Yöntem makalesi

Intravital mikroskobu ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi fare Hindlimb, insülin kaynaklı vazodilatasyon ve kas perfüzyon çalışmaya kombine

10.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54912

⸱

20 Mart 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Physiology, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU), VU University Medical Center, 2Department of Internal Medicine, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU), VU University Medical Center

Bu makalede

Özet

İnsülin kaynaklı vazodilatasyon kas perfüzyon düzenleyen ve mikrovasküler artırır kan ve doku interstitium arasında yüzey alanı (mikrovasküler işe alım) çözünen değişimi için kullanılabilir. Kombine intravital mikroskobu ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi sunulan aynı anda insülin'ın eylem daha büyük gemiler ve mikro değerlendirmek için içinde vivo.

Özet

İnsülin'ın vasküler eylemler için düzenleme, insülin duyarlılığı katkıda kanıtlanmıştır. İnsülin'ın etkileri kas perfüzyon insülin duyarlı dokulara besin ve hormonlar tokluk teslim düzenleyen. Biz burada intravital mikroskobu (IVM) ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi (CEUS) aynı anda kas direnci arterler görselleştirmek için fare hindlimb adductor bölmesinin ve perfüzyon, birleştirme tekniği tarif mikro içinde vivo. Aynı anda birden çok düzeyde vasküler ağacının insülin'ın etkisi değerlendirilmesi insülin'in birden çok vazoaktif etkileri ve kas perfüzyon arasındaki ilişkileri incelemek önemlidir. Bu çalışmada deneyler farelerde gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, kuyruk ven kanülü anestezi, vazoaktif bileşikler ve ultrason kontrast Aracısı (lipid kapsüllü microbubbles) infüzyonu için eklenir. İkinci olarak, küçük bir insizyon attım kasık bölgesinde adductor kas yuvası arteriyel ağaç ortaya çıkarmak için yapılır. Ultrason sonda sonra kasları kesit içinde görüntülemek üzere kontralateral üst hindlimb de yer alıyor. Temel parametrelerini değerlendirmek için arter çapı değerlendirildiğini ve microbubbles daha sonra kas kan akımı ve mikrovasküler kan hacmi (MBV) tahmin etmek için sabit bir oranda aşılanmış. Öncesi ve sırasında bir hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe uygulandığında, kombine IVM ve CEUS insülin kaynaklı değişiklikler arter çapı, mikrovasküler kas perfüzyon ve tüm vücut insülin duyarlılığı değerlendirmesini sağlar. Ayrıca, yanıt mikrosirkülasyon ve insülin direnci arterler zamansal ilişkisi sayısal. Fareler boyuna içinde zaman içinde damar ve tüm vücut insülin duyarlılık değişiklikleri incelemek için değerli bir araç yapma takip olanağı da sağlar.

Giriş

Kan şekeri düzeyini bir artış yanıt olarak, pankreas nerede o hızla direnç damarları ve kılcal damarlar yoluyla kas iskelet gibi onun hedef dokulara yayılabilen kana insülin salgılar. Kas iskelet tokluk glukoz alımını1~ %80 için sorumludur. İskelet kası interstitium insülin teslimini adım glikoz elden çıkarma2,3,4teşvik metabolik eylemler insülin için sınırlama bir oran olması göstermiştir. 10-15 dk içinde insülin kılcal kan hacmi (mikrovasküler işe alım),5,6toplam kan akışını artırır önce oluşan bir etkisi artar. Mikrovasküler İşe Alım Satım besin (ve insülin)7,8için kullanılabilir endotel yüzey alanı genişler. İnsülin-aracılı mikrovasküler işe alım öncesinde ve bağımsız olarak değişiklikler kas iskelet glikoz alımı8,9ile ilişkilidir. İnsülin etkisi damarlara 'vasküler insülin duyarlılık' olarak adlandırdığı.

