Method Article

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

DOI:

10.3791/54886

⸱

January 6th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük sarmal bobin alanlarının karakterizasyonuna ve kristalizasyonuna rehberlik etmek için basit biyokimyasal ve hesaplamalı analizi içeren bir çerçeve tanımlıyoruz. Bu çerçeve, küresel proteinler için uyarlanabilir veya çeşitli yüksek verimli teknikleri içerecek şekilde genişletilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapı tayini için kristaller elde etmek, herhangi bir protein için zor ve zaman alıcı bir öneri olabilir. Sarmal bobin proteinleri ve alanları doğada bulunur, ancak fiziksel özellikleri ve toplanma eğilimleri nedeniyle, geleneksel olarak kristalleşmelerinin özellikle zor olduğu görülür. Burada, belirli bir sarmal bobin proteini için bir dizi olası alan sınırını tanımlamak için tasarlanmış çeşitli hızlı ve basit teknikler kullanıyoruz ve daha sonra bu proteinlerin çözelti içindeki davranışını hızlı bir şekilde karakterize ediyoruz. Güçlü bir floresan etiketinin (mRuby2) eklenmesiyle, protein karakterizasyonu basit ve anlaşılırdır. Hedef protein, normal aydınlatma altında kolayca görselleştirilebilir ve uygun bir görüntüleyici kullanılarak ölçülebilir. Amaç, başarılı olma olasılıkları düşük olduğu için kristalizasyon hattından çıkarılabilecek adayları hızlı bir şekilde belirlemek, en iyi adaylar için daha fazla zaman sağlamak ve kristal üretmeyen proteinlere daha az fon harcanmasını sağlamaktır. Bu proses, ilk tarama çabalarından elde edilen bilgileri içerecek şekilde yinelenebilir, yüksek verimli ekspresyon ve saflaştırma prosedürleri için uyarlanabilir ve kristalizasyon için robotik tarama ile artırılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X-ışını kristalografisi yoluyla yapı tayini modern biyolojinin her alanda temel katkılarda bulunmuştur; yaşamı destekleyen ve çeşitli bağlamlarda birbirleriyle nasıl etkileşimde makromoleküllerin bir atom bir görünüm sağlayan; Hastalık ve sağlayan fırsatlar rasyonel hastalığı tedavi etmek için ilaçlar tasarlamaya neden mekanizmaları anlamak için bize izin. Kristalografi uzun makromoleküler yapısını belirlemek için baskın deneysel teknik olmuştur ve şu anda yapısal veritabanı (www.rcsb.org) içinde% 89.3 hesapları vardır. Bu teknik çok yüksek çözünürlükte potansiyeli dahil olmak üzere birçok avantajı vardır, bir boyutlarda geniş, nispeten kolay veri toplama ve makromolekül çözücü yanı sıra ligandlar nasıl etkileşimde görselleştirmek için fırsat makromolekülleri görselleştirmek için yeteneği.

Rekombinant protein ifadesi 1,2, pur sayısız teknolojik gelişmelere rağmenification 3 ve bu sistemleri 4, kristalografik süreçte tek en büyük engel oluşturmak için kullanılan moleküler biyoloji kırınım kaliteli kristaller büyümeye yeteneği kalır. Bu büyük sarmal-coil etki içermeyen protein için özellikle doğrudur olmuştur. Tüm amino asitler kadar 5%, bu çok ortak yapısal özelliği 7 hale sarılmış bobinler 5,6 içinde bulunan olduğu tahmin, ancak bu proteinler çoğu zaman arındırmak ve küresel proteinlerin 8-10 den kristalize etmek daha zordur edilmiştir . Bu ayrıca sarılmış bobin etki genellikle bu nedenle doğru sık kristalleşme için zararlı olduğunu yapılandırılmamış veya esnek dizisinin oluşumunu önlemek için önemlidir bu alanların sınırlarını tahmin, daha büyük bir proteinin kapsamında bulunduğu gerçeğine ile birleşir.

