Yöntem makalesi

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

DOI:

10.3791/54841

⸱

16 Kasım 2016

 ,  , 
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi antimikrobiyal aktivite ve ökaryot hücre sitotoksisite geleneksel önlemler uç nokta deneyleri güveniyor. Böyle uç nokta tahlilleri gibi hücre erimesi, koloni oluşturan birim tespiti veya reaktif ilave olarak okunmasını önce birkaç ek deneysel adımlar gerektirir. Örneğin, yüksek verimli bir tarama sırasında deneyleri binlerce gerçekleştirirken, tahliller, bu tür için gerekli alt çaba dikkate değerdir. Bu nedenle, yüksek verimli bir antimikrobiyal keşif kolaylaştırmak için, eş zamanlı olarak hücre içi bakteri büyümesine nin inhibitörlerini teşhis etmek ve ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için gerçek zamanlı bir tahlil geliştirilmiştir. Spesifik olarak, gerçek zamanlı olarak, hücre içi bakteri büyümesi tespit bakteriyel lux operon'u (1. nesil tahlili) ya da floresan protein muhabir (2. nesil dik deney) ya da bakteriyel bir tarama suşları işaretleyerek sağlanmıştır. Toksik olmayan, hücre zan-geçirgen olmayan, nükleik asit bağlayıcı bir boyaAyrıca makrofaj ilk enfeksiyon sırasında ilave edildi. Bu boyalar, canlı hücreler dahil edilmemiştir. Ancak, cansız konakçı hücreler girişi ve nükleer DNA floresan etiketleme (deoksiribonükleik asit) izin membran bütünlüğünü kaybeder. Özellikle, DNA, konakçı hücre ölümünün bir çözelti bazlı okunmasını sağlar flüoresan kuantum verimi büyük bir artış ile ilişkili bağlama. Bu mikro-biçiminde bir yüksek girdi boyunca araştırma yapmak ve mikroskopla hücre büyüme ve sitotoksikliğinin değerlendirilmesi için bu kombine tahlili kullanılmıştır. Özellikle, antimikrobik birlikte uygulanır, iki ya da daha çok antimikrobik maddenin kombine etkisi ayrı uygulandığında daha büyük olan sinerji sergileyebilir. Farklı konsantrasyonlarda antibiyotik kombinasyon permütasyon değerlendirilmesi gerektiğini gibi hücre içi patojenlere karşı in vitro sinerji Test normalde olağanüstü bir iştir. Ancak, bizim gerçek zamanlı tahlil otomatik, dijital dağıtım teknolojisi p ile kombine bulunduuyduruk sinerji testi ermitted. Bu yaklaşımları kullanarak, sistematik hücre içi patojen Legionella pneumophila karşı karşıya antimikrobiyal çok sayıda eylem ve birlikte anket başardık.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi bölümlerinde geçici büyümek veya ikamet patojenler terapötik tedavisi zordur. Zorlayıcı yada nispeten gibi Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp gibi hücre içi patojenler zorunlu. Francisella tularensis ve Mycobacterium spp. genellikle aylar hatta yıllar arasında değişebilir tedavisi için antibiyotik tedavisi ders uzamış gerektirir. Ayrıca, hücre dışı patojenler geçici hücre içi nişler işgal ve bu şekilde antimikrobiyal tedavinin normal kurslar açıklığı kaçmak ve daha sonra öldürücü enfeksiyon yeni mermi başlatmak için ortaya çıkabilir. Staphylococcus aureus 1 ve üropatojenik Enterobacteriaceae 2,3 enfeksiyonları iki giderek tanınan örneklerdir. Bu nedenle, temel bir ilaç keşif hedefi hücre içi bölmelere nüfuz yeni antimikrobiyal tespit etmektir. Optimal tedavi hızla ortadan kaldırmak içinhücre içi organizmalar ve alt önleyici antimikrobiyal maruz kalma yoluyla direnç gelişmesini önlemek, özellikle tercih edilir.

