Pinewood Nematodu gözlem ve Çiftleşme Davranış miktarının belirlenmesi, Orijinli olanlar

Summary

Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus'un çiftleşme davranışını araştırmak için bir protokol sunulmuştur. B. xylophilus'un davranışsal özellikleri çiftleşme sürecinde açıklanmaktadır.

Abstract

Gözlemlemek ve çam nematod, orijinli olanlar çiftleşme davranışı ölçülmesi için bir yöntem olup, bir stereo mikroskop altında kurulmuştur. B. xylophilus'un çiftleşme verimliliğini artırmak ve çiftleşme gözlem şansını artırmak için, bakire yetişkinler kültür ve soruşturma için kullanılır. Yumurta suda nematod tutmak ve dişiler 10 dakika boyunca yumurtalarını bırakmak için izin vererek elde edilmiştir. Ikinci aşama yavru (J2) karanlıkta 25 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edilerek yumurta senkronize edildi ve erken J4 bir 52 saat daha, gri küfe, Botrytis cinerea ile J2 kültürlenmesiyle elde edilmiştir. Bu sefer noktada, çoğu J4 nematod genital morfolojisi kullanarak erkek ya da kadın olarak açıkça ayırt olabilir. erkek ve dişi J4 toplandı ve bakir yetişkin nematod için 24 saat boyunca, iki farklı Petri kapları ayrı ayrı kültürlenmiştir. Bir bakire erkek ve bakire kadın wat bir damla eşleştirilmişiçbükey sürgünün oyuk er. çiftleşme davranışı bir stereo mikroskop altında bir video kaydedici ile çekildi. çiftleşme sürecinin tüm dönem 82.8 ± 3.91 dakika (ortalama ± SH) ve 4 farklı aşamalarında bölünmüş olabilir: arama, temas çiftleşen ve kalıcı. süresi ortalama dakika sırasıyla 21.8 ± 2.0, ± 1.9 28.0, 25.8 ± 0.7 ve 7.2 ± 0.5 idi. Onbir alt davranışlar tarif edildi: seyir yaklaşıyor, karşılaşmadan, boğmaca, dokunmadan, yerini, bağlama, ejaculating, sessizliğini ayıran ve dolaşım. bir kadın 3 erkek veya 3 kadın ile bir erkek ile gruplandırılmış zaman İlginçtir, bariz içi cinsel rekabet gözlendi. Bu protokol, B. xylophilus'un çiftleşme davranışı araştırırken, aynı zamanda diğer nematodların etiyolojik çalışmalar için bir referans olarak hareket sadece, kullanışlı ve değerlidir.

Introduction

Çam ağacı nematodu, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner ve Buhrer) Nickle, çam ağaçlarının solmasına ve nihayetinde ölümüne neden olan en yıkıcı istilacı türlerden biridir. Bu patojenik nematodun ABD'ye özgü olduğuna inanılıyor, ancak Çin, Japonya, Güney Kore ve Portekiz dahil olmak üzere birçok ülkeye taşındı. Son zamanlarda, İspanya'da da bildirilmiş, milyonlarca çam ağacını büyük ekonomik kayıplarla öldürdüğü ve orman üretimini ve ekolojik istikrarı tehdit ettiği^1-5.

Bir konakçı çam ağacı ağacı nematodları tarafından enfekte edildiğinde, binlerce milyon yavru gövde içinde hızla çoğalır. Bu, ksilem disfonksiyonuna neden olur, solmaya ve sonunda konakçı ağacın^ölümüne neden olur 6. Bununla birlikte, şu anda bu hastalığı kontrol etmenin etkili bir yolu yoktur. Çiftleşme davranışı, bu nematod^7'nin yüksek doğurganlığında önemli bir rol oynayabilir. Bu nedenle, B. xylophilus'un çiftleşme davranışını laboratuvarda araştırdık, çiftleşmesini bozmanın ve doğurganlığını azaltmanın etkili bir yolunu bulmaya çalıştık.