Burada birleştiren kavramsal bir çerçeve sunmak web tabanlı hesaplama experimenta analizleryapısal çalışmalar ve nasıl hazırlamak ve kristalleşme girişimleri öncesinde protein örneklerinin karakterize etmek için protein parçası (ler) nasıl seçileceğini: tezgah l veri kristalografik sürecinin ilk aşamalarında dahil yoluyla kılavuz kullanıcılara yardımcı olmak için. Biz büyük sarmal-coil alanlarını içeren iki protein üzerinde analizimizi odaklanmak, Shroom (SHRM) ve Rho-kinaz (Rock). Her ikisi de halkalaştırılmış halka alanları içerir ve biyolojik olarak alakalı kompleks 11-16 oluşturulması için bilinen bu proteinleri seçilmiştir. Shroom ve Rho-kinaz (Rock), sırasıyla sarılmış-bobinin ~ 200 ve 680 artıkları tahmin edilen, çok sayıda kısımları, yapısal olarak 17-20 karakterize edilmiştir. Burada tarif edilen yöntem, hızlı bir şekilde kristalleşme için müsait olacak halkalı-halka ihtiva eden protein parçalarını tanımlamak için bir iş akışı sağlanmakta, ancak tarif edilen teknikler kolayca en protein veya protein-kompleksleri için uyarlanmış veya yüksek verimli arayışlara dahil etmek üzere modifiye edilebilirches olarak kullanılabilir. Son olarak, bu yöntemler, pahalı olmayan ve hemen hemen tüm seviyeden kullanıcılar tarafından gerçekleştirilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: kavramsal çerçeve ya da iş akışı şeması başvuru için Şekil 1'de açıklanmıştır. hesaplamalı veya sıra tabanlı tahminler, protein ekspresyonu ve saflaştırılması, biyokimyasal karakterizasyonu ve kristalleşme: protokol dört aşamaya bölünebilir. gösterilen örnekler Shroom SD2 etki ve / veya Shroom-kaya kompleksleri analizi, ancak herhangi bir protein ile kullanılabilir.

1. Kullanım Coiled-bobin Alan Sınırları Hesaplamalı Tahminleri oluşturmak için Web tabanlı Araçlar kurulan

  1. Dizi homologları bir Evrimsel Farklı Set toplayın.
    1. www.uniprot.org gidin ve üst arama çubuğuna Shroom yazın.
    2. Seç dizileri yanında onların katılım numarasına kutuyu işaretleyerek indirmek için. yıldızla Diziler UniProt tarafından gözden dizileri gösterir ve genellikle daha güvenilirdir. tüm diziler tam ve doğru olmasını sağlamak için özen gösterin.
    3. Seçilen s kaydetYükle düğmesini tıklayarak equences.
    4. Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) kullanarak Shroom dizilerinin koleksiyonu aynı hizaya getirin. Gönder itme sonra Shroom dizileri ile dosyayı seçmek için "Browse" düğmesini tıklayın ve.
    5. Hizalama işlemi tamamlandıktan sonra, "Hizalama İndir Dosya" düğmesini tıklayın.
    6. (Dosyadan | | Giriş Hizalama Dosyası) Jalview kullanarak 1.1.5 oluşturulan çoklu dizi hizalama açın. (| Yüzde Kimlik Color) kimliği ile yeni hizalama penceresinin, renk içinde.
  2. İkincil yapının tahminler, esnek veya düzensiz dizinin tahminler hesaplayın ve ilgi protein (ler) içinde sarmal-bobin bölgelerini öngördü.
    1. Spiral-Coil tahminler hesaplamak için, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj gidin. Kopyala ve Dizi Kutusuna dizisi yapıştırın ve Gönder'i tıklayın.
      NOT: Bu analiz kompozisyonu birkaç saat sürebilirlete. Shroom sekansları oldukça büyük olduğundan, sekanslar, web sunucusu boyutu kısıtlama uyacak şekilde en az 1000 amino asit bloklar halinde bölünmüş gerekebilir. Shrm2 analiz ederken, bu bölüm, sargılı-sargı bölgesi içerdiği bilinmektedir SHRM SD2 alanını ihtiva 1.000 C-terminal amino asitler kullanılır önerilir. Diğer proteinler ile bu analizi tekrar, mümkün tam boyda bir protein dizilerini kullanmak tavsiye edilir. Bu bir seçenek değilse, bilinen biyokimyasal veya fonksiyonel verilere dayalı diziyi mümkün olan en büyük parçasını kullanabilir veya teşrih.
    2. Spiral-Coil tahminler hesaplamak için, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj gidin. Kopyala ve Dizi Kutusuna dizisi yapıştırın ve Gönder'i tıklayın.
  3. Shroom dizisinin tek bir kapsamlı açıklama içine 1.2.2 adımlar 1.1 sonuçlarını birleştirin.
    NOT: son derece de her türlü ilgili i içerecek şekilde teşvik edilmektedirbelirtilen bilgi Literatürde da bu aşamada, protein işlevi veya saflaştırma ile ilgili diğer kaynaklardan çıkarılabilir.
  4. Bu kapsamlı açıklamalı dizisi kullanarak, koruma maksimize etmek için çalışıyoruz, protein alan sınırları (ya da olası sınırları bir dizi) tahmin ve düzensiz veya esnek dizisinin miktarını en aza indirerek yapısal özelliklerini öngördü. Eğer biliniyorsa, oluşan protein ilgi fonksiyonel özelliklerini muhafaza edilmelidir.

