Kullanımı Ödül arayan davranış değişiklikleri Tedbir Basit Yolu Drosophila melanogaster

Özet

Biz ödüllendirici uyaran ve ödül devletlerde değişiklikler için bir tedbir olarak gönüllü etanol tüketimi ile meyve sinekleri (Drosophila melanogaster) deneyimleri nonrewarding için bir protokol açıklar.

Özet

Biz ödül devletler değişiklikler için bir vekil olarak meyve sinekleri etanol öz-yönetim (Drosophila melanogaster) ölçmek için bir protokol açıklar. Biz, sinek ödüllendirme sistemi içine dokunun doğal ödül ile ilgili deneyimlerini değiştirebilir ve ödül devletlerde değişiklikler için bir tedbir olarak gönüllü etanol tüketimi kullanmak için basit bir yol göstermektedir. yaklaşım iç devlet tecrübesi aracılı değişiklikler rol oynayan nöronlar ve genlerin çalışma ilgili bir araç olarak hizmet vermektedir. protokol iki ayrı bölümden oluşmaktadır: ödüllendirici ve nonrewarding deneyimleri sinekleri açığa ve bir ilaç ödül elde etmek için motivasyon bir önlem olarak gönüllü etanol tüketimi analiz edilmesi. iki kısmına, sırasıyla, bundan başka alt deneyleri için bir ilk adım olarak ya da bağımsız bir, iki seçim beslenme deneyi olarak deneyimi modülasyonu uyarılması için bağımsız olarak kullanılabilir. Protokol karmaşık bir kurulum gerektirmez ve bu nedenle herhangi LABORATOR uygulanabilirTemel sinek kültür araçları ile y.

Giriş

Deneyim cevaben davranış modifikasyonu hayvanlar ortamında ¹ değişikliklere davranışlarını ayarlamak için izin verir. Bu süreçte, hayvanlar dış çevre değişen koşullara kendi iç fizyolojik durumunu entegre ve daha sonra hayatta kalma ve üreme şanslarını artırmak için başka bir yere bir eylem seçin. Ödül sistemleri, yeme ya da içme, ya da yavru ² cinsel davranış veya bakım gibi uzun vadeli hayatta kalmasını sağlamak o gibi acil hayatta kalma geliştirmek davranışları, takviye bireylerin ve türlerin hayatta kalması için gerekli olan davranışları motive etmek gelişti. Bu tür kötüye ilaçlar gibi yapay bileşikler de doğal ödülleri ² aracılık birlikte gözle nöral yollarla ödül sistemlerini etkileyebilir.

Son yirmi yılda, meyve Molec eğitimi için Drosophila melanogaster gelecek vaat eden bir model olarak kurulmuştur uçmaknitlerin ve davranış ^3,4 Etanol etkilerini şekillendirmektedir nöronal mekanizmaları.

Daha önce, uyuşturucu ödülleri ⁵ elde etme motivasyonuna, sinekler peptiderjik nöronların bir alt kümesi (NPF / NPF reseptörü (R) nöronlar) gibi cinsel deneyim olarak bu çift doğal ödülleri belirledik. NPF ifade hem cinsel deneyimlere ve etanol zehirlenmesi olarak ilaç ödülleri, duyarlıdır. NPF sentezleme seviyelerinde değişiklikler yüksek NPF azaltır ve düşük NPF etanol tüketmek tercih arttırır etanol kendi kendine uygulanması ^5, değişiklikler dönüştürülür. onlar da azalmış etanol tüketimi ile yansıtılır aktivasyon ile eşleştirilmiş bir koku için güçlü bir tercih görüntüler olarak NPF nöronları aktive sinekler için ödüllendirici. Daha da önemlisi, NPF nöronların aktivasyonu etanol zehirlenme ve bir koku cue arasında pozitif bir ilişki oluşturmak için sinek yeteneği uğratır. NPF / R arasındaki nedensel bağlantıSistem, ödül belleği ve etanol tüketimi bir ödül Devletleri ⁵ değişikliklerin bir ölçüsü olarak etanol kendini yönetim kullanmak düşündürmektedir.

