Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

17.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54829

⸱

27 Aralık 2016

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

Bu makalede

Özet

Biyofilm enfeksiyonları kemoterapiye karşı yüksek tolerans gösterir. Tek bir tahlil biyofilmlerin karmaşıklığını yakalayamaz. Bunun yerine, tamamlayıcı tahlillere ihtiyaç vardır. Canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi tahlillerini birleştiren bir tarama platformu (S. aureus için geliştirilmiş) sunuyoruz. Uzun vadeli kemoterapötik etkilerin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere anti-biyofilm ilaç keşfine izin verir.

Özet

Biyofilmler, modern biyomedikal en zorlu konulardan biri olarak kabul edilir, ve potansiyel antibiyotik dayanıklı enfeksiyonların% 80'i sorumludur. Biyofilm multifaktöryeldir olduğu düşünülen kemoterapi için olağanüstü yüksek tolerans, göstermiştir. Örneğin, matris biyofilm içine antibiyotik penetrasyonu azaltan fiziksel bir engel oluşturur. Ayrıca, biyofilm içindeki hücrelerin fenotipik çeşitlidir. Büyük olasılıkla, biyofilm esnekliği bu ve diğer, henüz bilinmeyen mekanizmalarla bir kombinasyonundan kaynaklanır. Şu anda mevcut antibiyotiklerin tüm tek hücreleri (plankton) bakterilere karşı geliştirilmiştir. Bu nedenle, şimdiye kadar, bir molekül çok sınırlı repertuarı selektif olgun biyofilm üzerinde hareket edebilir bulunmaktadır. Bu durum, anti-biyofilm için arama yaparak daha belirgin bir yer işgal çağrısı edildiği ilaç keşfi bir ilerici paradigma kayması, tahrik vardır. Ek bir zorluk olmasıdırÇok biyofilm araştırma için standart yöntemler, kimyasal kütüphaneler büyük hacimli tarama için kullanılabileceğini özellikle sınırlı sayıda. Burada, kimyasal tarama için deneysel bir anti-biyofilm platformu sunulmuştur. Poli N-asetil-glukozamin, PNAG ait bir buğday tohumu agglutinin kullanarak biyofilm (resazurin boyama ile) canlılığı, (kristal viyole boyama ile) toplam biyokütle ve biyofilm matrisi (ölçmek için üç deneyleri kullanır, WGA-floresan tabanlı boyama , fraksiyon). Tüm deneyler modeli bakteriler gibi Staphylococcus aureus kullanılarak geliştirilmiştir. Platform primer tarama için de tanımlanan anti-biyofilm hit fonksiyonel karakterizasyonu için nasıl kullanılabileceğini örnekleri sunulmaktadır. Bu deneysel sekansı ölçülen son noktaları dayalı isabet sınıflandırılmasını sağlar. Ayrıca, özellikle kısa süreli kemoterapötik etkilerinin karşılaştırılması, uzun vadede, etki biçimleri hakkında bilgi sağlar. Bu nedenle, çok Adva olançeşitli biyomedikal uygulamalar için başlangıç ​​noktası hizmet verebilir yüksek kaliteli isabet bileşiklerinin hızlı belirlenmesi için ntageous.

Giriş

Bakteriler biyofilm en yaygın örneği olan iki çok farklı yaşam tarzları, planktonik ve sapsız, arasında geçiş yapabilirsiniz. Biyofilmlererde, bakteriler kendi ürettiği matrise 1 gömülü yapısal toplulukları oluştururlar. Bu kendi ürettiği matris bakteri ve dış çevre arasında bir bariyer olduğunu ve yakın tutarak, mikrobiyal hücreleri korur. biyofilm matrisin bileşimi ile ve hatta türler içinde değişir, ama daha çok lipopolisakaritler, hücre dışı DNA ve protein sıkı ağından oluşur. Matris zararlı maddelerin girişini engelleyerek fiziksel bir bariyer görevi görür, ama aynı zamanda dehidrasyon biyofilm korur ve hücre 2 kaçan besin önler.