Bu protokol, B. xylophilus'un bakire yetişkinlerinin nasıl elde edileceğine ve bir video kaydedici ve stereomikroskop kullanılarak çiftleşme davranışının nasıl gözlemleneceğine ve analiz edileceğine dair ayrıntılı yöntemleri tanıtmayı amaçlamaktadır. Bu protokol aynı zamanda diğer nematodların davranışsal çalışmaları için bir referans olarak da kullanılabilir.

Protocol

Virgin Yetişkin Nematodlar 1. kazanılması

1. Pinewood nematod izolatı ve kültür koşulları
   B. xylophilus'un Nxy61 aslen Çin'de Zhejiang eyaletinin Ningbo alanında hastalıklı Pinus massoniana elde edildi izole: NOT.
   1. (PDA Malzemelerin Tablo bakınız) Patates Dekstroz Agar hazırlayın Botrytis cinerea yetiştirmek için plakaları.
   2. Aşılaması için, B. cinerea mat 10 mm çaplı mantar mat bir parça zımba ve yeni bir PDA plakanın ortasına koydu. Kültür karanlıkta 25 ° C'de 5 gün boyunca B. cinerea.
   3. Kültür karanlıkta 25 ° C 'de B. cinerea içeren hazırlanmış bir petri çam nematodları.
2. B. xylophilus'un yumurta kazanılması
   1. bir huni altında kenetlenmiş kauçuk tüp yerleştirin ve montajı rafa hazırlanan huni tutunBaermann huni cihazı. huni ağzına filtre kağıdı yerine gazlı bez iki kat yerleştirin.
   2. huni kurulum mantar kültürleri aktarın ve mantar mat batırılır kadar su ekleyin. 2 saat bekleyin ve nematod, mantar kültürü çıkıp filtre kağıdı çapraz ve Baermann huninin en alt kısmında yerleşmek olacaktır.
   3. 15 ml tüp içine tüpün tabanından su damlaları ilk çift toplamak ve yavaş tüp kelepçe bırakarak nematodları toplar.
   4. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 3000 x g'de yukarıda koleksiyonları santrifüjleyin.
   5. Bir pipet ile suyun üst tabaka uzaklaştırılır ve çift damıtılmış steril (dd), 1 mL _H2O ile yeniden süspanse
   6. Bir pipet ile, yeni bir cam Petri kabı (6 cm çapında) Yukarıdaki tabanda aktarın. Nematod özgürce yüzmek mümkün olduğundan emin olmak için Petri kabı steril dd _H2O 3 mL ekleyin.
   7. glas nematod tutunKaranlıkta 25 ° C 'de 10 dakika süre ile Petri kabı s. Yumurta hamile kadın tarafından döşenecek. Çünkü onların glikoprotein yüzeyinin, yumurta cam Petri kabı altına sopa olacak.
   8. Yumurta bozmadan dikkatlice su ve solucanları temizler. Kurumasını yumurta önlemek için hemen cam Petri kabı steril dd _H2O 3 mL ekleyin.
   9. Adımı tekrarlayın 1.2.8 3x tüm larvaları ve yetişkin kaldırmak ve saf yumurta elde etmek. Petri kabı steril _{dd, H2O} ilave 2 mL (toplam 5 mL) ilave edilir.
3. Dördüncü aşama gençlerin kazanılması (J4 larva)
   1. Hatch 25 ° C'de karanlıkta, 24 saat boyunca toplanan yumurtalar J2 larva elde edildi.
   2. 2 dakika boyunca 3000 x g'de 15 ml tüp, santrifüj bir pipet ile J2 larvaları transferi ve suyun üst tabakayı kaldırmak.
   3. Steril _{dd, H2O} 200 uL J2 larvaları yeniden süspanse ve aktarmakB. cinerea içeren PDA plakası.
   4. Kültür karanlıkta 25 ° C 'de 52 saat boyunca J2 larva. Bu zaman noktasında, en J2 larva J4 larvaların erken aşamada haline olacaktır.
4. Bakire yetişkin nematod kazanılması
   1. bir alkol brülör üzerine ısıtıldıktan sonra bir cam kılcal çizerek nematod toplamak için bir iğne hazırlayın.
      NOT: Bu kılcal iğne ucu, genellikle tek bir nematodu alınması için bir araç olarak kullanılabilir ve böylece, çapı 50 mikron, yetişkin bir nematod kabaca gövde genişliği olmalıdır.
   2. Bir Baermann hunisi monte ve adımları 1.2.1'de tarif edildiği gibi 2 saat boyunca mantar kültürlerinden nematod çıkarmak - 1.2.3.
   3. Temiz bir Petri kabı içine su ile J4 aktarın.
   4. Bir stereomikroskop altında nematod gözlemlemek ve Mamiya ve Kiyohara ⁸ (Şekil 1 tarafından açıklandığı gibi, genital morfoloji kadınlar ve erkekler arasında ayrım ). Hazırlanan kılcal iğne ile istenilen seks nematod Pick up ve erkeklerde veya kadınlarda uygun fungal kültür plaka transfer.
      NOT: erkeklerden daha fazla kadın 60 kadın yüzdesi ile vardır -% 70. kadın vulva erkek spicule Açıkçası farklıdır. yetişkin ile karşılaştırıldığında, erken evre J4 içinde spicule veya vulva küçük, ama yine de kolayca görülebilir ve ayırt edilebilir. nematod her zaman, bazen kadın ve erkeklerin ayırt zorluk artar, su, hareket ediyor.
   5. Kültür karanlıkta 25 ° C 'de 24 saat daha J4 larva.
      NOT: Tüm nematod yetişkinler haline, ama onlar unmated olduğundan, bunlar bakire yetişkin olarak kabul edilmektedir.
   6. Baermann hunileri iki birleştirin ve adımları 1.2.1 açıklandığı gibi, 2 saat boyunca mantar kültürlerden bakire yetişkin ayıklamak - 1.2.3 ve iki ayrı, temiz Petri kapları içine bakire yetişkin erkek ve kadın aktarın.