Bu amaçla, biz modeli patojen Legionella pneumophila hücre içi büyüme hedefleyen hücre içi sızan antimikrobiyallerin tanımlamak için bir yüksek verimli bir tarama teknolojisini geliştirdi. 4 Önceki klinik gözlemler, standart antimikrobiyal duyarlılık testi doğru bu organizmaya karşı in vivo terapötik etkinlik tahmin etmediğini göstermektedir. Bu β-laktamlar ve aminoglikozid olarak antimikrobik temel sınıfları, aksenik biçimde yetiştirilen Legionella karşı son derece etkili olmasına rağmen, yeterli Legionella bulunan hücre içi nüfuz çünkü 5 Özellikle, bu oldu. 5,6 Daha sonra delil teknik olarak daha karmaşık hücre içi büyüme analizleri etkili bir klinik etkinliğini tahmin önerdi. 7 Ne yazık ki, bu deneyler koloni oluşturan birim sayımı için farklı zamanlarda noktalarında parçalanması gereken antimikrobik tedavi edilen enfekte makrofajlar, gerektiren son derece zahmetli uç noktaları deneyleri idi. Bu gibi deneyler, büyük ölçekte yapılacak pratik değildir ve yüksek verimli ilaç keşfi için uygun değildir.

Bu nedenle, hücre içi bakteri büyümesine, gerçek zamanlı saptanması için teknoloji geliştirilmiştir. 6 Bu bakteriyel kromozoma 4 ya da floresan proteini (daha önce tarif edilen, birinci kuşak deneyi) ya da bakteriyel lusiferaz operon 8 entegrasyonu ile modifiye edilmiş bir bakteri suşu kullanılarak 9 muhabir (burada tarif edilen ikinci kuşak, dik deney) gerçekleştirilmiştir. Bu şekilde, ışık veren veya flöresanlı bir sinyal bakteriyel sayısının bir taşıyıcı, gerçek zamanlı olarak okunmasını sağlar.

Ancak, bu nitelikler hücre içi infectio büyük bir karıştırıcı adresi yokn deneyleri, konakçı hücreler üzerinde hedef dışı etkiler. Özellikle, konakçı hücre ölümü doğal hücre büyümesini sınırlar ve antimikrobiyal etki yanlış pozitif bulmaktır. Tarama kütüphanelerinde olduğu gibi birçok bileşik ökaryotik hücre toksik, böyle yanlış pozitif takipte, çözüm için son nokta sitotoksisite deneyleri çok sayıda gerektiren, gerçek antimikrobiyal korkutur olacağını vardır.

Bu durumda, aynı anda ökaryotik hücre canlılığı ve hücre içi büyümeyi değerlendirmek mümkün büyük ilgi olmuştur. Özellikle, canlı olmayan ökaryotik hücrelerin karakteristik hücre zarı bütünlüğünün kaybıdır. hücre membranının geçirgenliği test probları, bu nedenle, hücre canlılığını değerlendirmek için de kullanılabilir. Daha önce ulaşmak ve ölü hücrelerin nükleer DNA leke putatif hücre zan-geçirgen olmayan, floresan, DNA bağlayıcı boyaların bir dizi becerisi ile karakterize edilir. 4 nükleer DNA bağlayıcı, bu boyalar, kuantum bir büyük artışı gösterecektirArka plan çözüm floresan üzerinde artan sinyal sonuçlanan m floresan verim. Bu nedenle, bu boyalar, ökaryotik hücre ölümünün kantitatif okuma sağladı. 4 Özellikle, biz birkaç J774 makrofajlar ile uzun süreli işbirliği inkübasyon sırasında kendileri toksik olmayan olduğu bulundu. ilk enfeksiyon sırasında ilave zaman, gerçek zamanlı, mikroskopik bir mikro florimetre ile ölçülür ve gözlemlenebilir ökaryotik hücre ölümünün flüoresan okuması sağlamaktadır.

