Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Summary

Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.

Abstract

Gen ifadesi heterojen lenfoid toplumlarda araştırmak için ilginç bir özelliktir. Bu hücrelerde gen ifadesi hücre aktivasyonu, stres veya uyarılması sırasında değişir. Tek hücreli çoklu gen sentezleme gen ^{1, 2, 3} onlarca aynı anda değerlendirilmesine olanak sağlar. Tek hücre düzeyinde, çoklu gen ekspresyonu popülasyon heterogenitesi ^{4, 5} belirler. Olgun hücreleri arasında farklı öncül aşamalarında olası karışımını ve aynı zamanda uyaranlara hücre yanıtlarının çeşitliliği hem de belirleyerek nüfus heterojenite ayrımı sağlar.

Doğuştan lenfoid hücreleri (LAK) en son bağışıklık tepkisi ^{6, 7} doğuştan efektörlerinin bir popülasyon olarak tarif edilmiştir. LAK kendisinden Bu protokolde, hücre heterojenlikhepatik bölme homeostazındaki sırasında incelenmiştir.

Şu anda, gen ekspresyonunu değerlendirmek için en yaygın olarak kullanılan bir teknik, RT-qPCR olup. Bu metot ölçümlerinin gen aynı anda yalnızca tek bir gen. birden çok hücre bir test için gerekli çünkü ek olarak, bu yöntem, gen ekspresyonunun heterojen tahmin edilemez. Bu popülasyonun ortalama gen ekspresyonunun ölçülmesi yol açar. gen çok sayıda değerlendirilirken, RT-qPCR bir zaman-, reagent- ve numune alıcı bir yöntemdir olur. Bu nedenle, ticaret-off küresel resim eksik riskini artıran değerlendirilebilir genler ya da hücre popülasyonlarının sayısını sınırlamak.

Bu yazının tek hücreli çoklu RT-qPCR bu sınırlamaları aşmak için nasıl kullanılabileceği anlatılmaktadır. Bu teknik son Mikroakiskan teknolojik gelişmeler ^{1, 2} yararlanmıştır. Multipleks RT-qPCR fiş meydana gelen reaksiyonlar tarifeler yoknanoliter düzeyi eed. Bu nedenle, tek bir hücre, gen ekspresyonu, hem de aynı anda birden fazla gen ekspresyonu, Örnek, bir reagent- uygulandı, ve maliyet-etkin bir şekilde olabilir. ^{5 farklı} gelişim aşamalarında veya farklı koşullar altında ⁴ bir popülasyon içindeki hücre alt arasındaki klonal düzeyde hücre gen imza heterojenitesini test etmek mümkündür. tek hücre düzeyinde koşulları, çok sayıda nadir nüfus üzerinde çalışmak artık bir kısıtlamadır.

Introduction

Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, doğuştan lenfoid hücreler (Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar) giderek incelenmiştir. antijene spesifik reseptörlere karşı olmamasına rağmen, lenfoid soyuna aittir ve doku homeostazında ve iltihaplanma önemli sentineli temsil etmektedir. Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar şu transkripsiyon faktörü kombinasyonları kendi ifadesi ve sitokinler ^{6, 7} üretme yetenekleri göre üç gruba ayrılır.

Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar belirli sitokin üretimi ^{8, 9} vasıtasıyla çeşitli organlarda çok sayıda homeostatik ve patofizyolojik durumlara katkıda bulunur. Bu hücrelerin rolünü anlamak mümkün, organın başına çeşitli LAK alt popülasyonlar belirlemek ve bunların gelişim ilişkilerini belirlemek önemlidir. Buna ek olarak, farklı alt arasındaki plastisite olayları ile ilgili edilmiştir. heterojenitesini inceleyerekBir organın içinde mevcut hücre, bunlann olgunlaşma aşamasına sınırlandırmak için ve özel fonksiyonları ayırt etmek mümkündür.

Tek hücreli çoklu RT-qPCR tekniğini göstermek için, karaciğer Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar aynı LAK grupta (tip 1 LAK) ¹⁰ içinde kendi heterojenite özel bir vurgu ile, seçildi. İlk olarak, akış sitometrisi kullanılarak, üç farklı LAK popülasyonları karaciğerde karakterize edilmiştir. iki nüfus az hepatik LAK popülasyonları (doğuştan efektörlerinin% 5'ten az) ise Grup 1 ILC doğuştan efektör yaklaşık% 80'ini oluşturmaktadır. Bu popülasyonlar LAK nüfusun yaygın olarak dile hücre yüzey belirteçleri kullanılarak dizildi. Sonuç olarak, karaciğerde LAK popülasyonları başka büyük oranda benzer bir bakmak sınıflandırılmaktadır.