Biyofilmler, modern biyomedikal en zorlu konulardan biri olarak kabul edilir ve bunlar antibiyotik dayanıklı enfeksiyonlarda 3% 80'i için ileri sürülen sorumludur. onlar dispnem, osmotik basınç, mekanik stres 4, ısı, UV radyasyonu 5, dezenfektanlar, antimikrobiyal ajanlar, ve ev sahibi bağışıklık sistemi 1: dış tehditlere karşı doğal olarak yüksek tolerans yatıyordu. Örneğin, bir biyofilm öldürmek için gerekli gerekli antimikrobiyel madde konsantrasyonu, planktonik bakterileri öldürmek için gerekene göre en fazla 1000 kat daha yüksek olduğu gösterilmiştir. bu daha yüksek tolerans açıklaması çok faktörlü olduğu görülmektedir. matris biyofilm içine antibiyotik penetrasyonu azaltan fiziksel bir engel oluşturur. Ayrıca, biyofilm içindeki hücrelerin fenotipik çeşitlidir; onlar yüzünden biyofilm 6 iç ve dış kısımları arasındaki oksijen, besin ve metabolitleri varolan degrade farklı metabolik durumları arasında geçiş. Dolayısıyla, bu tür çekirdek gibi bazı biyofilm bölgelerde, bakteri oksijen ve besin yoksun ve bir metabolik az aktif ya da tamamen atıl devlet içinde yaşamak 7. Tamamen atıl hücreleri gibi persister hücreleri de ifade edilir ve geleneksel antimikrobiyal tedavi 8 duyarlı değildir. Nedenle, biyofilm esnekliği halihazırda, önerilen ve diğer henüz bilinmeyen mekanizmalarla bir kombinasyonundan ortaya olasıdır. Staphylococcus spp. Şiddetli, sık sık biyofilm ilgili, enfeksiyonlara 4 neden en sorunlu gram pozitif bakteriler arasında devam etmektedir. Tüm bakterilerin% 99'a kadar daha baskın bakteri yaşam tarzı 3 yaparak, biyofilm içinde ilişkili olduğu ileri sürülmektedir. Ancak, şu anda mevcut antibiyotiklerin tüm tek hücreli (plankton) bakterilere karşı geliştirilmiştir. Şu ana kadar, bir molekül çok sınırlı repertuarı selektif olgun biyofilm üzerinde hareket edebilir bulunmaktadır. Bu durum, anti-biyofilm için arama yaparak daha belirgin bir yer işgal çağrısı edildiği ilaç keşfi bir ilerici paradigma kayması, tahrik vardır.

Bir methodolog itibarenbiyofilm yöntemler sadece sınırlı sayıda standart koyucu kuruluşlar, kimyasal kütüphanelerin yüksek verimli tarama için geçerli özellikle geliştirilmiştir gibi nik perspektif bir ek zorluklar mevcuttur. (Sadece bir istisna dışında) Bütün standart deneyler biyofilm reaktörleri dayalı ve bu yöntemler genellikle erken evrede araştırma 9-12 sırasında kullanılamaz geniş çalışma hacimleri ve test edilecek bileşiklerin büyük miktarda gerektirir. Yalnızca mevcut standart bir tarama uygulanamaz deney ticari olarak temin edilebilen en az biyofilm ortadan konsantrasyonu (MBEC) Sistem 13-15 geliştirilmiş olan sözde Calgary Biyofilm cihazdır. Ancak, bu testin sınırlama biyofilm mandal yetiştirilen ve tüm bakteri türleri ya da aynı türün içindeki bile suşları değil bu cihazda biyofilm oluşturmak mümkün olmasıdır. Ayrıca, özellikle de doğal bileşiklerin keşfi uygulanabilir yöntemlerdirgerekli. Doğal ürünler Geçen yüzyılda üzerinde 16 antimikrobiyal ilaç keşfi yenilik için önemli bir kaynak olmuştur. Ayrıca persister hücrelere karşı etkili olabilir etki benzersiz mekanizmaları, yeni anti-biyofilm bileşikler sağlayabilir. Böylece, doğal ve doğadan ilham kütüphanelerin keşif umut verici ve benzersiz anti-biyofilm potansiyel üreten yüksek şansı var.