Bu nedenle, bir bakteri muhabir ve toksik olmayan, zar geçirgenliği olmayan kullanımını birleştirerek, DNA bağlayıcı boyalar, biz bakteri yükü ve aynı zamanda ökaryotik hücre sitotoksisitesini hem ölçmek için basit, tahribatsız, gerçek zamanlı test geliştirmek başardık. Bu deney, US hücre içi büyümesini inhibe etme yeteneği için ~ de dahil olmak üzere fonksiyonel olarak karakterize edilmemiş aktivitesi 250 antimikrobiyal ve> 240,000 küçük molekülleri 384 oyuklu plaka biçiminde ekran ~ 10,000 bilinen biyoaktif maddelerin sağladıLegionella pneumophila, aynı zamanda her bir bileşik için ökaryotik hücre sitotoksisite verileri oluştururken. Legionella hücre içi büyümeye karşı bilinen antimikrobiyal 6 Yaptığımız analizler bugüne kadar bu tip en kapsamlı araştırma oldu. 6

bir arada kullanıldığında, bizim deney formatının verimliliği göre, aynı zamanda, daha sonra bilinen antimikrobiyal potansiyel sinerjistik etkiler araştırdı. En yaygın sinerji testlerinin bir sözde dama deneyi, standart olarak iki ya da daha çok antimikrobik maddenin iki kat seri dilüsyonları kombinasyon etkilerinin değerlendirilmesi ile gerçekleştirilir. İki ya da daha çok antimikrobik madde, ayrı olarak uygulanan her etkilerin toplamından daha birlikte uygulandığında, bu deneylerde 10, sinerji daha etkisinin gözlenmesi ile tanımlanır. Unutmayın ki, şimdiye kadar, sadece odaklanmış ve seçici sinerji testi, hücre içi Legionella pneumophila karşı yapıldı gerekli birleştirici permütasyon ile çarpılır geleneksel uç nokta deneylerinde yer alan büyük bir çaba çünkü.

Sinerji testi kolaylaştırmak için, otomatik dijital dağıtım teknolojisi 6 ile birlikte bizim gerçek zamanlı hücre içi büyüme / ökaryot sitotoksisite deneyi kullandı. Bu otomasyon DMSO veya sulu bir çözelti tek başına ya da 384-kuyucuklu bir biçimde kombine içinde çözülmüş bileşiklerinin seri seyreltmeleri dağıtmak için izin. 11 Ayrıca, bu tür sağlam sıvı taşıma teknolojisi kolayca daha yüksek çözünürlük gerçekleştirmek için bize izin, kare-kök-iki (yerine standart daha düşük çözünürlük, katlama), iki boyutlu olarak özgüllüğünün yüksek düzeylerine ulaşmak için seyreltme kombinasyonları, dama tahtası sinerji analiz. İki katlı bir seyreltme serisi 12 kullanırken bu çözünürlük tekrarlanabilirlik ilgili sinerji alanında endişeleri ele özellikle değerliydi. Son olarak, bizim tahlil nicel ve ayrıca therefore inhibisyon geçişleri ölçüldü. Bunun bir sonucu olarak, deney büyüme inhibisyonu benzer olan kombinasyon konsantrasyonları bağlantı isocontours olan isocontour isobolograms içinde eksprese önleyici tüm bilgileri, yakalanan. 6 Bu çizim stratejisi kombinatoryal doz-yanıt eğrilerinin görselleştirme sağladı. Bizim metodoloji göstermek için, bu analizleri gerçekleştirmek için bizim protokol tarif ve temsili sonuçlar göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gerçek Zamanlı Hücre içi Büyüme ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite Tahlili