Bu yayında biz ödül devletlerde sinek doğal ödüllendirme sistemi ve tayinine değişiklikleri içine dokunarak için entegre bir yaklaşım göstermektedir. yaklaşım ödül devletler değişiklikler için bir tahmin olarak etanol öz-yönetim değerlendirmek için iki seçenek kılcal besleyici deneyi (CAFE) takip iki ayrı bölümden, doğal ödül ile ilgili deneyimler işlemek için bir eğitim protokolü oluşur. CAFE deney kendine ilaç uygulama için, kemirgen çalışmalarında kullanılan, iki şişe bir seçim tahlillerine benzer ve sinekler ⁶ bağımlılığı gibi belirli davranış özelliklerini yansıtacak biçimde gösterilmiştir.

Protokol

Not: deneysel tasarım Genel bakış: deneysel tasarım erkek sinekler 4 gün boyunca arka arkaya 3 eğitimlere ödüllendirici ve nonrewarding deneyimlere maruz edildiği kur bastırma ^7-9 için uyarlanmış bir protokol içerir. 4 gün - deneyimi fazının sonunda, sineklerin 3 için iki seçenek isteğe etanol tüketimi deneyinde test edilmiştir. Diğer bir deneyde (Tablo 1) başlangıcından önce zamanında yer almalıdır ise protokolü, burada, birden çok deneyde kullanılmak üzere önceden yapılabilir olan farklı hazırlık adımları içerir.