2. Gözlem ve çiftleşme Davranış Video Kayıt

1. Birkaç içbükey slaytlar hazırlamak ve onların kuyuların her steril dd _H2O 200 mcL ekleyin.
2. Bir kılcal iğne ile hazırlanan bakire yetişkin erkek veya kadın ve Pick up ve her içbükey slayt suya sadece bir nematod koydu.
3. onlara yeni sulu ortama uyum sağlamak için 1 saat boyunca hazne içinde bakire yetişkin tutun.
4. Bir pipet kullanarak başka iyi birinden bunlardan biri aktararak bakire erkek ve dişi çifti.
5. Bir stereomikroskop altında içbükey slayt 1♀ + 1♂ kombinasyonunun çiftleşme davranışları gözlemlemek.
6. bakire yetişkinlerin çiftleşme etkinliğini analiz etmek, onların çiftleşme başarı oranını (R) hesaplar ve rastgele seçilen yetişkin çifti ile karşılaştırın. birleşme çalışılan çoğaltır sayısına kıyasla görülmüştür ki çoğaltır yüzdesi olarak R hesaplayın.
7. Çiftleşme seçimi ve intrasexual rekabet, grup araştırmak ve iki farklı kombinasyonlar bakire nematod gözlemlemek için: 1♀ + 3♂ ve + 1♂ 3♀.
8. kalitatif ve kantitatif analiz için veri toplamak amacıyla, Video mikroskopi kullanılarak çiftleşme davranışı filme. Normal olarak, birleşme sonrası birbirinden ayrıldığı zaman nematod an içbükey sürgünün çukuruna yerleştirilir zaman bütün birleşme işlemi, 2 saat içinde tamamlandı. Bu nedenle, bir tekrar en az 2 saat boyunca sürekli olarak birleşme işlemi kaydedilir. en az 30 Komple her kombinasyon için toplam çoğaltır.
   Not: kayıt işlemi sırasında buharlaşma için oyuğuna daha steril GG S, her 0.5 _H2O (genellikle 50 uL) eklenir.