  1. Hazırlama Konukçu Hücreler (J774A.1 Hücreleri)
    1. % 9 demir takviye buzağı serumu RPMI 1640 içinde süspansiyon kültür J774A.1 Mus musculus makrofaj benzeri hücre. doku kültürü şişelerinde İlk geçit. Hücreler ortam içinde 15 ml 75 cm 2 doku kültürü şişesi içinde Biraraya getirilen sonra 15 ml doku kültürü şişesi döndürülür ve 50 mi aktarıldığı ortamı aynı tip, 65 ml kazıma ve seyreltme ile bölünmüş 250 ml'lik bir bakteriyel çalkalayıcı şişeye.
    2. 250 ml ve / veya doku kültür ortamı ile beşte biri hacime kadar doldurulmuş 1.000 mi bakteriyel şişelerinde süspansiyon içinde ölçek büyütme, kültür için. Dakikada yaklaşık 120 devirde dönme hızı ayarlanarak havalandırınız. Istikrarlı büyüme için tam% 5 CO 2 ve 37 ° C'de inkübe edin.
    3. Bunlar aralığında yoğunluğa ulaşmak Hasat hücreleri 2.5 x 10 6 hücre/ 5 x 10 6 hücre / ml aralığındadır. ölü hücreler sitotoksisite deneylerinde arka plan gürültüsünü artacak olarak,% 25 geçmemesi (en kolay Tripan mavisi ile test) ölü hücre yüzdesini emin olun.
    4. Beyaz levha, doku 384 oyuklu mikro 30 ul doku kültürü ortamında 5 x 10 4 J774A.1 hücre göz başına, kültür-işlemden geçirildi. Deney gününde% 90 izdiham elde etmek için mikro gece boyunca inkübe edin.
  2. Hazırlama Işıklı veya Floresan Legionella pneumophila
    1. Passage L. pneumophila (Lp02 :: Flaa :: lüks 8) uygun ortamda bakteriler, yani tamponlu kömür maya özütü (BCYE) orta. Bir timidin okzotrofik suşu kullanılarak durumunda, 100 ug / ml timidin ile orta tamamlar. konfluent elde etmek için yeni bir BCYE plaka üzerinde kalın organizmaların yayılması ve (donmuş stoktan ise) (önceki plaka geçidinden ise) bir gün kuluçka ya da iki üç gün ile deneyler için bakteri yamaları hazırlayınbüyüme.
      1. 10 g maya ekstresi, 10 g N çözülmesiyle BCYE tabak hazırlayın - HPO 4- (2-asetamido) -2-aminoetansülfonik asit, 0.35 g K 2 ve deiyonize su 950 ml içinde 1 g monobazik potasyum α-ketoglutarat. Potasyum hidroksit (11.9 mol çözeltisi ≥2.5 mi) ile pH 6.9 olacak şekilde ayarlanır.
      2. 15 g agar ve 2 g aktif kömür ilave et; 1 L nihai hacme getirmek. Manyetik bir karıştırma çubuğu ve otoklav ekleyin. 55 ° C'ye soğutun, orta ve deiyonize su içinde çözülmüş 0,4 g L-sistein ve 0.42 g amonyum demir (III) sitrat ihtiva eden ilave filtre ile sterilize edilmiş çözeltiler. Petri plakaları dökme önce karıştırmak için mıknatıs karıştırma plakası kullanın.
      3. Aksenik büyüme ortamında L. pneumophila büyüme testi için, kömür dışında BCYE için kullanılan bütün kimyasal reaktifler birleştirerek ACES-maya özü suyu (AYE) hazırlamak ve ağar. Filtre sterilize ve hemen kullanmak, ya da daha sonra deneyler için dondurma.
    2. sa süspanse organizmalarUygun şekilde, 100 ug / ml timidin takviyesi ile J774A.1 hücreler için kullanılan me doku kültürü ortamı.
  3. makrofaj Enfeksiyon
    1. (Bakteri üremesi inhibisyonunun ve ökaryotik hücre erimesi açısından tarama bileşikleri ve pozitif ve negatif kontroller) çıkar test bileşiklerinin ekleyin. Tercihen, aracın yeterli seyreltme sağlamak için DMSO (dimetil sülfoksit) veya sulu bir çözelti içinde ≥500x de stok solüsyonları çözülür.
      1. stok çözeltileri donmuş olarak muhafaza edilmesi de, kararsız bileşikler ve antibiyotiklere donma-erime döngülerinden kaçınmak.
    2. Doku kültür ortamı içinde 2.5 x 10 6 CFU (koloni oluşturucu birim) / m ve flüoresan raportör etiketli bakteriler 1.0 x 10 7 cfu / ml hedef ve uygun, toksik olmayan, membran geçirgenliği olmayan nükleik asit- eklemek için ışık yayan bakterilerin seyreltin 2.5x nihai deney konsantrasyonu boya bağlama.
    3. her bir J774A.1 kültür karışımı 20 ul ekle, nihai deney hacmi50 ul nihai bakteri konsantrasyonu 1 x 10 6 CFU / ml (lux operon raportör) veya 4 x 10 10 6 CFU / ml (floresan protein raportör).
    4. % 100 CO 2 5% 1-3 gün boyunca 37 ° C'de buharlaşan kenar etkileri önlemek için bağıl nemi inkübe edin.
  4. Tahlil Okuma
    1. gazetecilere için uygun olarak bir mikroplaka luminometresiyle ve florimetrede bakteriyel büyüme ve ökaryotik hücre toksisitesini Oku kullanılır.
      1. termal (yaklaşık 10 dakika boyunca ya da kapaklı bir biyolojik güvenlik kabini kapalı olarak) yaklaşık 20 dakika boyunca aralık kapaklı bir laboratuar tezgah üzerinde tek kat olarak yerleştirme öncesinde lüminesans okuma mikropleytin denge, sıcaklık ilişkili kenar etkileri önlemek için.
    2. Daha sonra zaman noktalarında gerçek zamanlı okuma isteniyorsa inkübatör için mikropleytin dönün.