1. Hazırlık Adımları

1. kılcal besleyici sistemini hazırlama
   1. 27 G iğne ısıtın ve bir şişeye (Şekil 1) boyunca küçük delik delmek için kullanabilirsiniz.
   2. Bir jilet kullanarak yarısı (çaprazlama) olarak flakon fiş kesti. Mark squar oluşturarak fiş yüzeyinde dört puan,e şekil kılcal sahipleri içine konumlandırmak için. Fiş (Şekil 1b) üzerinden 4 delik yapmak için bir 18 G iğne kullanın.
   3. onlar sıkıca adaptörleri olarak hizmet 5 uL cam kılcal tutabilir, böylece mikropipetler kesmek için jilet kullanın.
   4. Hazırlanan fişlere içine 4 kılcal adaptörleri takın.
   5. fiş üzerinde 2 etanol-ve iki nonethanol içeren kılcal damarların konumunu işaretleyin.
      Not: Tüm şişeleri tutarlı kılcal damarların 2 tip pozisyonları tutmak için tavsiye edilir. Büyük delikler şişeleri dışarı sinekler kaçmasına izin olarak, deliklerin büyüklüğüne dikkat edin. Buna ek olarak, fiş kesme sinekler karışık alabilirsiniz bazı küçük, gevşek liflerin oluşturduğu gibi, şişenin takıldığında aşağı dönük tarafı olarak (genellikle kesim tarafında karşısı) fişin yumuşak tarafını kullanılması tavsiye edilir .
   6. şişeleri ve adaptörleri çok sayıda kılcal besleyici sistemi için kullanılacak hazırlayın (CAFE)Adım 2.3 tarif deneyler.
2. küçük cam gıda şişeleri hazırlanması
   1. Bir gün sinekleri (adım 1.4) toplama önce, mikrosantrifüj tüp rafları 200 cam şişeleri düzenlemek. Eritin (Mısır unu pekmez reçeteye göre Malzeme Tablo) gıda sinek bir mikrodalga kullanarak. cam şişe içine sinek gıda 2 ml dökün (flakon duvarları gıda smear değil deneyin). Gıda sertleşmesine izin verin, ve plastik wrap ile şişeleri örtün.
      Not: gıda içeren cam şişeler birkaç hafta boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
   2. sinek toplama gününde, buzdolabından şişeleri almak ve onları sinekler evine kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesi izin verin.
      NOT: Gıda şişeler birkaç hafta eski ise, sineklerin gıda ve cam arasında çatlaklar tuzak olabilir gibi gıda hala bozulmamış ve flakon kopuk olmadığından emin olun.
3. kılcal besleyici tahlil için yapma stok gıda çözümü
   1. önHazır Gıda çözeltisi (% 5 sukroz ve% 5 maya özütü) pare, maya ekstresi 5.88 g damıtılmış su, 100 mL sukroz 5.88 g çözülür.
      NOT: stok çözeltisi kirlenme riski çok yüksektir. Bu nedenle, otoklav önerilir (121 ° C, 30 dak, ve bir kurutma döngüsü olmaksızın) ve alikotları çalışan 850 uL içine kısım Bundan başka, kullanılana kadar 4 ° C 'de muhafaza etmektir. Stok çözelti içinde bileşenlerin konsantrasyonu% 5.88 ve sadece adım 2.3 kullanılmadan önce% 15 etanol ya da su (önceden yapılmış gıda çözeltisi 850 uL içinde 150 uL) ilave edildikten sonra% 5 nihai konsantrasyon elde edecek.
4. Deneysel sinekler Toplama
   1. CO ₂ takımını kullanarak 200 naif erkek sinekler toplayın.
      Not: Deneysel bir soru hakkında herhangi bir laboratuvar suşu kullanın. 250 sinekler kolayca eclosion çekme aşamasında sinek beş şişe alınabilir. sinekler toplarken, col dikkat etmenizSon zamanlarda eclosed olan çeneğini sinekler (bakire görünümlü sinekler: kendi karın üzerinde bir mekonyum nokta ile parlak sinekler). Deneyde kullanılmadan önce 4 D - eski Deneysel sinekler 3 gıda ve yaşlı ihtiva eden küçük bir cam şişe içinde, tek başına tutulmalıdır.
   2. Şişeleri kapatmak için yumuşak fişleri kullanın.
      NOT: deneyim aşamasında içine ve şişeleri dışarı dişileri eklemek için ağız aspirasyon kullanırken aynı yumuşak fişler eğitim aşaması için çok yararlı olacaktır.
5. eğitmen sinekler Toplama
   Not: tüm toplanan sinekler 25 ° C ve% 70 bağıl nemde (RH) 12 saat / 12 saatlik aydınlık / karanlık inkübatör tutulmalıdır. 12 saat / 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü uygun bir başlangıç ​​zaman değiştirilebilir.
   1. Bakire kadın eğitmen sinekler
      1. 500 bakire kadın eğitmen WT hisse senedi veya bakire alıcı kadın olarak kullanılmak üzere bir virginator stoktan uçar toplayın. normal boyuttaki gıda şişe başına 25 kişilik gruplar halinde erkek sineklerin tutmak ve tümdeneyde kullanmadan önce 4 d eski - 3 yaş bunları ow.
   2. Evlendirilen kadın eğitmen sinekler
      1. Eğitim aşamasında (adım 1.6.1) önce çiftleşme geçmesi WT hisse senedi veya bir virginator stokunun 300 bakire erkek sineklerin toplayın.
         NOT: Kadın sinekler normal boy gıda şişe başına 10 kadın gruplar halinde tutulur ve 3 yaşlı olan - deneyde kullanılan önce 4 d eski.
   3. Erkek sinekler çiftleşmiş kadın eğitmen uçar oluşturmak için kullanılan
      1. 150 erkek sinekler (ille bakire) toplayın.
         NOT: Sinekler 3 düzenli boy gıda flakon ve yaşlı başına 15 erkek gruplar halinde tutulur - bakire kadın ile eşleştirilmiş önce 4 d eski evlendirilen eğitmen kadın yaratmak için uçar.
6. evlendirilen kadın eğitmen uçar oluşturuluyor
   1. 15 erkek bir dişi-conta içine bir erkek içeren flakon saygısız uçar ile çiftleşmiş dişi oluşturmak için eğitici olarak kullanılmak üzere uçar, 10 bakire kadın çifti grupları uçar(adım 2.1) ¹⁰ eğitim aşamasından önce 18 saat - flakon 16 içerebilen ve.
      NOT: Bu normalde antrenmandan önce akşam yer almalıdır. 1.5: erkek arasında 1 oranında tüm kadın evlendirilen olacağını garanti dişi sinekler uçuyor.
   2. Deney gününde, ağız aspiratör kullanılarak şişeden dışarı erkek aspire erkeklerden çiftleşen dişiler ayırın. Her eğitim gününün başlamasından önce bu hakkı gerçekleştirin.

