Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Summary

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Abstract

Elektroforetik hareket kayma deneyleri (EMSA) proteinler ve hedef DNA dizileri arasındaki etkileşimi karakterize eden bir aracı bir araçtır. Radyoaktivite EMSA DNA etiketleme baskın yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar ve tarama yöntemleri son gelişmeler, zaman tasarrufu maliyetini azaltarak ve güvenliğini geliştirmek, kolay kullanım avantajları için radyoaktivite alternatif olarak DNA floresan etiketleme kullanımı teşvik etmiştir. Biz son zamanlarda başarıyla önemli bir biyolojik soruyu ele almak için floresan EMSA (FEMSA) kullandık. Bizim FEMSA analizi yüksek derecede korunmuş HMG transkripsiyon faktörü SOX-2 koku nöron tipi çeşitlendirilmesi üzerinde, bir missense mutasyon, G73E yürürlüğe mekanik görmemizi sağlar. Mutantını SOX-2 ^G73E proteini ve böylece koku nöron kimlik dönüşümü neden spesifik DNA bağlanma aktivitesi değiştirir bulundu. Burada, mevcut olan bir iyileştirilmiş ve adım adım protokolü maliyetliFEMSA biyolojik örnek olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ve saflaştırılmış SOX-2 proteinleri (WT ve mutant SOX-2 ^G73E proteinler) içeren kızıl ötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak.

Introduction

EMSA ilgi konusu bir protein ve protein ¹ potansiyel hedef sitesi ihtiva eden bir işaretli DNA sondası bir karışımını çözmek için yerel poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanılarak DNA ve protein arasındaki etkileşimi analiz etmek için kullanılır. protein ile bağlı bir DNA probu yavaş serbest DNA probu ile karşılaştırılır ve bir poliakrilamit matris boyunca, geçiş nedenle geciktirilir değiştirecektir. ³² P DNA Radyo-etiketlenmesi EMSA tespiti için baskın bir yöntem olmuştur. biyokimyasal araştırmalarda radyo sınıflandırılmasıyla uygulama yararlı olmasına rağmen, benzer hassasiyetle alternatif DNA etiketleme yöntemleri nedeniyle radyoaktiv....

Protocol

Not: fosforla etiketlenmiş DNA sondaları veya işaretlenmiş DNA diğer formları kullanarak EMSA protein ya da hücre özü hazırlanması, protein-DNA bağlanma reaksiyonu ve PAGE jel hazırlanmasında ve yürütülmesinde (Şekil 1A) için aynı protokol paylaşır. önemli farklılıklar DNA etiketleme prosedürleri, post-run jel işleme aşamaları ve algılama yöntemleridir.

1. Jel Hazırlanması

1. mini protein jel sistemi (8.3 cm genişlik x 7.3 cm uzunluk x 0.75 mm kalınlık) kullanılarak, 0.5x TBE (45 mM Tris-Borate, 1mM EDTA) ve% 2.5 gliserol içeren% 5 yerli poliakrilamid jel hazırlayın.
   1. Akrilamid / Bis 4 jeller için jel çözeltisi, 30 mL hazırlan....

Results

Portakal Rengi G yükleme boyası (6x 100 mL% 30 gliserol içinde 0.12 g turuncu G) Electrophoresis ilerlemesini görselleştirmek için yükleme öncesi bağlanma reaksiyona ilave edilebilir. Bromofenol mavisi gibi diğer yükleme boyalar tarama sırasında tespit edilir ve bu nedenle görüntü analizi (Şekil 1B) müdahale edilir.

EMSA Bazı durumlarda, nükleer ekstre hazırlanması kullanılan, özellikle, poli deoxyinosinic-deo.......

Discussion

fEMSAs protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır ve DNA radyoaktif etiketleme bir alternatiftir. kızıl ötesi boyalar gibi floresan boyalar ticari olarak temin edilebilir, ve radyoaktif bir DNA etiketleme kıyasla çevre dostu daha güvenli ve daha yöntem sağlar. Kızılötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak EMSA postrun jel işleme adımlar gerektirir ve bu nedenle diğer DNA etiketleme teknikleri ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet tasarrufu yoktur. Zaman radyoaktif EMSA ile bant.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
% 30 Akrilamid / Bis Çözeltisi, 37.5: 1	Bio-Rad	1610158	Akrilamid zararlı ve toksiktir.
6x-HIS Epitop Tag Antikoru (HIS. H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antikoru	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Sığır Serumu Albümini (BSA) moleküler biyoloji sınıfı	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700 etiketli DNA Oligoları	Entegre DNA Teknolojileri	Özel DNA oligosu	Bunlar, el yazmasında "5'Boya etiketli veya kızılötesi floresan boya etiketli DNA oligoları" olarak anılmaktadır. Şirket, 5' IRDye etiketli DNA oligonükleotidlerini özel olarak sentezleyecek. Minimum gerektirir 100  μ M ölçeği sentezi ve HPLC saflaştırması.
Klenow Parçası (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  Dikey Elektroforez Hücresi	Bio-Rad	1658000FC	Bu, el yazmasında 'mini protein jel sistemi' olarak adlandırılmaktadır. Herhangi bir elektroforetik sistem, boyutu 25 cm x 25 cm'den küçük şeffaf cam plakalar olduğu sürece kullanılabilir.
Odyssey CLx Kızılötesi Görüntüleme Sistemi	LI-COR Biyoteknoloji	Odyssey CLx Kızılötesi Görüntüleme Sistemi	Bu, el yazmasında 'gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi' olarak anılmaktadır.
Odyssey Fc Görüntüleme Sistemi	LI-COR	Biotechnology Odyssey Fc Çift Modlu Görüntüleme Sistemi	Bu, el yazmasında 'öncelikle Batı lekeleri için yakın kızılötesi floresan görüntüleme sistemi' olarak anılmaktadır.
Image Studio yazılımı (sürüm 4.0)	LI-COR Biyoteknoloji	Image Studio yazılımı	Bu, el yazmasında 'özel bir görüntüleme yazılımı' olarak anılmaktadır.
Turuncu G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Turuncu yükleme boyası			% 0.25 Turuncu G; % 30 Gliserol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borat; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Bağlayıcı Tampon			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μ g/mL BSA