Burada, Staphylococcus aureus biyofilm canlılığı, toplam biyokütle ve matris üzerinde etkilerini ölçmek için üç deneyleri kullanılarak anti-biyofilm bileşiklerin kimyasal taranması için geliştirilen testlerin bir platform deneysel ayrıntıları sunuyoruz. İlk deney biyofilm canlılığını ölçen ve resazurin boyama dayanır. Resazurin onun oksitlenmiş halde mavi ve floresan olmayan ve bakteri metabolik aktivitesi azalır zaman pembe, yüksek floresan resorufine dönüşen bir redoks leke olduğunu. Bu çok basit ve hızlı mBirincil gösterimleri 17-20 için müsait bu yöntemde. İkinci deney, kristal mor boyama dayalı olarak, toplam biyofilm kütlesi ölçer. Kristal viyole biyofilm 19,21-23 bakteri ve bakteri çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir leke olduğunu. Tahlil ucuz reaktif dayalı ve basit bir emme uç okuma vardır. Son olarak, üçüncü deney stafilokok biyofilm 24 matrisi içinde mevcut N-asetil-glukozamin (PNAG) poli- spesifik olarak bağlanan buğday tohumu agglutinin ile biyofilm (WGA), hücre-dışı polimerik madde (EPS) -Matris hedeflemektedir. WGA floresan yoğunluğu okuyucu 25 ile tespit edilebilen bir florofor ile konjuge edilir. Biz burada mantığını ve uygulama örnekleri de dahil olmak üzere, geliştirilen platformun detaylarını sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Bakteriler Büyüyen

  1. Ön-kültür, 220 rpm'de (16-18 saat) çalkalanarak 37 ° C'de bir triptik soya suyu (TSB) içinde, bir gece boyunca bakteri.
  2. Taze TSB içinde (burada 1000 kat S. aureus için kullanılan bakteri büyüme oranına bağlı olarak) ve (o üstel büyüme ulaşmak için 37 ° C'de ve 200 rpm'de büyümesi optik izin ön kültür 100-1,000 kez seyreltilir 0.2 ve 0.6) arasında 595 nm (OD 595) yoğunluk.
    NOT: Bu adım suş spesifik optimizasyon gerektirir.

2. Biyofilm Oluşumu: Öncesi ve Sonrası pozlama

  1. (Bu mililitre başına yaklaşık 10 6 koloni oluşturan birim (CFU / ml) eşit) katlanarak büyüyen kültürün 100 kez seyreltilir.
  2. Ön poz protokolü
    1. muamele edilmemiş kontrol örnekleri için, steril bir 96 mikro tepsinin bölmesi başına seyreltilmiş bakteri kültürü 200 ul ekle.
    2. Bir test bileşiği veya bir kontrol 4 ul ekleAntibiyotik (50x stok çözelti) ve oyuk başına seyreltilmiş bakteri kültürü 196 ul.
    3. 18 saat 200 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 37 ° C 'de inkübe edin.
      Not: Burada 2 mm yörüngeye bir shaker kullanın.
  3. Maruziyet sonrası protokol
    1. Tüm örnekler için, steril bir 96 mikro tepsinin bölmesi başına seyreltilmiş bakteri kültürü 200 ul ekle.
    2. 18 saat 200 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 37 ° C 'de inkübe edin.
      Not: Burada 2 mm yörüngeye bir shaker kullanın.
    3. Bir çok kanallı pipet kullanarak, biyofilm dokunmadan, dikkatle tüm planktonik çözüm çıkarın.
    4. Bir test bileşiğinin ya da bir kontrol antibiyotik (50x stok çözelti) ve oyuk başına TSB 196 ul 4 ul ekle.
    5. Ek bir 24 saat boyunca 200 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 37 ° C 'de inkübe edin.
      Not: Burada 2 mm yörüngeye bir shaker kullanın.

3. Resazurin Boyama ProtocoBiyofilmler Canlılık Değerlendirmesi l

  1. steril PBS içinde 0.1 mg / ml resazurin (0.4 mM) bir stok çözeltisi hazırlanır. ışığa maruz kalmaktan korunmuş steril Bu stok tutun ve 4 ° C'de.
  2. 20 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) içinde resazurin stok 1:50 seyreltin.
  3. Bir çok kanallı pipet kullanarak ayrı, temiz 96-plaka için, hava kabarcıkları biyofilm dokunarak veya yaratmadan, dikkatlice (kuyularda biyofilm bırakarak) tüm planktonik çözüm aktarın.
  4. kuyu başına 200 ul ekleyerek steril PBS ile bir kez biyofilm yıkayın ve dikkatli bir şekilde çok kanallı pipet kullanarak kaldırın.
  5. Bir çok kanallı pipet kullanarak biyofilm plakası kaynağı başına seyreltilmiş resazurin 200 ul ekle.
  6. muamele edilmemiş biyofilm kontrol eşit pembe kadar yaklaşık 20 dakika çalkalanarak, oda sıcaklığında (RT) ve 200 rpm'de, Karanlıkta inkübe edin.
  7. at floresan ölçmekEXC = 560 nm ve λ em bir plaka okuyucu (üst okuma) ile 590 nm = λ.