2. Veri Analizi

  1. Pozitif ve negatif con veri normalleştirmekTrols ökaryotik hücrelerin hücre içi bakteriyel büyüme ve yüzde sitotoksisite için yüzde veya kat-engellenmesini hesaplamak için.
  2. P + n u u | 3 (σ P + σ n) / - deney sağlamlığını değerlendirmek için, = 1 'Z analiz Z-faktörü (Z)' kullanılarak bakteri büyümesi inhibisyonu ve sitotoksisite hem de pozitif ve negatif kontroller arasındaki istatistiksel ayırma hesaplamak |. Bu denklem, σ p ve σ n, sırasıyla pozitif ve negatif kontrol kuyuları, standart sapmaları göstermektedir; μ p ve u n, sırasıyla, pozitif ve negatif kontrol kuyuları için ortalama değerlerdir.
    1. yüksek verimli tarama deneyleri için, ilgi konusu test bileşiklerinin etkilerini değerlendirmek için standart z değerleri (ya da diğer bir alternatif, kantitatif istatistiksel ölçümleri) hesaplar. Alternatif olarak, basit bir kat azalma hesaplamak veya daha alakalı potansiyel fizyolojik olarak azalma kat log geometrik kopyalayan bakteriler için etki büyüklüğü ölçüsü.