Tek hücreli çoklu RT-qPCR derhal bu popülasyonların ¹¹ heterojenitesini araştırmak için en iyi tekniklerden biri olarak ortaya çıkmıştır Yukarı. İki ana özellikleri tek hücreli çoklu RT-qPCR tekniğin yararlanan belirlenir. İlk olarak, klonal düzeyde bakarak, görünüşe göre benzer gelişim aşamalarını göstermek hücreler arasında karşılaştırma için hücre spesifik gen ifadesi kurtarmak mümkündür. Daha sonra, gen ekspresyonunun önceden seçilmiş bir kombinasyon bakarak, biz bir zaman noktasında eş zamanlı olarak gen ekspresyonu göre yeni gen imza belirleyecektir. tekniği klonal düzeyinde gerçekleştirilir, çünkü bu yönleri, daha az nüfus, hücrelerin geniş bir sayısı için sentezleme verilerinin bir çok çeşitli toplama izin verir. Böylece, karaciğer ILC heterojenite yeterli değerlendirilebilir.

Daha sonra, bir küresel ILC fenotipe sahip tüm hücreleri sıralayarak, karaciğer LAK popülasyonlarının çok gen ekspresyonu geniş bir genel son derece nadir popülasyonları temsil etse de, elde edilir. Bir Mikroakışkan tabanlı çip bile deney sağlarHücre maddesinin küçük bir miktar. Bunun bir sonucu olarak, nadir bir hücre popülasyonlarının gen ekspresyon profilleri elde edilebilir. Online gen imza analiz yazılımı, hücre popülasyonu kümeleri ve potansiyel hücre ilişkileri kullanılarak araştırılabilir. Sonuç olarak, fonksiyonel test in vivo düzeyde kümelenme verileri doğrulamak için gerçekleştirilebilir.

Genlerin onlarca aynı çip ^{3, 11, 12,} yüzlerce ya da daha fazla tek hücreler üzerinde eş zamanlı olarak değerlendirilebilir. Deneyin tasarımı Deney en uzun ve en önemli parçasıdır. test edilecek hipoteze ilgili genlerin belirlenmesi, ilgili sonuçlar elde etmek için her şeyden önemlidir. İkincisi, ve özel kontroller (örneğin sıralama için kullanılan bilinen yüzey belirteçleri gibi) iç kontrol ihtiyaç vardır. Bu primer amplifikasyon özgüllük, amplifikasyon verimliliğini ve t test etmek çok önemlidirastar rekabet o yokluğu. Bir hücrenin birden çok gen ekspresyonu, aynı zamanda değerlendirilir Bu nedenle, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR ile çalışan bir zaman kazandıran bir tekniktir.

tüm hücreler için reaktiflerin aynı çip ve karışımı kullanılarak manipülasyon olası hataları sınırlar ve örnekler arasındaki tekrarlanabilirlik sağlar. Tamamen tek hücreli çoklu RT-qPCR farklı yönlerini örnekler ve genlerin çok çeşitli duyarlılık büyük bir seviyeye sahip, klonal düzeyde son derece güvenilir sonuçlar üretimine olanak sağlamaktadır. Elde edilen sonuçlar biyoistatistiksel testler için güçlü ve sağlam veri sunuyoruz.

Bunun nedeni, maddenin çok küçük miktarlarda çalışma sağlar ve ayrıntılı sonuçlara yol açar yöntemin mikroakışkan yönüne elde edilebilir. Son olarak, çevrimiçi yazılım kullanarak, istenilen popülasyonları karşılaştırmak mümkündür.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Fransız Tarım Bakanlığı ve AB kurallarına uygun olarak Pasteur Enstitüsü Güvenliği Komitesi tarafından onaylanan bulundu.

1. Bir 96-yuvalı Tek hücreli Sıralama Plaka Hazırlama

1. Belirli bir retro transkripsiyon tamponu 5.0 ul, düşük etilendiamintetraasetik asit (EDTA) TE tamponu (10 mM TE çözeltisi, pH 8, ve 0.1 mM EDTA solüsyonu, 1.3 ul ekleyerek 1.5 ml bir tüp içinde ön amplifikasyon karışımı hazırlanması 0.2 uM filtre ) ve Taq DNA polimeraz oyuk başına (Şekil 1a, 0.2 ul).
2. 96 oyuklu bir plaka üzerinde, her bir (en fazla 48 kuyu) 'de ön amplifikasyon karışımı 6.5 ul dağıtın. Bu plaka, 96 gözlü, tek-hücre sıralama levhasıdır.
   NOT: Bir elektronik pipet kullanarak bu protokol için tavsiye edilir. Bu hassas ve tekrarlanabilir hacim ölçümleri sağlar ve zaman kazandırır.