4. Kristal Violet Boyama Protokolü Biyofilm Biyokütle Niceleme için Adım 3'te aynı plaka kullanma

  1. Bir çok kanallı pipet kullanarak kuyulardan dikkatlice resazurin leke çıkarın.
  2. 15 dakika boyunca metanol içinde 200 ul biyofilm düzeltildi.
  3. 10 dakika boyunca plaka hava kurumasını bekleyin.
  4. dikkatli bir şekilde çok kanallı pipet kullanarak, kristal viyole çözeltisi (deiyonize su içinde seyreltildi hacim / hacim),% 0.02 190 ul ekle. pipetle sırasında leke kuyuların yanlarını dokunmaktan kaçının ve darbe-out tamamlamak için pipet basarak değil hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek.
  5. Oda sıcaklığında 5 dakika için inkübe edilir.
  6. Bir çok kanallı pipet kullanarak, dikkatle leke çıkarın.
  7. iyonu giderilmiş su (her seferinde ul 200) ile iki kez yıkanır.
  8. Kuyular oda sıcaklığında 5 dakika kuruması ve geri kalan leke çözülür% 96 etanol ya da% 33 asetik asit içinde.
  9. Oda sıcaklığında 1 saat için inkübe ve 595 nm'de absorbans okundu.

5. Biyofilmler için aynı örnek Plate kullanılması Planktonik Bakteriler Üzerine Bakterisid Etkisinin Değerlendirilmesi

  1. 3.3 ile planktonik çözeltisi ile plakanın 595 nm'de bulanıklık ölçün.
  2. resazurin stokunun 10 ul ekleyerek başına kuyunun resazurin ile planktonik bakteri Leke. Pipetleme ile iyice karıştırın.
  3. muamele edilmemiş kontroller eşit pembe kadar yaklaşık 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe.
  4. Λ exc = 560 nm'de floresan ölçmek ve λ em 590 nm =.

Matris Kantifikasyon ve Biyofilmler Floresan Mikroskopi Görüntüleme 6. buğday tohumu Aglütinin Boyama

  1. matris ölçümü
    1. steril PBS WGA prob, 5 ug / ml solüsyonu hazırlayın.
    2. Paralel örnek pla kullanınBu boyama te. kuyulardan planktonik çözüm çıkarın ve dikkatli bir şekilde biyofilm dokunmadan çok kanallı pipet kullanılarak, steril PBS (oyuk başına 200 ul) ile bir kez yıkanır.
    3. iyi lekeli edilecek başına WGA solüsyonu 200 ul ekleyin.
    4. 2 saat süreyle 4 ° C de karanlıkta o inkübe edin.
    5. PBS, üç kez 200 ul ile kuyu yıkanarak bağlanmamış lekeyi.
    6. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca plaka kurumasını bekleyin.
    7. Yuva başına 200 ul kullanılarak,% 33 asetik asit içinde ilişkili leke çözülür.
    8. şerit kapakları ile kuyu Seal ve oda sıcaklığında 30 saniye ve 40 kHz için bir su banyosu sonikatör kullanarak ses dalgalarına maruz.
    9. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
    10. sonication adımı yineleyin. kuyular Sonication adımlar arasında kapalı kalabilir.
    11. Λ ex = 495 nm floresan ölçmek ve λ em bir plaka okuyucu (üst okuma) ile 520 nm =.
  2. Matrisi ile görselleştirmefloresan mikroskopi
    1. Adım 6.1.6 kadar yukarıdaki aynı protokolü kullanın.
    2. Kurutma adımından sonra, bir FITC filtresi (ya da bir başka uygun yeşil uyarım filtre) kullanılarak bir floresans mikroskobu ile örnekleri görselleştirmek.