3. Tek ve Çok boyutlu (yani, Sinerji) Doz-yanıt Test ve Veri Yorumlama

  1. Protokol 1. bölümde tarif edildiği gibi makrofajların ve bakteri hazırlayın.
  2. Hemen önce enfeksiyon veya aksenik inkübasyon (yani minimal inhibitör konsantrasyon veya MIC) ve düşük yüksek ucunda yayılarak amacı ile, seyreltme serisi iki katına, bir seri tamamen büyümeyi ortadan kaldıran bir konsantrasyon deneysel ilgi antimikrobiyal eklemek belirgin bir aktivite gösteren bir son konsantrasyona.
  3. üreticinin protokolüne göre bir antimikrobiyal dilüsyonları doğrudan otomatik ilavesi ile tek doz-yanıt ve kombinatoryal sinerji testi kurulumu kolaylaştırmak için otomatik bir sıvı taşıma sistemi kullanın.
  4. Örneğin, alt-katlama seyreltileri kullanılması düşünülebilir841 / 54841eq1.jpg "/> - seyreltme serisi katlayın ve tahlil verilerinin doğruluğu ve tekrarlanabilirliği artırmak için çoğaltır.
  5. Makrofaj Enfeksiyon için, ışık yayan bakterilerin doku kültür ortamı içinde 2.5 x 10 6 CFU (koloni oluşturucu birim) / ml hedef seyreltin. Her bir J774A.1 kültür, nihai deney hacmi 50 ul, nihai bakteri konsantrasyonu, 1 x 10 6 CFU / mL karışımın 20 ul ekle; ve% 100 nispi nemde,% 5, 37 ° C'de CO2 inkübe edin.
    1. Aksenik büyüme testi için, hay ortamı içinde, 1 x 10 6 CFU / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar ışık yayan bakterilerin seyreltilmesi 384 oyuklu plakanın her oyuğuna 50 ul% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe % 100 nispi nemde.
  6. Bakteri büyümesini inhibe antimikrobiyal kombinasyonlar için fraksiyonel inhibitör konsantrasyonu endeksi hesaplayın. Bakteriyel g tam veya>% 99 inhibisyon ile sonuçlanır kombinasyon halinde her bir ilaç (a, b,. n.) içinrowth, (FIC A, B, n,...), ayrı ayrı, kesirli önleyici konsantrasyon hesaplanması aşağıdaki gibidir: FIC a = bileşiğinin konsantrasyonu "bir" minimal inhibitör konsantrasyonu ile bölünen, "a" tek başına. . Sonra birleştirici FIC indeksi hesaplamak veya vb FIC b hesaplamak, aynı formül kullanılarak figure-protocol-1 FIC FIC a + b + FIC =. . Her bir inhibitör kombinasyon için .FIC n.
    1. sinerjiyi değerlendirmek için 1.0 ila uzağa sapma kombinatoryal endeksi kullanın. tutucu bir sinerjistik etkinin göstergesi ve ≥ 4, bir antagonist etki olarak ≤ 0.5 bir kesim düşünün. 12
    2. Konu, isobolograms isocontour isobolograms ve / veya isosurface kombinasyon etkileri 6 alternatif grafik temsilleri isobolograms.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrolevha hücre büyüme deneyi

Şekil 1 tahlil adımlarını diyagramları. gösterilen otomatik adımlar elle yapılabilir. Ancak, verim büyük ölçüde sıvı taşıma sistemleri kullanılarak kolaylaştırılır.