(A) plaka sıralama 96-iyi tek hücreden üzerinde ön amplifikasyon karışımı 0.2x tahlil karışımı ardından ilk dağıtılır. (B) her tek hücreli pozisyonunun rekor bir tablo üzerinde tutulmalıdır. İyi olmayan bir hücre, bir "herhangi bir giriş" de denir ve bir kontrol olarak kullanılabilir. İki sıra cDNA seyreltme (bir hücreye 10 ⁵ hücre eşdeğer sıralı tek-in-on seyreltme) ile astar etkinliğini kontrol etmek kurtulmuş olabilir. 96 gözlü esey plâkasının (c), deney yükleme reaktif primerlerin ilave edilir, önce dağıtılır. her bir primer pozisyonda bir düzen tutmak için unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Her bir primerden 1.4 ul ekleyerek 1.5 ml bir tüp içinde bir 0.2x deney karışımı hazırlanması (primerler 20x, en fazla 48 farklı prob; bakınız Tablo 1). Düşük EDTA TE tamponu ile 140 ul son ses seviyesini ayarlayın.
4. Ön amplifikasyon karışımı içeren 96 gözlü, tek hücreli ayırma plakası 48 çukurlara 0.2X deney karışımı 2.5 ul dağıtın.
   Not: 9 ul olmalıdır 96 gözlü numune plakasının her çukuruna son hacim.
5. Bir kapak film ile plaka mühür. plaka vorteks ve 45 saniye boyunca 280 xg'de aşağı doğru döndürün. -20 ° C'de 96-çukurlu bir hücre ayırma plakası saklayın veya hemen kullanın.

2. Tek Hücre Ayrılma

1. _CO2 dağıtım sistemi kullanılarak, hipoksi ile fare euthanize. Bir diseksiyon plaka üzerinde fare düzeltmek ve makas kullanılarak boyuna periton boşluğuna açılır.
2. karaciğer LAK kurtarın.
   1. Karaciğer izolasyon öncesinde, floş livhücreler ER-dolaşım.
      1. portal ven ortaya çıkarmak için, küçük ve farenin sol tarafına kalın bağırsak hareket; Portal ven periton boşluğuna en büyük ven olarak görünür.
      2. 10 ml'lik bir şırınga ve 0.45 mm'lik bir iğne ile, damar üzerinden fosfat-tamponlu salin ortamı (PBS) ile karaciğer yıkayın. Karaciğer kızarma kolaylaştırmak için, makasla gastrik arter kesti.
      3. safra kesesi kaldırmak için, forseps ile safra kesesi tabanını çimdik ve makas ile karaciğer ayırın.
      4. karaciğer izole etmek, forseps ile karaciğer tabanını çimdik ve makas kullanılarak, periton boşluğuna geri kalanından karaciğer ayırın.
      5. Roswell Park Memorial Institute 5 ml ortam (RPMI),% 2 fetal sığır serumu (FCS) içeren bir çömlekçi tüp içinde karaciğer aktarın.
3. Bir havan kullanılarak mekanik ayrışma ile karaciğer ayırmak. 15 ml'lik bir tüpe orta aktarın. toplam hacim getirRPMI% 2 FCS ile 14 ml. hepatositler decant 15-20 dakika süreyle buz üzerinde hücre süspansiyonu bırakın.
4. 1 ml pipet kullanarak yeni bir 15 ml tüp içinde (hepatositler) olmadan süpernatant kurtarma (süpernatant 12 mi beklenebilir). 10 ° C'de 7 dakika boyunca 120 xg'de Spin. santrifüj sonra süpernatant atın.
5. Yoğunluk gradyan ortamı 14 ml adım 2.4 'de elde edilen pelletini (örneğin, Percoll% 40). 20 ° C'de 20 dakika boyunca 600 x g'de Spin. Aspirasyon ile süpernatantı.
6. potasyum asetat, 1 ml (ACK) pelletini. 1 dakika için oda sıcaklığında bırakın. 1 dakika sonra, Hank Dengeli Tuzlu Çözeltisi (HBSS),% 2 FCS ile 14 ml toplam hacmi getirmek. 10 ° C'de 7 dakika boyunca 120 xg'de Spin. süpernatant atın.
7. hücreleri leke.
   1. Biyotinlenmiş antikor karışımı (Malzeme Tablosuna bakınız 300 ul pelletini, tüm biyotinlenmiş antikorlar söz eklemekEd) ve 1.5 ml tüp hücreleri aktarın. 4 ° C'de 20 dakika boyunca karanlıkta bırakın.
   2. HBSS% 2 FCS ile 1 ml toplam hacmi getirmek. 10 ° C'de 7 dakika boyunca 120 xg'de Spin. (Malzeme Tablo bkz belirtilen tüm florokrom-bağlanmış antikor ekleyin) florokrom-bağlanmış antikor karışımı ve florokrom-eşlenik streptavidin 300 ul pelletini. 4 ° C'de 20 dakika boyunca karanlıkta bırakın.
8. HBSS% 2 FCS ile 1 ml toplam hacmi getirmek. 10 ° C'de 7 dakika boyunca 120 xg'de Spin. 1 ml pipet kullanarak süpernatantı. 1 mi HBSS ve propidyum iyodür pelletini (Pi; 1: 4,000).
   NOT: yaygın ifade LAK hücre yüzey belirteçleri kullanırken, 3 popülasyonları tanımlanmıştır: NKp46 ⁺ IL-7Rα ^- NKp46 ⁺ IL-7Rα ⁺ ve NKp46 ^- IL-7Rα ^+. Tüm popülasyonları soy sıralanır ^- CD3 ^- CD4 ^- CD45.2 ^+.