İnsülin-aracılı mikrovasküler işe alım ve insülin kaynaklı vazodilatasyon obez Zucker fareler10,11' Engelliler gösterilmiştir. Ayrıca, azaltılmış kapiller yoğunluk ile yalın fareler kas insülin direnci12görüntüler. Etkili işlerinde Kubota vd. endotel hücrelerinde sinyal bozulmuş insülin glukoz alımını iskelet kası tarafından yaklaşık%1340 azaltılmış, insülin kaynaklı mikrovasküler işe azaltma neden gösterdi. Bu anormallikler mikrovasküler işlevinde sadece kas, ama aynı zamanda içinde birden çok diğer doku ve organlar kalp gibi retina ve böbrek14,15,16meydana gelmez. Bu örnekleri ve diğer çalışmalar17,18,19,20 vasküler insülin etkileri (patho) fizyolojisi insülin direnci önemli bir mekanizma olduğunu göstermektedir ve onun komplikasyonlar.

İnsülin mikrovasküler kan hacmi (MBV) kas iskelet5,6artar önemli kanıtlar varken, hangi tarafından bu olur mekanizmaları tamamen anlaşılır9değildir. Endotel bağımlı vazodilatasyon damarlara farklı düzeylerinde damar insülin duyarlılığı21,22,23 birçok yönleriyle esastır. Kendisi insülin kaynaklı gevşeme direnç arter ve gevşeme derin mikrovasküler Satım yüzey alanı7,24artırmak için önceden kapiller arteriyoller tarafından meydana gelen vasküler insülin duyarlılığı, 25.

İntravital mikroskobu (IVM) doku hazırlıklar fare28 ve hamster yanak kese içinde fare patolojisi26, fare ve sıçan27bıçaklanmasından, bacak iskemi modelleri deri kıvrım odaları da dahil olmak üzere çeşitli kullanılan 29. kontrast-artırılmış Ultrasonografi (CEUS) olduğu başka bir görüntüleme tekniği kalp30 kas iskelet31mikrosirkulasyon değerlendirme sağlar. Rheologically kırmızı kan hücreleri olarak davranır ve tamamen vasküler Lümen içinde kalır inert gaz dolu microbubbles kullanır. Bu microbubbles intravenöz kararlı bir duruma ulaşmak için sabit bir oranda aşılanmış bulunmaktadır. Yüksek enerji ultrason dalgası, daha sonra microbubbles yok etmek için kullanılabilir. Faiz (ROI) bölgesinde microbubbles stok yenileme hızı akış hızı (MFV) temsil eder. Kontrast görüntü toplam sinyal yoğunluğu MBV temsil eder. CEUS art arda (aynı zamanda insanlarda) gerçekleştirilebilir ve bu insülin dayanıklı devletler (Barrett ve ark. içinde ele oluşur vasküler disfonksiyon anlayışı gelişmiş 32).

Geçerli çalışma odasında IVM ve CEUS eşzamanlı kullanımı yoluyla kas perfüzyon düzenlenmesi için yeni bir yüntem açıklar. Burada fare hindlimb adductor yerde insülin'ın vasküler eylemler ele. Bu bölümü çalışmaları yerel glikoz Alım temsilcisi bir kas etkinleştirme en büyük iskelet kas gruplarını Mouse, biridir. Bu bölme, IVM için hazırlık ve görselleştirme arter tarafından bir standart cerrahi işlem28kolayca erişilebilir olarak idealdir. Ayrıca, kendi grubu ve diğerleri CEUS bu bölme33,34kullanılabileceğini göstermiştir.

Olasılık insülin'ın etkisi büyük arteriyoller (yem ya da direnç arterler) ve aynı kas grubunda (kapiller yatak) mikro düzeyde değerlendirmek için kombine IVM ve CEUS tekniği için bir avantajdır. Buna ek olarak, iki yöntemden birini eşzamanlı uygulama insülin direnci arterler ve mikro düzeyde zamansal eylem içgörü sağlar. Bu IVM birlikte ve CEUS tekniği diğer vasküler Biyoloji alanlarında da uygulanabilir. Örneğin, çeşitli proteinlerin ve endotel etkileyen patofizyolojik belirli koşullar rolü nakavt modelleri kullanarak okudu. Ayrıca, her iki teknikleri zaman ve araştırma maliyetini azaltarak birden fazla zaman noktalarda bir fare kullanılabilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri yerel hayvan bakımı ve Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması. Tüm iletişim kuralından fare anestezi indüksiyon hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe sonuna kadar yaklaşık 2 saat sürer.