Şekil 2, bir 384 gözlü mikroplaka, çift okuma, gerçek zamanlı hücre içi büyüme ve (Lp02) ya da lux operon (Şekiller 2A, <...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu hücre içi bakteriyel büyüme ve konakçı hücre sitotoksisite eş zamanlı olarak saptanması için gerçek zamanlı analizler açıklanmaktadır. Protokolde birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, sağlam tahlil performansı için, bakteri ve sitotoksisite okumalarla arasında yeterli spektral ayırma olmalıdır. Bu ayırma lusiferaz operon muhabir ve floresan DNA bağlayıcı boyaların kombinasyonlar için esastır. Bununla birlikte, deneyim (Tablo 1-3, Şekil 2), çift kullanımına dayanan, floresan okuyu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda bildirilen araştırma içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır Jek ödül numarası R01AI099122 altında Allerji ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen ve mutlaka Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir Sağlık. Biz ICCB-Longwood Eleme Tesisi ve / veya Ulusal Tarama Laboratuarı için Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale Stewart Rudnicki Paul Yan Richard Siu ve Rachel Warden teşekkür etmek istiyorum Mükemmellik New England Bölge Merkezleri biyosavunma ve geliştirme ve yüksek verimli tarama deneyleri performans onların yardım için (U54AI057159 tarafından desteklenen) Bulaşıcı Hastalıklar Gelişen. Biz de yazının yararlı yorumlar için Kenneth P. Smith teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
J774A.1 hücreleriAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuTIB-67Konak hücre
ACESSigma-AldrichA9758 Tamponlu kömür mayası özütü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için
Maya özütü, ultra filtrelenmişBecton-Dickinson/Difco210929Tamponlu kömür mayası özü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için; daha düşük dereceler, Legionella'nın büyüme inhibitörlerine karşı büyümesinin bozulmasına ve/veya duyarlılığının değişmesine neden olabilir
Alfa-ketoglutarik asit, monopotasyum tuzuSigma-AldrichK2000Tamponlu kömür mayası özütü agar ve tamponlu maya özü ortamı
yapmak için Sodyum piruvatSigma-AldrichP5280Tamponlu kömür mayası özü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için
Potasyum fosfat, dibazikThermo Fisher ScientificP288-500Tamponlu kömür mayası özü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için
L-sisteinSigma-AldrichC-7755Tamponlu kömür mayası özü agar ve tamponlu maya özü ortamı
yapmak içinAmonyum demir (III) sitratSigma-AldrichF5879Tamponlu kömür mayası özütü agar ve tamponlu maya özütü ortamı yapmak için; Bunun yerine ferrik pirofosfat kullanılabilir, ancak doğru bir şekilde tartılması daha zordur
Potasyum hidroksit çözeltisi, konsantreThermo Fisher ScientificSP236-500Tamponlu kömür, maya özütü, agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için
Deonize suN/A/ATamponlu kömür mayası özütü agar ve tamponlu maya özü ortamı yapmak için
Timidin (doku kültürü derecesi)Sigma-AldrichT1895Hem RPMI 1640 hem de tamponlu maya ekstraktı agar / orta ve mdash'ı takviye etmek için daha düşük dereceli timidin ikincisi için kullanılabilir, ancak RPMI 1640'ta bozulmuş hücre büyümesine ve / veya hücre ölümüne neden olabilir
RPMI 1640, standart formülasyonThermo Fisher Scientific10-040-CVCorning Kaplamadan önce J774A.1 hücrelerini büyütmek için; 2 mM L-glutamin içerir
RPMI 1640 fenol kırmızısı eksikThermo Fisher Scientific17-105-CVCorning J774A.1 hücrelerini 384 kuyulu tabakta kaplamak için (kaplamadan önce büyüme için uygun değildir); ayrıca L-glutamin içermez ve kullanımdan önce 2 mM'ye kadar
takviye L-glutamin,% 0.85 NaCl'de 200 mM (doku kültürü derecesi)Thermo Fisher ScientificSH30034.02HyClone L-glutamin içermeyen RPMI 1640'ı takviye etmek için, 2 mM nihai konsantrasyona
kadar Demir takviyeli buzağı serumuGemini Bioproducts100-510RPMI 1640'ı takviye etmek için, %9.1'e kadar nihai konsantrasyon
Tripan Mavisi çözeltisiSigma-AldrichT8154J774A.1 hücre yoğunluğunu sayarken hücre ölümü belirlemesi için
SYTOX Green, DMSO ThermoFisher ScientificS7020'de5 mM çözeltiFloresan okuma veya epifloresan mikroskobu (turuncu-kırmızı veya uzak kırmızı floresan bakteriler ile birlikte) ile J774A.1 hücre ölümü tayini için boyama için. 125 nM nihai konsantrasyonda kullanın.
Hücre kültürü inkübatörüThermo Fisher Scientific13-255-26J774A.1 hücrelerinin inkübasyonu için (hem enfeksiyondan önce hem de sonra); bakterilerin inkübasyonu için de kullanılabilir veya bunun yerine standart bir atmosfer inkübatörü kullanılabilir)
Orbital çalkalayıcıBellCo Glass7744-01010Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için; hücre kültürü inkübatörünün içine sığar; çalkalayıcı tabanı 7744-01000 ve tepsi 7740-01010 içerir (bunlar ayrıca temin edilebilir)