3. Tek hücreli floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS)

1. Tek hücreler ¹³ sıralamak için FACS kullanın.
   Not: Farklı hücre tipleri, aynı 96-yuvalı, tek hücreli ayırma plakasında sıralanabilir (Şekil 2).
   1. de 0.2X deney karışımı ve 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakasında ön amplifikasyon karışımı içeren her bir hücre sıralamak için FACS kullanın. yeni hazırlanmış bir 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakası kullanarak veya -20 ° C'de muhafaza edildiğinde bu eritin.
      1. FACS plaka tutucuya mühürlü bir 96 oyuklu plaka koyun. bir test olarak, boş bir 96 oyuklu plaka kullanınız. ile plaka yerleştirin A1-de solda ve deneyci doğru.
      2. Doğrulama boncuklar A1-iyi merkezine bir düşüş elde etmek için levha tutucu ayarlayın.
      3. A hattı tüm kuyuların ile adımı yineleyin 3.1.1.2
      4. 96 gözlü plaka conta ve oyuk başına kriteri 100, doğrulama boncuk çıkarın. d edinKuyuların merkezinde rop oluşumu.
      5. düzgün ayarlanmış olduğunda, plaka sahibinin 96-kuyu tek hücreli sıralama plakasını yerleştirin. plaka düzeni ve kuyu başına sıralama 1 hücre çizin.
         Not: 96 oyuklu bir hücre ayırma plakası üzerinde, her hücrenin doğru yerleştirilmesi gereklidir. Bir plaka düzeni bir elektronik tablo yazılımı üzerinde tutulmalıdır. Plaka düzeni sonraki birkaç adımda (Şekil 1b) ¹⁴ kullanılır. hücreleri olmadan 96-kuyu örnek plaka üzerinde bir de içeren 0.2x tahlil karışımı ve Preamplıfikasyon karışımı bırakın. Bu da, bir No-girişli kontrol olarak kullanılır. bir cDNA seyreltme için 6 kuyu iki sıra boş. Bu kuyular, primer etkinlik (Şekil 1b) için kontrol olarak kullanılır.
      6. -20 ° C'de 96-çukurlu bir hücre ayırma plakası saklayın veya hemen kullanın.

4. Ön amplifikasyon

1. taze veya 96-iyi çözülmüş tek hücreli sıralama plaka OBT kullanınAdım 3.1.1.6 yılında ained. (45 saniye için 280 xg) plaka vorteks ve aşağı doğru döndürün.
2. PCR 96-kuyu tek hücreli sıralama plaka koyun. Şekil 3 ve Tablo 2 'de belirtilen program uyarınca ters transkripsiyon ve ön amplifikasyon gerçekleştirin.