Bölüm 1'de Tanımlanan Alan Sınırları 2. Express ve Arındırmak Proteinler

NOT: Bu bölümün amacı, Bölüm 1'de oluşturulan hipotetik etki sınırlarını ekrana hızlı ve kolay bir şekilde ölçülebilir deneyleri bir dizi kullanmaktır.

  1. Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, His 10 -mRuby2-XH2 plazmid olan çerçeve istenen kodlama dizisinin bir sentezleme plazmidi üretmek (vektör haritası, için Şekil 3'e bakınıznd ek ayrıntılar).
  2. 18-24 saat boyunca oda sıcaklığında autoinduction ortam 1 BL21 (DE3), E. coli ya da başka uygun bir ifade suşu kullanılarak her bir ifade plazmidi için test ekspresyon seviyeleri.
    1. örneğin burada bir (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial gibi hücreler ile birlikte ya da sağlam bir transformasyon protokolü kullanılarak talimatlar aşağıdaki sentezleme plasmidleri ve BL21 (DE3) içine boş plazmid kontrol Dönüşümü -Dönüşüm /).
    2. Taze dönüştürülmüş plaktan, tek bir koloni almak ve 34 ug / ml kanamisin ile gece boyunca lizojeni Broth'ta 37 ° C (LB) ortamı bir 5 mi Başlangıç ​​kültürünün yetiştirilmesi.
    3. Ertesi gün, kültür pelet ve taze LB ile pelet yıkayın
    4. 34 ug / ml kanamisin ile autoinduction ortam, 50 ml başlatıcı kültürün ekleyin. Kültür oda sıcaklığında ya da 37 ° C'de, ya da doygunluk büyümeye olanak sağlar. Tipik olarak, 18-24 saat ~ için büyür.
    5. Pelet hücresis ve saflaştırmaya süresiz önce -80 ° C 'de elde edilen hücre pelletleri dondurma.
    6. en verimli istenen füzyon proteinini üreten soy belirlemek için her sentezleme gerilme ve SDS-PAGE ile, boş vektör kontrol alınmış bütün hücre özütleri karşılaştır. Onun 10 -mRuby2-Shroom SD2 füzyon proteinleri için, 50 dakika ~ ya da boya cephesinin, jel 22 alt ulaşıncaya kadar 180 V,% 10 SDS-PAGE jellerinin çalıştırın.
    7. Coomassie Mavisi ile Leke jel her bir suş 23 içinde toplam hücresel protein görselleştirmek için.
  3. başarılı bir şekilde mRuby2-füzyon proteinini ifade her bir suş ile ilgili bir ilk afinite kromatografi aşamasında gerçekleştirin. Tipik haliyle, protein, 4 ° C de saflaştırma gibi değişen koşullara yararlanacaktır sürece saflaştırma, oda sıcaklığında 2.3.2-2.3.7 adımları gerçekleştirmek.
    1. Aşama 2.2.5 gelen çözülme hücre topakları.
    2. liziz tamponu (% 10 gliserol, 500 mM NaCI, 40, 1.5 ml, her hücre pelletinimM imidazol, 20 mM Tris pH 8.0, 1 mM p-merkaptoetanol). uygun protez önleyicileri ile liziz tamponu Ek.
    3. 10 mg / ml lizozim, 30 ul ilave edin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. enstrüman için yönergeleri izleyerek sonikasyon kullanılır.
    4. çözünmeyen materyal ya da çözünen hücreler pelet 14,000 x g'de 30 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içinde 1.5 ml tüp ve santrifüj içine aktarın. SDS-PAGE yoluyla sonraki analiz için supernatant ve pelet hem kaydedin.
    5. Ni-NTA boncuk 100 uL eriyebilir kısma kuluçkalanması, nikel afinite saflaştırma gerçekleştirmek. boncuk karıştırmak için birkaç kez ters yüz, 5-10 dakika boyunca Çözünür lizat boncuk inkübe edin.
    6. boncuk pelet bir masaüstü santrifüj 30 saniye boyunca 800 x g'de santrifüjleyin. non-spesifik kirleticiler temizlemek için lizis tamponu ile pelet 3-5 kez yıkayarak bu izleyin.
    7. liziz tamponu ile boncuk elute Ruby füzyon proteini 1 ile desteklenmişM imidazol.
    8. Yukarıda "hızlı ve kirli" saflaştırma His-mRuby2-Shroom proteinlerinin davranışını karşılaştırmak için SDS-PAGE kullanın.