Floresan Mikroskopi ve Yeşil-to-kırmızı-oranı için Sinyal Niceleme (G / R) ile Görüntüleme Biyofilmler içinde 7. Boyama Canlı ve Ölü Hücreler

  1. Floresan mikroskobu ile görüntüleme
    1. üreticinin talimatlarına uygun olarak, her bir prob (bir boyama canlı hücreler ve bir kullanıcı boyama ölü hücreleri) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
    2. kuyulardan planktonik çözüm kaldırmak ve çok kanallı pipet kullanarak (oyuk başına 200 ul) steril PBS ile bir kez yıkanır.
    3. Oyuk başına boyama solüsyonu 6 ul ekleyin.
    4. 15 dakika karanlıkta plaka inkübe edin.
    5. mikroskopi önce fazla sıvı m kaldırmakanually bir çok kanallı pipet kullanarak.
    6. Örneğin bir FITC filtresi (yeşil floresan için, canlı hücreler) ya da bir TRITC filtresi (kırmızı floresan, ölü hücreler) kullanarak, bir floresan mikroskop kullanılarak görüntüler çekin.
  2. Yeşil-to-kırmızı flüoresans oranı olarak sinyal miktarının (G / R)
    1. adımlar 7.1.1 ve 7.1.2 ile aynı protokolü uygulayın.
    2. Oyuk başına boyama çözeltisi 200 ul ilave edin ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe.
    3. uyarma / emisyon dalga boyları yeşil ve kırmızı floresan 485/535 nm ve 485/635 sırasıyla (üst okuma) bir plaka okuyucu ile floresan ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Önerilen platformda, canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi üzerinde etkileri ölçülür. Çalışma dizisi (Şekil 1), bir örnek plakası aynı anda bakteriyel biyofilm canlılığı ve toplam biyofilm biyokütle üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kristal viyole ile resazurin ile ve daha sonra lekeli. Bu resazurin bir birinci boyama kristal mor plakalar arasında maksimum sinyal emme birimleri karşılaştırmak için kristal viyolet sonucu (p = 0,4149 üzerinde istatistiks...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Aynı anda canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi üzerinde bir bileşiğin etkisini ölçmek tek yöntem yoktur. Bu nedenle, tercih edilen birincil tarama aşamasında, üç uç noktası üzerinde bir etki tespit etmek için deneyler ile birleştirmek için bir ihtiyaç vardır.

Resazurin, yalnızca redoks probun ilavesinden oluşan çok basit boyama protokolüdür. Ancak, resazurin ile biyofilm optimal inkübasyon süresi kuran bu testin başarısı için çok önemlidir. Bazılarında ise birkaç saat 19 sürebi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar kendi laboratuvarında filme sürecinde verdiği destekten ötürü profesörü Paul Kos ve LMPH, Antwerp Üniversitesi, Belçika teşekkür ederim. Bu çalışma Finlandiya projeleri Akademisi (272266 ve 282981 projeleri) ve Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandiya tarafından finanse edildi. Yüksek Lisans Janni Kujala teknik katkıları kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ResazurinSigma AldrichR7017
Kristal menekşeSigma AldrichHT90132 
Buğday Tohumu Aglütinini, Alexa Fluor 488 EşlenikTermo Fisher ScientificW11261
CANLI/ÖLÜ BacLight Moleküler ProblarL7012SYTO 9 yeşil ve ölü hücreleri boyamak için propidyum iyodür kırmızı
Fosfat Tamponlu Salin
Tripton soya agarLaboratuvarı M, NeogenLAB011
Triptin, soya suyuLaboratuvarı M, NeojenLAB004
F96, Kuyu Plakası, Polistiren, Steril, Şeffaf Düz TabanlıThermo Fisher Scientific161093
MARKA kapakları, 8Sigma Aldrichşeritleri BR781413-300EA
Branson CPX serisi ultrasonik banyoSigma AldrichZ769428-1EA
MultipipetteThermo Fisher Scientific
Multidrop dağıtıcıThermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Coulter
Varioskan Flash Multiplate okuyucuThermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC 25923
Canlı hücreleri boyamak için , , , , Haber Kaynağı

Kaynaklar

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
  3. Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
  4. Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
  5. Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
  6. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
  7. Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
  8. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
  9. Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
  10. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
  11. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
  12. Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
  13. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  14. Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
  15. Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663(2016).
  16. Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
  17. Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
  18. Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
  19. Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
  20. Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
  21. Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
  22. Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
  23. Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
  24. Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
  25. Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
  26. Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
  27. Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
  28. Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
  29. Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
  30. Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
  31. Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
  32. Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
  33. Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
  34. Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
  35. Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
  36. Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
  37. Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Biyofilm CanlılığıKristal Viyole BoyamaRezazurin BoyamaWGA FloresansıStaphylococcus aureusDoğal Bileşik TaramasıBiyofilm Matrisi AnaliziKimyasal Kütüphane TaramasıFloresan Mikroskopi
Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.