3. Veri Toplama

1. Bir bilgisayar ekranında dikkatlice videoları görüntülemek ve niteliksel alt davranışları karakterize.
2. çiftleşme kullanarak th süresini ölçmekvideo kaydedici, e kare-kare fonksiyonu. El ile bitiş noktası başlayarak zaman çıkarın.
3. 1♀ + 1♂ kombinasyonu için, her video kaydını analiz etmek ve aşağıdaki olaylardan süresini ölçmek:
   1. Arama süresini ölçmek (yani, kadın ve erkek karşılaştıkları an içbükey slayt kuyuya tanıtıldı ve birbirine temas edildiğinde geçen süre).
   2. Temas süresini ölçmek (yani, erkek tam ilk çiftleşme için dişinin vulva konumlandırılmış an ilk temas süresi).
   3. Copulating süresini ölçmek (yani, o boşalma sonra yerde kadın vücudundan kayarak kadar erkek tam dişinin vulva konumlandırılmış tarihten itibaren zaman). Not: Bazı nematod 2 saat içinde birkaç kez copulate edebilirsiniz. Bu gibi durumlarda, LAS sonunda ilk çiftlerin çiftleşme süresinin ölçülmesiarasındaki zaman dahil olmak üzere, t, bir,.
   4. Kalan süresinin ölçülmesi (yani, birleşme sonrası dönem erkek ve dişi yüzmek birbirinden uzağa daha fazla nematodlar vücut uzunluğundan daha bir mesafe ile ayrılır kadar (genellikle, 1 mm)).
4. Çiftleşme frekansı ve her birleşme süresi ve farklı kombinasyonlarının her biri için 2 saat tüm çiftleştirerek ortalama süreyi saymak (yani, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ ve 1♀ + 3♂).
5. derhal ve hiç ara vermeden yapılan ilk temas, sonra çiftleşme başarı oranı gibi farklı kombinasyonlar için ilk temas (P) çiftleşme başarı oranını hesaplayın. temas aşamasında, çeşitli temas gerçek birleşme öncesi gözlenen olabilir.
   1. iki kişi arasındaki mesafe vücut uzunluğundan daha fazla olduğu zaman, bitecek bir kişiyi düşünün. bir tekrarında, kayıt P 100% olarak çiftleşme is ara vermeden, ilk temastan hemen sonra görülen veya 0.00% no çiftleşme gözlendi ya da eğer çiftleşme ancak iki ya da daha fazla temas sonra varsa.
      NOT: Burada anlatılan her kombinasyon için 30 suret vardı.

Results

Bakire yetişkinlerin çiftleşme başarı oranı (R) rastgele seçilmiş yetişkinlerin önemli ölçüde daha yüksek olduğu, ortalama 86,67% oldu: 13.33 ± 4.65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0.0001) (Şekil 2). Bu bulgu B. xylophilus'un rastgele seçilen yetişkinlere göre daha bakir yetişkinlerle çiftleşme davranışlarını gözlemlemek için daha kolay olduğunu göstermektedir.

bir erkek bir kadın ile eşl...

Discussion

Davranış testleri, kimyasal ekoloji, nörobiyoloji, moleküler biyoloji ve genetik bir temel yönü vardır. Nematodlar, ve özellikle de C. elegans, yoğun bu alanda araştırmalar için kullanılmaktadır. C. elegans 'çiftleşme davranışı, daha önce ^10-11 araştırılmıştır. Bununla birlikte, B xylophilus'un gonochoristic ve hermafrodit C. elegans farklıdır, ve birleşme işlemi farklı davranış özellikleri ⁹ sahiptir. Son zamanlarda, Bursaphelenchus okinawaensis,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus Nxy61			'den izole > Çin'in Ningbo bölgesindeki Pinus massoniana
Ormancılık Akademisi'nden Elde Edilen	Gri küf suşu
Baermann hunileri	Sengong
şahin tüpleri	Sengong
santrifüj	Sengong
pipet	Sengong
steril dd H2O			121 ° C'de yüksek buhar basıncı ile sterilize edilmiştir; 30 dakika boyunca C.
Petri kapları	Sengong
PDA ortamı	Huankai Bio.	021050
kuluçka	makinesi Sengong
Laminer akış	Sengong
cam kılcal	Sengong
Stereoskop	Leica	LED5000 RL
ters stereo mikroskop	Zeiss	A1
içbükey slaytlar	Sengong