3. karakterize Protein Numune Avantajlı özellikleri olanlar tanımak

  1. Yakut füzyon proteini konsantrasyonunu ölçmek ve sonra da ana PAGE jeli 24 üzerinde füzyon proteininin 1-5 ug yükleme numunenin homojenliğini değerlendirmek için 280 nm'de bir spektrofotometre seti kullanın. 175 V 140 dakika boyunca, 4 ° C'de,% 10 yerel PAGE jel üzerinde çalıştırıldı
    1. Görüntü mruby-etiketli füzyon bu testte göç nerede gözlemleyerek, floresan görselleştirmek için donanımlı bir görüntüleyici kullanarak yerel SAYFA.
      NOT: Bu proteinin muhtemelen toplandığında sıra kalmış füzyon proteini gözlemlemek için dikkatli olun. Bir floresan görüntüleme mevcut değilse, bir çoğu görselleştirmek ve Ruby görüntü konsantre örnekleri siyah ışık altında ya da bir UV ışık kutusu ile protein etiketledi.
  2. stabil katlanmış etki tespit etmek sınırlı proteoliz gerçekleştirin. % 0.025 subtilisin A. 5 ul / ~ 1 mg ml Ruby-SHRM SD2 füzyon 95 ul inkübe
    1. zaman noktalarında reaksiyonu Örnek 0, 0.5, 2, 5, 15, 60 ve 120 dakika sonra, her bir zaman noktası için reaksiyonundan 10 ul çıkarılması ve% 15 akrilamid jel kullanılarak, SDS-PAGE yoluyla tepkimenin ilerleyişinin görüntülenmesi .
    2. Adım 2.2.7 olarak Coomassie Mavisi ile leke ve bir proteaz dirençli türler tespit edilebilir olup olmadığını değerlendirir.
  3. çözelti, bu proteinlerin genel davranışı hakkında kapsamlı bir değerlendirme olarak, kısmen saflaştırılmış mRuby2-Shroom füzyon proteinlerinin üzerinde saflaştırma verimi, davranış yerel PAGE ve sınırlı proteoliz veri entegre.
    1. Uygun fonksiyonel tahlil varsa (İsteğe bağlı), bu noktada etkinlik için kontrol edin.

4. Coiled-coil SD2 Yüksek Kalite Kristaller ÜretenShroom Etki Alanı

Not: Protein, genellikle farklı sıcaklıkta saflaştırma 4 ° C yararlanacak sürece bölüm 4.1 içinde Bütün aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

