5) enjekte 16 vahşi tip farelerden 31 sağlıklı gözler üzerinde gerçekleştirilmiştir posterior. Bir göz nedeniyle yapısal ve fonksiyonel analiz engelleyen önceden varolan korneal opasite enjeksiyon çıkarılmıştır. Her enjekte göz bu raporda yer almaktadır. Hiçbir istenmeyen retina dekolmanı, vitreus içine retinada veya sızıntı delikler tespit edildi ne de gözlenen herhangi gözlerd...

Discussion

Subretinal enjeksiyonları viral vektörlerin teslimat için tercih edilen yöntem ve fotoreseptör ve temel araştırma ve klinik tedavisinde hem de RPE işlemek için hücre kökenli tedavisi kaynaklanıyor. hastalarda, subretinal enjeksiyonları genellikle doğrudan görselleştirme ile iğne ile, pars plana bir ön sklerotomili retinanın bir arka çekirdek vitrektomi ve penetrasyon yapılır. Göz Psödofakik zaten olmadıkça katarakt oluşumu erken gerçekleşmesi için en vitrektomi prosedürleri gibi, yaygındır. Farelerde, retina altı enjeks...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Şırınga x 1
Hamilton İğne 33 G, 1.0", 20 DERECE, nokta 3 (304 paslanmaz çelik)	Hamilton	7803-05	İğneler x 6
Vannas Kavisli Makas	Ted Pella, INC.	1347	5 mm Bıçak
22.5 Derece Mikrocerrahi Bıçağı	Wilson Oftalmik A.Ş.	91204
Ketaj	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamin
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Ksilazin
Floresein %10 AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg / ml
%0.9 Tuzlu USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	%0.9 NaCl
Antibiyotik Merhem	Akorn	NDC 17478-235-35	Oftalmik
Su Sirkülasyon Pompası	Gaymar	TP-500 T/Pompa	P / N 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Serisi	Ticari
Fundus Kamera	Phoenix Araştırma Laboratuvarları	MICRON III
Cımbız Tip 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
% 2.5 Fenilefrin	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Oftalmik
IMARIS8	Bit Düzlemi		Sürüm 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  %2.5	Goniovisc	AX0401	Metilselüloz
Göz Damlası (Durulama)	Bausch & Lomb		Tuzlu Su
Çözeltisi Mikroskobu	Zeiss	Stemi 2000	Mikroskop
Işık kaynağı	Fostec	P/N 20520	Işık kaynağı