2. Deneysel Adımlar

1. deneyim faz ayarlama
   1. inkübatör aydınlık fazın başlangıcında mümkün olduğunca yakın deney başlatın. davranış odasında (bakire ve evlendirilen ikisi) eğitmen kadın yerleştirin.
      NOT: Bu davranış odasında deney, ya da sessiz ve 25 ° C ve 60 olarak ayarlanmış herhangi bir tenha bir ortam gerçekleştirmek için tavsiye edilir -% 65 RH. % 50'nin üzerinde nem tutulması kur ve çiftleşme davranışları beri, çok önemlis neme duyarlı olduğu bilinen feromon algılama bağlıdır.
2. ödüllendirici ve nonrewarding deneyimleri erkek sinekler açığa
   1. rafın kenarları boyunca şişeleri konumlandırma, mikrosantrifüj rafları tek erkek sinekler içeren cam şişeleri düzenleyin.
      NOT: Bu düzenleme deneyci kolayca raftan dışarı şişeleri almadan çiftleşmeye geçmesi sinekler çiftleri gözlemlemek için izin verir.
   2. Ödüllendirici ve nonrewarding çiftleşme deneyimleri geçiren erkekler için ayrı raflar (yani reddetmiş ve evlendirilen) üzerinde uçar (adım 2.2.1 açıklandığı gibi) tek erkek içeren 100 cam şişe 2 grup hazırlayın.
   3. Aspire eğitmen kadın ve erkek sinekler içeren her flakon ekleyebilirsiniz. 1 saat zamanlayıcı ayarlayın. reddedilen gruptan başlayarak her şişeye birleştirilmiş bir kadın ekleyin. Sonra, evlendirilen edilecek erkeklere hareket ve her şişeye bakire kadın ekleyin.
   4. yakından çiftleşme karşılaştığında İzlebakire kadın ile etkileşim erkekler ilk bir saat içinde ve daha önce evlendirilen kadın ile etkileşim erkek arkadaşı olmadığını başarıyla dostum emin olmak için. 1 saat boyunca reddedilen kohort izlemek 15 dakika için ikinci bir zamanlayıcı ayarlamak ve erkeklerde her 15 dakikada izlemek için.
   5. ilk antrenmandan sonuna çiftleşme kadar sona ermedi evlendirilen kohorttan reddedilen çiftleşme başardı kohort ve erkeklerden erkek boşaltın.
   6. Düzenli sinek gıda şişenin içine önceden evlendirilen kadın eğitmenler dışarı aspire ilk eğitim oturumu bitirmek ve bir sonraki klima oturumu için saklayın. nazikçe evlendirilen erkek grup kadın aspire bu adımı izleyin.
   7. sinekler 1 saat bekletin.
   8. iki kere 2.2.7 - Tekrar 2.2.3 adımları.
   9. adımlarda 2.2.3 eğitim oturumu tekrarlayın - 2.2.8 3 daha d her gün.
3. Kayıt tüketimi (CAFE)
   1. Son Condit sonundag oturumu (dördüncü gün), kılcal besleyici şişeleri içine tek erkek ve grup onları aspire. sinekler eklerken kılcal besleyici şişe kapağı yumuşak bir fişi kullanın ve tüm sinekler takıldıktan sonra hazır kılcal besleyici fişi ile hızlı bir şekilde değiştirin. Grup 6 - koşulu başına en az 8 şişeleri yaratan bir şişenin içine deney gruplarının her birinden 8 sinekler.
   2. hafifçe tıkacın üstüne 5 mL su eklenerek fişleri ıslatın. su ekleyerek şişeleri içine dökülmesini önlemek için dikkatli olun. her şişeye su eşit miktarda ekleyin.
      Not: Bu adım kılcal damarların gelen buharlaşmayı azaltmak için yapılır. Bu nedenle, deney boyunca her gün tekrarlanır. bağıl neme bağlı olarak, şu günlerde fişler eklenecek daha az su gerektirebilir.
   3. % 15 bir son konsantrasyon oluşturmak için hazır gıda alikotları etanol ya da su ilave edilerek iki ayrı gıda çözelti hazırlayın.