1. mikrocerrahi hazırlık

  1. Anestezi analjezi sonra 14 h 20-25 g ağırlığında bir erkek fare ile birlikte teşvik veya mayi iğne fentanil (0.31 mg/kg), Midazolam (6.25 mg/kg) ve Acepromazine (6.25 mg/kg) (FMA anestezi) oruç bir gecede ve yerleştirin bir vücut ısısı 37 ° C'de korur rektal ısı kontrollü homeothermic Isıtma yastığı
  2. Operasyon Masası ve birkaç kez alkol bazlı çözümünü kullanarak donanımları dezenfekte edin.
  3. 10 cm uzun polietilen boru (PE-20) 27 G iğne takın ve tüp 4 yönlü konektörüne takın. İğne kuyruğu damarda eklemek ve doku yapıştırıcı jel kullanarak bağlayacaktın. Bu kanül microbubbles, insülin, glikoz ve anestezi infüzyonu için kullanılacaktır.
    Not: Heparin ekleme (5 U/mL) cannulation sırasında steril serum fizyolojik içinde kuyruk ven (yaklaşık 10 µL) temizleme işlemi tıkanmış Kanüller olasılığını azaltır.
  4. Cerrahi girişimler ve deneysel protokoller boyunca anestezi FMA anestezi ile kuyruk ven kanülü 33.75 µL/kg/dk hızında sürekli bir intravenöz infüzyon ile sürdürmek.
  5. Fareyi ventral tarafı yukarı yerleştirin ve üst kalça alan ortaya çıkarmak için bir transfer bant kullanarak ayak düzeltin. Kalça eklemi (yukarı dönük olacak şekilde hindlimb pençeleri) ve 40-60 ° açı hafif bir exorotation diz eklem kas adductor bölmenin uyluğun, streç standartlaştırmak için kullanın.
  6. Saç kasık ve bilateral depilatory krem kullanarak üst kalça alanları kaldırın. Bir ıslak pamuk bez ile tüm gevşek saç toplamak.
  7. Yer altında bir stereomicroscope fare ve 10 X 16 X büyütme kullanarak aşağıdaki cerrahi adımları gerçekleştirin.
  8. İnguinal ligament, karın eğriliği (şekil 1) sadece yanal için paralel çalışan cilt makas kullanarak bir 2 cm kesi yapmak. Çekiş klemple bir bulldog kelepçe (şekil 1 d) kullanarak kesi distal tarafında geçerlidir. Bu pencerenin gerektiği gibi ayarlayın ve parafin yağı (1.12 içinde açıklanan) tutmak yardımcı olmak için yardımcı olacaktır.
  9. Yağ dokusu karın duvarı uzak incelemek. Kanama önlemek için hafifçe yağ yastığı yerine doğrudan pad ile anatomi duvar ayırmak. Distal yönde yağ yastığı, nazik çekiş (şekil 1 c) süreci kolaylaştıracaktır.
  10. Femoral arter tanımlamak ve ilk büyük dalları aşağı (epigastrik arter ve gracilis arter) izleyin (Şekil 2). Gracilis arter femoral arter adductor magnus kas üzerinde çalışan ilk büyük dalıdır ve sonra derin gracilis kas çalışır. Gracilis arter IVM için kullanılacaktır.
  11. Kaslar ve damarları kaplayan şeffaf derin fasya tanımlayın. Keskin forseps kullanarak, fasya yukarı doğru çekin ve bir microscissor kullanarak kesti.
  12. Bir damla (200 µL) ile maruz kalan kas tıbbi Sıvı parafin kapak (Oda sıcaklığı veya 37 ° C için önceden ısındı) hazırlanmış doku kurumasını önlemek için. Yağ damla uzak sızıntı değil ki emin olun. Bulldog kelepçe damarları banyoları parafin yağı tutmak için küçük bir boşluk oluşturmak için kullanma belgili tanımlık kesme deri kıvrımları ayarlayın.
  13. Önceden ayarlanmış mikroskop (16 X optik büyütme) altında fare gracilis arter bilgisayar ekranında dikey şekilde yerleştirin. Mikroskop bağlamak bir kamera ve bilgisayar tabanlı damarları çapı görüntü veri kümesinden ayıklayabilirsiniz analiz sistemi. Çapı gemi iki luminal tarafına arasındaki mesafedir. Sürekli izlenmesi ve Arter çapı ölçümü arzu.
  14. Işık kaynağı ışık kafa iletim azaltmak için hindlimb yeterli bir mesafede (en az 20 cm) yerleştirin.
  15. Prewarmed ultrason iletim jel üst kontralateral hindlimb için geçerlidir. Ultrason sonda uyluk kemiği uzun eksenine dik yerleştirin.
  16. Dikkatle açı ve adductor kas grubu kesitsel bir görünümünü elde etmek ultrason sonda yönünü ayarlayın. Fare ile ilgili olarak ultrason sonda konumunu temel ve hyperinsulinemic ölçmeler için aynı görüntüleme uçak tutmak için sabit tutmak için dikkat ediniz.
  17. 30 dk için stabilize fare izin. Temel çapı belgeleyen önce gracilis arter çapı 10 dakikadır kararlı olmalıdır.