Çalkalayıcı şişeler (250 ml)ChemGlass Yaşam BilimleriCLS-2038-04Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için
Şişeler için çalkalayıcı kelepçeler (250 ml)BellCo Glass7744-16250Çalkalama için, enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin inkübasyonu
Çalkalayıcı şişeler (1.000 ml)ChemGlass Life SciencesCLS-2038-07Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için
Şişeler için çalkalayıcı kelepçeler (1.000 ml)BellCo Glass7744-16100Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için
Şişeler için sünger köpük kapaklar (250 ml-1.000 ml)ChemGlass Life SciencesCLS-1490-038Enfeksiyondan önce J774A.1 hücrelerinin çalkalama inkübasyonu için; Standart metal kapaklara göre kontaminasyon riskini azaltır
MultiDrop Combi programlanabilir çok kanallı peristaltik pompa ThermoFisher Scientific5840300J774A.1 hücrelerini, ortamı ve florofor içeren bakteri süspansiyonunu çok sayıda 384 kuyulu çanağa dağıtmak için
Kombi standart delikli manifoldThermo Fisher Scientific24072670Varsayılan ön dağıtım hacmi 20 &# 956; l uzlaşmayı telafi etmek için yetersizdir — 80 μ'ya artış; l
Beyaz 384 doku kültürü için tedavi edilmiş kuyu yemekleriCorning3570Lüminesans ve floresan okumak için; Greiner kataloğu # 781080 ayrıca başarıyla test edildi
DMSO (kapalı ampullerde doku kültürü sınıfı)Sigma-AldrichD2650Pozitif kontrol ve test bileşiklerini çözmek için
AzitromisinSigma-AldrichPHR1088Antibiyotik pozitif kontrol
Saponin (Quillaja kabuğundan)Sigma-AldrichS-4521Sitoksisite pozitif kontrol
Çok kanallı pipetleyiciThermo Fisher ScientificFinnpipetteSabit miktarlarda pozitif kontrol bileşiklerinin transferi için; pipetleyici, tekrarlayan sabit hacimli dağıtımı mümkün kılmak için mandallı dijital dağıtıma sahip olmalıdır
Epson pin transfer robotuEpson/ICCB-L(Özel ekipman)Kütüphane dizilerinden sabit miktarlarda test bileşiklerinin transferi için
D300 dijital dağıtım sistemiHewlett-Packard TecanD300üzerinden11 pikolitre ile 10 & mikro arasında değişen değişken miktarlarda test bileşiklerinin transferi için; l
D300 dijital dağıtım sistemi için T8 + kartuşlarıHewlett-Packard via TecanT8 +Test bileşiklerini dağıtmak için
Bilgisayar bağlantılı dijital kameralı epifloresan mikroskobuNikonTiCanlı hücre görüntüleme için; herhangi bir standart floresan mikroskobu, faz kontrastı veya DIC optiği ile yeşil (floresen), turuncu-kırmızıdan kırmızıya (Texas Red) ve uzak kırmızı (Cy5) floresansı 100X yağ ile değiştirebilir en yüksek çözünürlük için objektif
Cam tabanlı doku kültürü kaplarıMatTek CorporationP35G-1.5-20-CCanlı hücre görüntüleme için. MatTek gibi çanaklar, ters epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak 600X veya 1.000X büyütmede mikroskobik görselleştirmeye izin verir. Bu özel çanaklar nominal çapı 3,5 cm, iç çapı 3,3 cm, alt kısımlarına 20 mm çapında #1,5 kalınlığında örtü astarları yerleştirilmiştir.
Photoshop CS6AdobeAdobe photoshop veya benzeri programlar, ışık, mikroskobik ve floresan görüntüleri sözde renklendirmek ve birleştirmek için kullanılabilir.
Mathematica 10Wolfamİki boyutlu izokontur izobologramları ve üç boyutlu yüzey izobologramlarının üretilmesi için.
N aracılığıyla aracılığıyla aracılığıyla ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
  2. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
  3. Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
  4. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
  5. Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
  6. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
  7. Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones? Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
  8. Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
  9. Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
  10. Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).
  11. Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
  12. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  15. Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
  17. Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
  18. Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
  19. Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
  20. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
  21. Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).
  22. Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
  23. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
  24. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
  25. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
  26. Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ger ek Zamanl AnalizY ksek Verimli TaramaBakteriyel Lux OperonuFloresan Protein Raporlay c larN kleik Asit Ba lay c BoyaOtomatik S v Aktar mSinerji Testi

İlgili makaleler