   4. capill doldurmak içiniki gıda çözümleri ile koç, sıvı gıda laboratuar bir film şeridi üzerinde damla 5 uL oluşturmak ve 5 uL işaretine kadar çözüm kılcal doldurmak için izin verir. 5 uL kara leke hattına yakın kılcal, açık ucunu kullandığınızdan emin olun.
      NOT: - Birlikte 8 kılcal adaptörleri ve kılcal tutmak için bir ekleme olarak bunları kullanmak kerede birden fazla kılcal doldurmak için, 6 bağlamak mümkündür.
   5. kara leke tam olarak gıda çözümü konumlandırmak için parafin şeridinde hafifçe kılcal dokunun. mineral yağ küçük damlalar halinde her kılcal sonunda daldırma kılcal Seal. Bu aşama yiyecek çözeltisi potansiyel buharlaşmasını en aza indirir.
   6. kılcal damarların maruz kalan taraf ancak flakon (fiş yüzeyinden 1 mm veya daha az) iç kısmından gözetleme kadar fiş 4 adaptörler / sahipleri ile iki etanol içeren kılcal ve iki nonethanol içeren kılcal yerleştirin.
      NOT:sinekler normalde fişleri üzerinde oturmak ve beslemek için maruz kılcal aşağı tırmanmaya ıslak fiş yakın kılcal damarların açılmasını tutulması, buharlaşmayı azaltır ve gıdaya kolay erişim sağlar.
   7. Deneysel sinekler ihtiva şişelere ek olarak, sinekler olmadan sahte şişe hazırlayın. Bu kontrol, doğal buharlaşma değerlendirmek için hizmet vermektedir.
      NOT: farklılıklar değişken buharlaşma ve tüketim verilerini yanıltıcı yol açabilir olarak, fişleri ile karşılaştırıldığında kılcal açıklığın görece eşit konumlandırma tutmaya çalışın. Deney sırasında yeterli nemi korumak ve ıslak fiş düşük nem ve büyük mesafe olarak, ıslak fiş mümkün olduğunca yakın kılcal açıklıklar pozisyon kontrolsüz buharlaşma hem de sonuç olabilir.
   8. Bir cetvel kullanarak mm siyah işaret hattına göre kılcal damarların her sıvı göreli konumunu kaydetmek ve bu değerleri yazın.
      NOT: Çözelti siyah l tam olarak konumlandırılmış iseine, değer sıfıra eşit olmalıdır ve üstünde ya da altında olması durumunda, sırasıyla, pozitif veya negatif değerler olmalıdır. Sıvının ilk seviyeleri son O / N tüketim değerleri referans noktalarını ayarlamak.
   9. 24 saat süreyle geri inkübatör şişeleri ayarlayın. tüm deney boyunca sabit bir anda kılcal değiştirin.
   10. şişeleri hafifçe kılcal çıkarın ve siyah markalama hattına göre sıvı seviyesini ölçer.
   11. Dikkatle sahte şişede sıvı seviyesini kontrol edin.
       NOT: seviyeleri 2 mm'den daha fazla düştü Eğer buharlaşma yüksek olduğu ve tüketim seviyeleri güvenilir olmadığını, bu gösterir.
   12. 2 mL su yavaşça fişlerini ıslatın ve adımları 2.3.3 belirtildiği gibi, kılcal damarların bir dizi yeni ekleme - 2.3.10. 24 saat süreyle geri inkübatör şişeleri ayarlayın.
4. belirlenmesi tercih
   1. i nihai seviyesinden çıkararak her kılcal toplam tüketimi hesaplayınbaşlangıç ​​noktasına nitial düzeyi.
   2. (Etanol içeren kılcal damarların ayrı yani nonethanol kılcal) aynı gıda ile her iki kılcal damarların değerleri birleştirmek.
   3. etanol içeren kılcal damarların tüketilen miktarın olmayan etanol kılcal damarların tüketilen miktarı çıkarılarak etanol tercihini hesaplamak ve aynı şişenin tüm kılcal damarların toplam tüketim değerleri ile değer bölün.
   4. Aynı deney grubundaki tüm şişeleri tercih indeksleri ortalama.
      