Şekil 3: Ön amplifikasyon programı. yeterli malzeme elde edebilmek için, sıralanmış tek hücreler üzerinde olduğundan belirli hedef genlerinin ön amplifikasyon gerekir. 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakası ön amplifikasyon programı izlemek için bir ısıl üzerine yüklenir. Ön amplifikasyon ürünleri daha sonra, düşük EDTA TE tamponu ile seyreltildi ve hemen kullanılır veya -20 ° C de dondurulabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Ön amp sulandırmakher kuyuya düşük EDTA TE tamponu 36 ul ekleyerek örnekleri lified.
4. Bir kapak film ile plaka mühür. (45 saniye için 280 gr) plaka vorteks ve aşağı doğru döndürün. -20 ° C'de önceden büyütülmüş, 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakası saklayın veya hemen kullanın.

5. 96-çukurlu bir numune plakası hazırlayın

1. qPCR Master karışımı 175 ul ve örnek yükleme reaktif 17.5 ul ekleyerek ana karışımı 191 ul hazırlayın.
2. Yeni 96-kaynaklı tabaka üzerinde kaplanmıştır her bir (en fazla 48 kuyu) 'de ana karışımı 3.6 ul dağıtın. Bu 96-kuyu örnek levhasıdır.
3. Yeni 96-iyi levhaya 96 oyuklu bir örnek plakası öncesi amplifiye cDNA 2.9 ul aktarın. 96, tek bir hücre ayırma plakası ve 96-çukurlu bir örnek plakası arasındaki her bir numune için aynı pozisyonda tutmak.
4. Bir kapak film ile plaka mühür. (45 saniye için 280 xg) plaka vorteks ve aşağı doğru döndürün. ışıktan koruyarak buz üzerinde yeni bir 96 oyuklu plaka koyun. 96-kuyu s Mağaza-20 ° C'de bol plaka hemen kullanabilir veya.

6. 96 oyuklu bir deney plakasının hazırlanması

1. Yeni 96-kaynaklı tabaka üzerinde kaplanmıştır her bir (en fazla 48 kuyu) 'de deney yükleme reajanı 3 ul dağıtın. Bu plaka, 96 oyuklu bir deney plakası olarak adlandırılır.
2. Her bir oyuğa primerler 3 ul ekle. Bir tablo yazılım üzerinde bir düzen tutun (Şekil 1c ve Tablo 1; Tablo 1'de listelenen tüm primerler kullanın). 96 gözlü esey plâkasının her bir primerin doğru yerleştirilmesi sonraki birkaç adımda için gereklidir.
   1. numune sayısı 48 altında ise, kullanılmayan oyuklara yerine su primerler ekleyin.
3. Bir kapak film ile plaka mühür. (45 saniye için 280 xg) plaka vorteks ve aşağı doğru döndürün. -20 ° C'de 96 oyuklu bir deney plakası saklayın veya hemen kullanın.
   NOT: primerler tekrarlanan donma ve çözülme önlemek Preamplıfikasyon karışımı için primerler dağıtmak ve 96-wel için içinAynı zamanda L deney plakası.

7. Tek hücreli Gen-ifadesi Chip

1. bankta entegre mikroakışkan devre (IFC) yerleştirin ve şapkalı şırınga kullanarak çek valfler. , Şırınga açın vana dik yerleştirin ve sıkıca basın. O-ring hareket etmelidir. Kontrol çizgisi sıvısı ile çip (tüberkülin 0.3 ml) doldurun.
2. İkinci valfli adımı yineleyin 7.1.
   NOT: Hiçbir sıvı çip dökülen edilmelidir.
3. çipin alttan mavi filmi çıkarın. IFC denetleyicisi içine çip yükleyin. IFC denetleyici ekranında, "PRIME" ve ardından "RUN." mikroakışkan hatlarının kontrolü 10 dakika sürer.
4. çip çıkarın ve çip altındaki mavi filmi yeniden mühür.

Şekil 4: Tek hücreli multipleks gen ifadesi çip yükleme. Bu adımlar g gerektirirÖzellikle, tek hücreli çoklu gen sentezleme çip 96 oyuklu plakanın aktarım sırasında reat hassasiyet,. yükleme hataları ve hatalara önlemek için, son derece seri bir şekilde çalışarak tavsiye edilir. Her bir transfer için alınan ses pipetleme işlemi sırasında kontrol edilmelidir. Son olarak, kabarcıkları önlemek ve oluşması halinde, bunları çıkarmak için önemlidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5. 8 kanallı pipet transfer çip A1 tarafındaki (sol taraf) 96 oyuklu deney plakası 5 ul kullanılması. Şekil 4'te gösterildiği gibi, çip sol tarafını doldurun. hep ipuçları içine aynı hacimde çizmek için dikkatli olun.
   1. kabarcıklar oluşturmak etmeyin. kabarcıklar belirirse, 10 ul ipuçlarını kullanarak bunları kaldırın. çip her bir kuyunun değiştirme ipuçları.
6. Sağ taraftaki o adımı yineleyin 7.596-iyi örnek plaka 5 ul kullanarak f çip.
7. çipin alttan mavi filmi çıkarın. IFC denetleyicisi içine çip yükleyin. IFC denetleyici ekranında, "Run Script" ve ardından "RUN." mikroakışkan hatlarının yükleme 45 dakika sürer.
8. çip çıkarın ve çip altındaki mavi filmi yeniden mühür.