2. temel ve Hyperinsulinemic ölçümleri

  1. Temel gracilis arter çapı IVM için kullanılan bilgisayar programı tarafından kaydedildiğinden emin olun.
  2. Coulter karşı 2. 5 x 109 kabarcıklar/mL deneme hemen önce bir konsantrasyon ile microbubbles önceden açıklanan35 ve sayısı olarak hazırlayın.
  3. Microbubbles yalnızca karşıtlık-modunda ultrason makinenin görülebilir gibi görüntü etkileyen parametreler kontrol ve toplanan kontrast veriler (açıklandığı 2.3.1) ve satın alma sürekli kullanımda.
    1. Ultrason makinede aşağıdaki ayarları kullanın: kontrast kazanç, 35 desibel; zaman off tazminat elde etmek; Satır yoğunluğu yüksek; Odak bölgeleri çapında sayısı; % 4 güç iletimi; Işın genişliği standart iletimi; SV kapısı 4; 1 duyarlılık; Sebat kapalı olarak. Odak bölgeleri konuma ilgi bölgesinin Merkezi düzeyde.
  4. Kısa bir kaydetmek (5 s) klip. Bu arka plan sinyal hesaplamak için kullanılacaktır.
  5. El ile tek tip bir süspansiyon için microbubbles içeren flakon sallamak. Kuyruk ven kanülü 5 µL/dk hızında çalıştırarak microbubbles beslerken başlatın. Microbubbles bir tek tip süspansiyon korumak için infüzyon tüp titreşimli girdap (min başına 200 x) yerleştirin.
  6. Böylece bir kararlı durum seviyeye ulaşmıştır microbubbles sürekli infüzyon 5 dk izin. Difüzörü imha işlevini (MBD) kullanarak kabarcıklar zaman yoğunluğu eğrileri elde etme ile 5 dk ve 10 dk ultrason makinede microbubbles infüzyon (şekil 3A) başladıktan sonra devam. Bu iki ölçüm ortalama sinyal temel perfüzyon verilerini almak için al.
  7. Temel veriler alındıktan sonra hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe açıklanan34başlatın. (1. 3'yerleştirilen) kuyruk kanül insülin ve glikoz (ve anestezi) yönetmek için kullanın.
    1. Kısacası, değişken bir infüzyon % 20 60 dk. kullanım için sürekli insülin infüzyonu (7,5 mU/kg/dak) tarafından takip 200 mU/kg insülin bolus tanıtarak bir hyperinsulinemic devlet teşvik euglycemia korumak için D-glikoz.
    2. Her 5 dk kuyruk damardan kan şekeri glukoz izleme aygıtı ile değerlendirmek ve değişken glikoz infüzyon hızı ayarlayarak 5 mM korumak. İnsülin duyarlılığı ortalama glikoz infüzyonu oranı son 30 dakika sayı ortalaması alınarak belirlemek.
  8. Gracilis arter çapı dönemlerde istenen (örneğin, 10, 30 ve 60 dk) bilgisayar programı ile hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe başlangıç belgelenen emin olun.
  9. 25 min sonra ve/veya insülin kelepçe, 55 dk. 30 ve/veya 60 dk, MBV sırasıyla belgelemek için ikinci (hyperinsulinemic) CEUS ölçüm başlatın. 2.4 ve 2.5 konusunda açıklanan adımları izleyin. Bağlantısını kesin ve microbubbles demlemek için 4 yönlü bağlantılarının anestezi bağlantı noktasını kullanın. Anestezi tüp microbubbles infüzyon bitiminden sonra yeniden bağlayın.
  10. IVM ve insülin infüzyonu CEUS ölçümleri başladıktan sonra 60 dk tamamlandıktan sonra kan daha sonraki analizler için bir kalp ponksiyon yordam tarafından fare geri alıyorum. Bu aynı zamanda fare ötenazi. Dikkatle gracilis ve femoral arterler incelemek ve daha fazla istenen deneyler için saklamak ( örneğiniçin Batı lekesi, immünhistokimya, ex vivo basınç myography36,37, deneyler 38).