      NOT: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Etanol 1 (E1), Etanol 2 (E2), Toplam nonethanol (Toplam NE) = NE1 + NE2, toplam etanol (Toplam E) E1 + E2 = Toplam tutar tüketimi (Toplam Sum) = Toplam NE + Toplam E ve Etanol tercihi İndeksi (PI)

Sonuçlar

FPreviously, Devineni ve diğ. meyve sinekleri etanol içeren gıda tüketmek için seçim verildiğinde, onlar yiyecek ⁶ içeren nonethanol üzerinde etanol içeren gıda için güçlü bir tercih görüntüler gösterdi. Burada gösterilen eğitim protokolü yaşanmadığını naif erkek sineklerin doğuştan etanol tercih tahlil zaman elde edilen bazı temsilcisi sonuçları.

Naif Canton S erkek sinekler 4 günlük yaşındaki kadar yaşlı,...

Tartışma

Burada, Devineni ve arkadaşları tarafından açıklanan önceki çalışmalara dayanarak, ödül arama davranışındaki değişiklikleri ölçmek için entegre bir yaklaşımın ayrıntılarını gösteriyoruz.⁶ ve Shohat-Ophir ve diğerleri⁵. Protokolün ilk bölümü, deneyim girdisi olarak farklı cinsel etkileşim türlerini kullanır ve ikinci bölüm, deneyimin etanol tüketme tercihi üzerindeki etkisini değerlendirmek için iki seçenekli bir beslenme testi kullanır.

Devineni ve d...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Polistiren 25 x 95 mm	Şişeler FlyStuff	32-109
dar plastik şişeler flugs	FlyStuff	42-102
Tek Kullanımlık Steril İğne 18 G ve 27 G	herhangi bir şirket		1,20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0,40 X 13 mm (27 G x 1/2")
10 x 75 mm Borosilikat Cam Tek Kullanımlık Kültür Tüpleri	Kimble Chase	73500-1075
Kalibre Edilmiş Pipetler 5 & # 956; L	VWR	53432-706	renk kodlu, 5 & # 956 içerecek şekilde beyaz; L
Mineral Yağ	Sigma-Aldrich	M5904
Sükroz, Moleküler Biyoloji Sınıfı	CALBIOCHEM	573113
Mikrobiyoloji için Maya özü Tozu	herhangi bir şirket
Etanol	Sigma-Aldrich	32221
standart pipet uçları (mikro pipetler)	ThermScientific	T114R-Q	hacim: 0,1 - 20 μ L (ultramicro)
IDENTI-PLUGS (Köpük Tüp Fişleri)	Jaece	L800-A	6 - 13 mm açıklığa uyar
IDENTI-PLUGS (Köpük Tüp Fişleri)	Jaece	L800-D	35 - 45 mm
açıklığa uyar virginator sinek stoğu	bloomington drosophila stok merkezi	#24638
Dar Şişeler, Tepsi Paketi (PS)	Genesee Scientific Corporation	# 32-109BR
Drosophila Medya Tarifleri ve Yöntemleri	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
propiyonik asit	Sigma-Aldrich	P5561
fosforik asit	Sigma-Aldrich
Methl 4-Hidroksibenzoat	Sigma-Aldrich	H3647
Agar Agar	herhangi bir şirket
mısır unu	herhangi bir şirket
Büyükannenin pekmezi	B& G Foods, Inc	belirtilmemiş
anlık kuru maya	herhangi bir şirket