8. Çalışma Chip

1. mikroakışkan qPCR bilgisayarda, "Veri Toplama" yazılımı seçin. Başladıktan sonra, "Yeni Çalıştır" ı seçin.
2. Seç "Çıkar," çip altındaki mavi filmi çıkarın ve çip yükleyin. Soldaki ve deneyci doğru iyi A1 almak için çip yerleştirin.
3. On "Proje ayarı", "Hiçbiri" ve ardından "İleri."
4. "Yeni çip run", "Yeni yonga dizin" (deney için bir klasör oluşturun) ve "İleri seçin."
5. "Gen ifadesi" On "seçeneğiniPasif referans = ROX "(karboksi-x-rodamin) ve" Tek prob; "astar göre doğru filtreyi seçin seçin." Next ".
6. Seç "Gözat" ve kullanılan primerler göre doğru programı seçin.
   NOT: "Varsayılan-10dk-Hotstart.pcl" tek hücreli çoklu RT-qPCR için en sık kullanılan programdır.
7. "Başlat Çalıştır" ı seçin. Reaksiyon yaklaşık 90 dakika sürer.
8. Bir kez seçin bitmiş "Çıkar-Bitti."

9. Veri analizi

1. "Aç" "Dosya" ve seçin "Real-Time PCR Analizi" yazılımını açın deneme klasörünü bulun ve seçin "ChipRun.bml dosyasını."
2. "Analiz View," "Sonuçlar Tablo" ve "Isı Harita Görünümü üzerine tıklayın;" "X" ile işaretlenmiş kutular eşik algılama seviyesinin altında ve / veya kötü amplifikasyon eğrileri vardı.
3. örnekleri adlandırın. "Örnek Setup" ve sel gitvb "Yeni SBS 96." "Mapping" üzerine tıklayın ve "..." Kopyala ve elektronik tablo yazılımı örnek düzeni tasarımı yapıştırın. olarak yapıştırılan düzenini tanımlamak "Örnek Adı."
4. tahlilleri adlandırın. Adımı tekrarlayın astar isimleri ile 9.3 "Dedektör Kur." olarak yapıştırılan düzenini tanımlamak "Dedektör Adı."
5. "Analiz görünümü" ve "Analiz;" Numune ve astar isimleri örnekleri ve primerler (Şekil 7) otomatik olarak ilişkilendirilir.
6. Ct, Delta Ct hesaplayın ve her numune için Değiştir katlayın. Bir iç kontrol (burada, GAPDH) gibi bir temizlik geni kullanın:
   ACt = Ct _örnek - Ct _{iç kontrol}
   ^{(ΔCtsample-ΔCtnegative kontrolü) -} Değişim = 2 Fold
   1. "Dedektör Setup" seçeneğini tıklayın ve hiçbir giriş kontrolü ile kuyu seçin (gen ifadesini normalleştirmek için bir iç kontrol olarak temizlik geni kullanın). Seç "Editor "," başvuru tanımlamak, "ve" Update ".
   2. yukarıda tanımlanan iç kontrol uygulanacağı tüm kuyu seçin. "Testi olarak tanımlar." "Editör" i seçin ve Uygun bir referans geni seçin ve tıklayın "Update."
   3. iyi negatif kontrol seçmek için "örnek Setup" seçeneğini seçin. "Editör" seçiniz ve tanımlamak "Reference." "Update" i tıklayın.
   4. "Analiz", "Analiz Görünüm" seçin ve Delta Ct ve Katlama Değişim otomatik olarak hesaplanacaktır.
7. veri verir. Tablo Sonuçlar "olarak kaydetmek, Export" "Dosya" ve "hedef klasörü seçin, ve vurmak" Kaydet "ve" Çıkış. "
8. Adımı tekrarlayın 9.7, ancak bunun yerine olarak kaydetmek "Masa Sonuçları" in "HeatMap Sonuçları."