3. çevrimdışı analiz

Not: IVM ve CEUS ölçümleri analizleri çevrimdışı kör bir dedektif tarafından gerçekleştirilmelidir. CEUS daha büyük gemiler mikro geçici olarak microbubbles yüksek yoğunluklu ultrason dalgaları MBD işlevini kullanarak tarafından tahrip tarafından ayırt etmek imkanı sunuyor. (Rasgele birimlerinde (a.u) daha büyük gemiler ölçülür) sinyal bu mikro daha hızlı karşılık gelen damarlarının microbubbles hız nedeniyle geri yüklenir.

  1. Çevrimdışı bir iş istasyonu veya yazılım ultrason makinede analizler yapmak için kullanın.
  2. Bir bölge çıkarlarını (ROI) mikro dahil etmek için çizin. Daha büyük femur gemiler (şekil 3A) dahil etmek için ayrı bir yatırım Getirisi çizin.
  3. Arka plan, temel ve hyperinsulinemic ölçümler için mikro'nın ve daha büyük gemiler ROIs yazılımda yerleşik ROI Kopyala işlevini kullanarak yinelenen.
  4. Arka plan ölçüm taban çizgisinden ve hyperinsulinemic ölçümleri yoğunluğunu sinyal çıkarma.
  5. Mikro yoğunluğu sinyal şiddeti sinyal femur gemilerin bölün. Temel ve hyperinsulinemic MBVs şimdi karşılaştırılabilir.

Sonuçlar

Glikoz infüzyonu oranı hyperinsulinemic-euglycemic kelepçe (insülin duyarlılık) sırasında oldu 180.21 ± 19.81 µmol/kg/dak gemi stabilize etmek için yerel uygulama parafin yağı adductor kas yuvası üzerinde ortalama temel çapı değişmedi damarların (73,6 ± 29.0 µm vs 68.8 ± 17,9 µm; p 0,58 =) ama varyasyon azaltmak yardımcı hayvanlar test (şekil 4A). İnsülin sürekli gracilis arter çapı (14.58 ± %6,2 60 dk; artışla N = 9) önemli ölçüde farklı olduğu (p < 0.0001) çapı değişikliğinden kaynaklanan tarafından salin infüzyon (-6.3 ± % 4.9; N = 6). İnsülin kaynaklı vazodilatasyon kayda değer 10 dakika sonra (10.09 ± %5.1; p = 0,002) ve 30 dk sonra en fazla akıl kapasitesi yaklaşık % 95'i ulaştı.

CEUS kullanarak, insülin sürekli kas MBV (şekil 5A) 33.5 oranında artmıştır (1.04 ±, N = 7; p 0.0009 =) için serum fizyolojik infüzyonu karşılaştırıldığında (-10.63 ± '.87, N = 6) (şekil 5B). Sunulan veriler kas tarafından femur damarları bölünmüş MBV sinyal yoğunluklarda vardır. Bu deneysel varyasyon farklı ölçümleri arasında farklı fare (veri gösterilmez) arasında azaltır. Sinyal şiddeti femur damarlarının doğrusal olarak microbubbles (şekil 3 c) dolaşımda konsantrasyon ile karşılık gelir. Femur damarları sinyal için teorik olarak düzeltme kullanılan microbubbles (şekil 3D) konsantrasyonları farklılıkları düzeltir. Veri ± standart sapma anlamına Bu bölümde sunulmaktadır.