  1. İfade ve saflaştırma potansiyeli kaba bir tahmin olarak 50 mi büyümeleri kullanarak, tamamen saflaştırılmış örnek 5-20 mg elde etme amacı ile mRuby2-Shroom SD2 büyük ölçekli ifadeleri gerçekleştirin. Tipik olarak kültür 2L yeterli başlangıç ​​malzemesi sağlar. 10 dakika için 8000 x g'de santrifüjleme ile büyüme pelet sonra hücreler.
    1. liziz için lizozim kullanılarak donmuş hücre peleti gramı başına liziz ~ 2 ml kullanılarak, daha önce parçalama tamponu içinde 2 L büyüme pelletini. Alternatif olarak, ~ 8 ml / g pelet de tekrar süspansiyon bir homojenleştirici veya Fransızca basın kullanarak eğer. 30 dakika süre ile 30,000 x g'de santrifüj ile hücre yıkıntıları pelet haline.
    2. Toplu Ni-NTA reçinesi 10 ml kullanılarak 4.1.1 çözünür fraksiyonu bağlanır. Uygun yerçekimi sütunu içine dökünve ilişkisiz proteinler boşalmasını sağlayın.
    3. Yıkama, 1 M NaCl ilave lizis tamponu ile yıkama, ardından liziz tamponu, 40 ml ile 3-5 kez reçine.
    4. 80 mM imidazol ile takviye liziz tamponu, 40 ml ile yıkayın reçinesi.
    5. 1 M imidazol ilave lizis tamponu 40 ml Ruby Shroom füzyon proteinini ayrıştırmak. El 4-10 ml'lik kısımlar halinde elüt protein fraksiyonlanması.
    6. % 10 SDS-PAGE kullanılarak Ruby-Shroom füzyon proteinini ihtiva eden fraksiyonlar teyit edin.
    7. % 8 gliserol, 250 mM NaCI, 15 mM imidazol, 20 mM Tris pH 8.0 içinde (tipik olarak 2-4 kısım), uygun fraksiyonlar Dialyze, 1 mM β-ME 6-8 kDa'lık bir MWCO diyaliz tüpü kullanılarak. Füzyon proteininin her 25-50 mg TEV proteaz 1 mg ekleyin. Yavaş karıştırma ile gece boyunca oda sıcaklığında dialyze.
    8. Tekrarlama nikel yakınlık arıtma 4.1.2 adımları. 4.1.6 için. Onun 10 -mRuby2 bağlı kalır iken Shroom SD2 alanı artık ilişkisiz fraksiyon kalmalıdırReçine ve elüsyon fraksiyonlarında bulunur. Coomassie Mavisi ile bu kullanarak% 12 SDS-PAGE boyama onaylayın.
    9. % 8 gliserol, 100 mM NaCl, 5 mM p-merkaptoetanol tamponu, gece boyunca 20 mM Tris, pH 8.0 içine Shroom SD2 domenini ihtiva eden fraksiyonlar dialyze.
    10. Bir FPLC kullanılması ile anyon değişim kromatografisi 25 gerçekleştirin ve 0.1-1.0 M NaCI bir NaCI gradyanı ile elüt edilerek kromatograflanmıştır. % 12 SDS-PAGE kullanılarak kesirler analiz edin.
    11. Bir spin konsantratör (10. kDa'lık bir MWCO veya daha proteini çalışılan bağlı olarak),% 12 SDS-PAGE ile zirve fraksiyonları analiz ~ 0 mg / ml, ve daha sonra, boyut dışlama kromatografisi 26 gerçekleştirmek için pik fraksiyonlar konsantre edilir.
    12. Havuz tepe fraksiyonları ve 20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCI,% 2 gliserol içine diyaliz 1 mM β-ME ve / ml kristalleştirmeden önce 10 mg konsantre edilir.
      İsteğe bağlı: Bu adımda, bir konsantrasyonda 5 ul numune kaldırma 1, 2, 5, ve 10 mg / ml lik bir numuneyi konsantre sırasında.Bu adım sırasında, örneğin davranış bakmak her numunenin bir nativ PAGE yükleme 2-5 ul çalıştırın.
  2. kristallendirme çalışmalarında için en uygun protein konsantrasyonunun tespit etmek 12 koşulları küçük dizisi taramasında. Bu koşulların bileşim olup, Şekil 7'de tarif edilmektedir.
    1. Buhar difüzyon yönteminde, pipetleme ile kristalizasyon denemeler gerçekleştirmek 24-çukurlu, kuluçka süresi, damla kristalleştirme tepsileri, ilk başta çözelti 1 ul lamelleri protein örneğinin 1 ul içeren damlalar, ardından ayrı bir kuyu içine 12 koşullarının her birinin 500 ul . Bu teknikle ilgili ek bilgi için 27 bakınız.
    2. Hızla şeffaf bir bantla tepsiyi mühür ve titreşimsiz bir uygun sıcaklık kontrollü bir ortamda kaseti taşıyın. değişebilir kullanılan sıcaklık, ancak 4 ° C, 16 ° C ve 20 ° C oldukça yaygındır.
    3. Sonraki 3 gün boyunca tepsilere damla incelemek100X büyütme kadar bir mikroskop kullanılarak ays. 3 günlük dönemin sonunda, hiçbir yağış (net), hafif yağış, ağır yağış (kahverengi), ya da kristaller içeren her damla puan. Uygun bir protein konsantrasyonu en fazla 6, ağır çökeltilerin içermelidir.
    4. 4.2 tanımlanan protein konsantrasyonu, ticari olarak temin edilebilir kristalizasyon ekranlar geniş bir ekran. Ayrıca damla hatayı en aza indirerek bir sıvı taşıma veya kristalleşme robotun kullanımı büyük ölçüde bu süreci hızlandırır. Bu kullanıcı tek bir örnek ile daha fazla koşul ekrana izin, hem de çok daha az protein gerektirir.