Results

Lenfoid popülasyonları gen ekspresyonunda büyük bir çeşitlilik gösterir. Bu protokol, karaciğer LAK bölmesi heterojenite tek hücreli çoklu RT-qPCR gen ekspresyonunu kullanılarak araştırılmıştır. Diğer gen sentezleme tekniklerinin aksine, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR gen ekspresyonu, aynı zamanda, daha nadir, birkaç popülasyonda ilgili bir çalışma sağlar. klonal düzeyde yüksek hassasiyet ile birleştiğinde Bu özgüllük, bir popülasyon içindeki gen imzaları farklılıkların incelenmesi için v...

Discussion

Bu protokol klonal düzeyde ayrıntılı gen ifadesi bilgilerini nasıl elde edileceği anlatılır. Burada, karaciğer LAK bölme heterojenite araştırdık. (Yaygın olarak dile LAK yüzey belirteçleri göre) farklı LAK popülasyonlarının tek hücreli sıralama sonra, numuneler belirli önceden seçilen genler için önceden çoğaltılmıştır. Daha sonra elde edilen cDNA'sı ve primerler A çoklu RT-qPCR mikroakışkan çip üzerine yüklendi. Son olarak, 48 tek hücre 48 farklı gen ekspresyonunu elde etti. Gen ifadesi sonuçları gen imzası ve hücr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hücreler Doğrudan Bir Adım qRT-PCR kiti	Uygulamalı Biyosistemler	11753100	Primer prob algılama kiti. 2x reaksiyon karışımı, SSIII Platinium enzimi içerir.
Düşük TE EDTA Tamponu	Affymetrix	75793 100ML
96 oyuklu plakalar	Thermofisher Scientific	AB 1100	Hücre sıralama ve termosiklasyon için uyarlanmış 96 oyuklu plakalar
Kapak filmi	Dominique Dutscher	106570	alüminyum kapak filmi; kirlenmeyi ve buharlaşmayı önleyin
Actb	Thermofisher Scientific	Mm00607939_s1	20x astar
Aes	Thermofisher Scientific	Mm01148854_s1	20x astar
Ahr	Thermofisher Scientific	Mm00478932_s1	20x astar
Bcl2	Thermofisher Scientific	Mm00477631_s1	20x astar
c-myc	Thermofisher Scientific	Mm00487804_s1	20x astar
Cbfb	Thermofisher Scientific	Mm01251026_s1	20x astar
Cd27	Thermofisher Scientific	Mm01185212_s1	20x astar
Cd49a	Thermofisher Scientific	Mm01306375_s1	20x astar
CD49b	Thermofisher Scientific	Mm00434371_s1	20x astar
Cxcr5	Thermofisher Scientific	Mm00432086_s1	20x astar
Cxcr6	Thermofisher Bilimsel	Mm02620517_s1	20x astar
Eomes	Thermofisher Scientific	Mm01351985_s1	20x astar
Ets1	Thermofisher Scientific	Mm01175819_s1	20x astar
Foxo1	Thermofisher Scientific	Mm00490672_s1	20x astar
Gapdh	Thermofisher Scientific	Mm03302249_s1	20x astar
Gata3	Thermofisher Scientific	Mm00484683_s1	20x astar
Gm-csf	Thermofisher Scientific	Mm01136644_s1	20x astar
Hes1	Thermofisher Scientific	Mm01342805_s1	20x astar
Hprt	Thermofisher Scientific	Mm00446968_s1	20x astar
Id2	Thermofisher Scientific	Mm01293217_s1	20x astar
Il-12rb2	Thermofisher Scientific	Mm00711781_s1	20x astar
Il-18r1	Thermofisher Scientific	Mm00515178_s1	20x astar
Il-1rl1	Thermofisher Scientific	Mm00434237_s1	20x astar
Il-22	Thermofisher Scientific	Mm001226722_s1	20x astar
Il-23r	Thermofisher Scientific	Mm00519943_s1	20x astar
Il-2ra	Thermofisher Scientific	Mm01340213_s1	20x astar
Il-2rb	Thermofisher Scientific	Mm01195267_s1	20x astar
IL-7r	Thermofisher Scientific	Mm00434295_s1	20x astar
Klr5	Thermofisher Scientific	Mm04207528_s1	20x astar
Lef1	Thermofisher Bilimsel	Mm00550265_s1	20x astar
Ncr1	Thermofisher Scientific	Mm01337324_s1	20x astar