figure-results-1
Şekil 1: Hindlimb Adductor bölmesinin cerrahi fuar. (A)bir kesi yapılır kasık, inguinal ligament yönüne paralel. (B) yumuşak çekiş distal yönde (siyah oklar) yağ yastığı, bağ dokusu (*) yağ yastığı ve karın duvarı arasında sunacak. Belgili tanımlık kesme (C) deri kıvrımları damarları banyoları parafin yağı tutmak için küçük bir boşluk oluşturmak için buldozer kelepçe kullanılarak ayarlanabilir. Sonra hazırlanan gracilis arter kalibre edilmiş bir mikroskop kullanarak görülüyor (D) ultrason sonda kontralateral üst hindlimb üzerinde konumlandırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Resim 2: Fare Hindlimb intravital mikroskobu. Femoral arter(a)epigastrik arter (B) ve (D) adductor kas grubu üzerinde çalışır gracilis arter (C) açmaktadır. Gracilis arter kalibre edilmiş bir mikroskop kullanarak IVM için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: Sinyal yoğunluğu kas mikrovasküler kan hacmi ve femur damarları kontrast-artırılmış Ultrasonografinin. Bir erkek fare üst hindlimb microbubbles sürekli infüzyon sırasında dijital görüntüleme platformu modunu görüntüleme doğrusal olmayan kontrast(a)görünümü. Doğru kapı aynası: iki ROIs MBV kas ve femur damarları temsil etmek için çizilir. Dahil adductor kas bölmenin yüzeysel parçasıdır sadece sinyal olarak yatırım Getirisi içinde derinliği ile yoğunluğu azalır. Sol kapı aynası: zaman-yoğunluğu eğrisi kas MBV yatırım Getirisi düşük. Dikey çizgiler microbubbles (MBD) imha yüksek enerji dalgaları ile temsil eder. Hemen MBD sonra kontrast temsilcisi microbubbles ile yavaş yavaş dolmaya başlayan görüntüleme düzlemde mevcuttur. Sonra 10-15 s, kontrast geliştirme zirvesine ulaştı. (B-D) Kararlı durum sinyal ulaşıldı sonra 2. 5 x 109 kabarcıklar/mL infüzyon hızını iki katına (5, 10, 20 µL/dk). Sinyal şiddeti kas MBV (B) ve femur gemiler (C) difüzörü konsantrasyon dolaşımda iki katına paralellik. (D) düzeltme kas MBV femur damarları sinyal sinyal yoğunluğu farklı difüzörü konsantrasyonları tarafından neden değişkenliğin kaldırır için (N = 9; hata çubukları temsil eden standart sapma). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: Gracilis arter intravital mikroskobu ölçümleri. (A)parafin yağı azaltır (olan parafin vs 17,9 µm olmadan 29.0 µm yağ uygulandıktan sonra) varyasyon gracilis arter farklı hayvanların ortalama temel çapı istikrarlı (73,6 µm 68.8 µm; vs tutarken p 0,58 =). (B) Arteryel çapları temel ve insülin veya salin infüzyon 60 dk sonra. 60 dk infüzyon sürekli gracilis arter büyümüş sonra insülin (p < 0.0001) için serum fizyolojik infüzyonu karşılaştırıldığında. (C) insülin kaynaklı vazodilatasyon oluşur 10 dk infüzyon başladıktan sonra (p = 0,002) ve en yüksek seviyede 30 dk. hata çubukları temsil standart sapma; % 95'i ulaşır unpaired bir öğrenci T-testi istatistik için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5: Mikrovasküler kan hacmi kontrast-artırılmış Ultrasonografi, fare Hindlimb Adductor kas bölmesinin kullanarak ölçüleri. (A)insülin insülin infüzyonu başladıktan sonra MBV 30 dk tutarlı bir artış sonuçlandı. (B) hyperinsulinemic ve temel ölçü birimlerinin (MBV değiştir) arasındaki farkı ile insülin-aracılı mikrovasküler işe alım gösterilir. İnsülin indüklenen 3.5 (1.04 ±, p 0.016; = N = 7) için serum fizyolojik infüzyonu karşılaştırıldığında mikrovasküler işe alım (-10.63 ± '.87, N = 6). Hata çubukları temsil eden standart sapma; unpaired bir öğrenci T-testi istatistik için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Biz aynı anda insülin'ın (IVM kullanarak) daha büyük arter ve (CEUS kullanarak) kas iskelet mikro vasküler eylemleri tahmin etmek için bir teknik geliştirdi. Başarılı ve güvenilir ölçümler için kritik adımlar şunlardır: 1) doğru bir şekilde açığa gracilis arter kanama olmadan; 2) arter banyo parafin yağı sızıntısını önleme; 3) infüzyon vazoaktif bileşikler (insülin) ve kontrast Aracısı (microbubbles) için patent Venöz erişim (kuyruk ven kanülü) sahip.