    5. sistematik olarak daha önce 24-iyi tarama tepsileri kullanarak kristalleşme damla içinde değişkenlerin her değiştirerek geniş ekranlarından tespit başlangıç ​​koşullarını iyileştirmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu sistemde kullanılan iş akışı gösteren bir diyagram Şekil 1'de gösterildiği ve üç ana aşamadan içerir. dizinin Hesaplamalı analiz ilgi sarmal-bobin proteinin etki alanı sınırları konusunda hipotezler geliştirmek için kullanılmaktadır. Shrm2 SD2 alanının açıklamalı bir analizinin bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu diyagramda, hedef Shroom SD2 adı sitoskeletal regülatör C-terminusunda korunmuş bir alan için olası etki sınırlarını tespit etmek olmu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol kullanıcı kristalleşme kolaylaştırmak için büyük sarmal-coil proteinler içinde etki alanı sınırları belirlemeye yardımcı olmak için tasarlanmıştır. protokol potansiyel etki alanı sınırları bir dizi oluşturmak için hesaplamalı tahminler ve diğer kaynaklardan gelen verilerin çeşitli bütünsel dahil dayanır. Bu hızlı ve ucuz ve daha bu ilk hipotezleri geliştirmek için kullanılan biyokimyasal deneyler bir dizi tarafından takip edilmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, kullanıcının hızlı istenmeyen pota...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH R01 GM097204 (APV ve JDH) hibesi ile desteklenmiştir. JHM için finansman, bir HHMI Lisans Araştırma Yaz Bursu tarafından sağlandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BL21 (DE3) RosettaEmd Millipore70954-3
BL21 (DE3) YıldızThermoFisher BilimselC601003
BL21 (DE3) Codon PlusAgilent Teknolojileri230245
LizozimSpektrum Kimyasal Mfg CorpL3008-5GM
Ni-NTA reçineYaşam Teknolojileri25216
SubtilisinASpectrum Chemical Mfg CorpS1211-10ML
24 kuyulu Cryschem PlateHampton araştırmasıHR3-160
INTELLI-PLATE   96:Art Robbins Instruments102-0001-03
PEG 3350Hampton araştırmasıHR2-591
PEG 8000Hampton araştırmasıHR2-515
PEG 400Hampton araştırmasıHR2-603
PEG 4000Hampton araştırmasıHR2-605
pcDNA3.1-Yoca-mRuby2Addgene49089
Gecelik Ekspres Otoindüksiyon Sistemi 1Emd Millipore71300
Lizojen Et Suyu tozuThermoFisher Scientific12795027 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  2. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  3. Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
  4. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  5. Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
  6. Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
  7. Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
  8. Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
  9. Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
  10. Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  11. Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
  12. Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
  13. Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
  14. Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
  15. Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
  16. Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
  17. Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
  18. Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075(2013).
  19. Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
  20. Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080(2011).
  21. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539(2011).
  22. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  23. Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
  24. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  25. Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
  26. Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
  27. Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
  28. Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
  29. Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
  30. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  31. Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
  32. Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
  33. Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  34. Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Coiled coil ProteinsProtein CrystallizationDomain Boundary PredictionNickel Affinity PurificationLimited ProteolysisNative PAGE AnalysisSize Exclusion ChromatographyVapor Diffusion MethodCrystallization ScreeningRuby Tag Fusion

Related Articles