Nfil3	Thermofisher Scientific	Mm01339838_s1	20x astar
Çentik1	Thermofisher Bilimsel	Mm00435249_s1	20x astar
Çentik2	Thermofisher Bilimsel	Mm00803069_s1	20x astar
Rora	Thermofisher Bilimsel	Mm01173766_s1	20x astar
Rorc	Thermofisher Scientific	Mm01261022_s1	20x astar
Runx3	Thermofisher Scientific	Mm00490666_s1	20x astar
Tbx21	Thermofisher Scientific	Mm01299453_s1	20x astar
Tcf3	Thermofisher Scientific	Mm01175588_s1	20x astar
Tcf7	Thermofisher Scientific	Mm00493445_s1	20x astar
Tle1	Thermofisher Scientific	Mm00495643_s1	20x astar
Tle3	Thermofisher Scientific	Mm00437097_s1	20x astar
Tsc22d3	Thermofisher Scientific	Mm01306210_s1	20x astar
Tnfrsf11a	Thermofisher Scientific	Mm00437132_s1	20x astar
Tox	Thermofisher Scientific	Mm00455231_s1	20x astar
Zbtb16	Thermofisher Scientific	Mm01176868_s1	20x astar
Zbtb7b	Thermofisher Scientific	Mm00784709_s1	20x astar
qPCR Master karışımı	Applied BioSystems	P/N 4304437
2x Test Yükleme Reaktifi	Fluidigm	P/N 85000736	Multipleks RT-qPCR mikroakışkan çipinde tahlilleri yüklemek için özgül yoğunluklu ortam.
2x Numune Yükleme Reaktifi	Fluidigm	P/N 85000735	Numuneleri multipleks RT-qPCR mikroakışkan çipe yüklemek için özgül yoğunluklu ortam.
48.48 mutliplex RT qPCR mikroakışkan çip	Fluidigm	BMK-M-48.48	48.48 Gen İfadesi için Dinamik Dizi IFC; tek hücreli multipleks RT-qPCR reaksiyonu için çip
48.48 mutliplex RT qPCR mikroakışkan çip kontrolörü	Fluidigm 89000020		48.48 IFC Kontrol Cihazı; çip dahili akışkan sistemini kontrol edin, numuneleri ve tahlilleri reaksiyon odalarına yükleyin
mutliplex RT qPCR mikroakışkan termodöngüleyici	Fluidigm	GE48.48	48.48 Dinamik Dizi IFC termodöngüleyici
96 kuyulu plakalar	Thermofisher Scientific	AB 1100	Hücre ayırma ve termosiklasyon için uyarlanmış 96 oyuklu plakalar
C57Bl/6 fareler	Janvier	C57Bl/6 miceJ@RJ
10 ml şırınga	BD Biosciences	309639
PBS	Life Technologies	14040174
HBSS	Life Technologies	24020133
RPMI	Life Technologies	61870044
FCS	CVFSVF000U	Eurobio Abcys	Standart fetal buzağı serumu
Potter tüpü	N/A
15 ml tüp	Corning	352097
1.5 ml tüp	Sigma-Aldrich	T9661-1000EA
FACS makinesi	N/A
santrifüj	Thermofisher Scientific	75004538
1.000 & mikro; l ipuçları	Fisher Scientific	10313272
P1000	Gilson	F123602
Percoll	Dominique Dutscher	17-0891-01
Facs tüp	Falcon	352235
anti-CD8 Biotin fare antikoru	Sony	1103520	soy antikoru anti-CD19
Biotin fare antikoru	Sony	1177520	soy antikoru anti-TCRab
Biotin fare antikoru	BioLegend	109204	soy antikoru
anti-TCRgd Biotin fare antikoru	BD Biosciences	553176	soy antikoru
anti-Ter119 Biotin fare antikoru	BD Biosciences	553672	soy antikoru anti-Gr1
Biotin fare antikoru	BD Biosciences	553125	soy antikoru
PerCPCy5.5 fare antikoru	BioLegend	109828
anti-IL7ra PeCy7 fare antikoru	ebioSciences	25-1271-82
anti-CD3 BV510 fare antikoru	BD Biosciences	563024
anti-CD4 BV786 fare antikoru	BD Biosciences	563727
anti-NKp46 PE fare antikoru	ebioSciences	12-3351-82
Streptavidin	Sony	2626025
Propidium İyodür	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Elektronik pipet	Eppendorf	4986000017
Combitips 0.1 ml	Eppendorf	30089405
Çok Kanallı pipet	Rainin	L8-10XLS+
Accudrop	BD Biosciences	FACS	için 345249 doğrulama boncukları