Mikrovasküler disfonksiyon kas çalışması obezite ve insülin direnci14,25,39,40bağlamında dikkat kazanmaktadır. Obezite ve insülin direnci vasküler işlevi üzerinde olumsuz etki vasküler ağaç farklı düzeylerde kendini gösteriyor. Şu andan itibaren farklı yaklaşımlar bu değişiklikleri değerlendirmek gerekir. Aynı fare IVM ve CEUS teknikleri kombine kullanımı insülin'ın etkileri damarlara farklı düzeylerinde ölçmek için güçlü bir araç sağlar. IVM doğrudan görselleştirme ve kantitatif analiz direnç arter ve CEUS insülin kaynaklı değişimler kas perfüzyon değerlendirilmesi için olanak sağlar.

Adductor kas yuvası okuyan birçok avantajı vardır. Damar kolayca erişilebilir ve belgili tanımlık kesme yüzeysel doğası, deney tamamlandıktan sonra cilt kesi 5.0 absorbe steril dikiş ile kapatmak olanak verir. Hayvanlar subkutan buprenorfin ile deneyler sonra 0.1 mg/kg doz adlı bir analjezik olarak enjekte ve sıcak bir ortamda kurtarmak için izin verdi. Fareler yordamı çok iyi tolere ve hayvanlar kaybı olmaksızın ne de okudu 35'ten fazla hayvanlarda hindlimb adet enfeksiyondan yaşadık. Bu takip sağlar veya boyuna bir moda hayvanlarda eğitim. Bu deneylerde kullanılan hayvanlar ancak, 0,4 L/dak yine de bir anestezi maskesi akan oksijen ile dengeli inhale % 1,8 isoflurane kullanarak anestezi. Aksine İsoflurane anestezi41,42, FMA anestezi periferik insülin duyarlılığı rahatsız etmez. Bir gelecek planı ne kadar iyi fareler FMA anesteziden kurtarmak incelemektir.

Adductor kas bölme de yerel arabuluculuk çeşitli vazoaktif bileşikler beri yararlıdır ve aşağı akım vasküler etkileri değerlendirilir. Örneğin, bu bileşiklerin topikal uygulama hedef dokulara superfusion teknikleri28 veya cerrahi işleme ve uyuşturucu stentlerin kelepçeleri damarları43çevreleyen implantasyonu kullanarak mümkün olabilir. Ayrıca, gracilis arter izole ve basınç myograph okudu. Bizim grup ve diğerleri Bu arter ex vivo36,37,38. insülin ve diğer vazoaktif bileşikler etkilerini belgelemek için basınç myograph kullanarak önemli deneysel kanıtlar toplandı

Bir kullanım için doğal IVM tekniği kas cerrahi Fuar ve damarlara stabilize etmek için uygulama parafin yağı kısıtlamasıdır. Öyle olup olmadığını bu eylemleri yerel ortamını arter etkisi açık değildir. Ancak, şekil 3A parafin yağı içinde banyo gracilis arter temel çapını önemli ölçüde değişmez gösterir. Ayrıca mineral yağ doku hyperoxic koşulları44korumak, Oksijen difüzyon başarıyla engeller gösterilmiştir. Ayrıca, petrol arterler temel çapı varyasyonu azaltmaya yardımcı olur. Bu yüzden biz parafin yağı kullanımı ve en az 30 dk için hazırlık dinlenme için savunucusu. Belirtmek gerekirse yağ – veya hiç yağ yerine tamponlu tuz kullanımı hiç – son derece değişken çapları ve daralma (veri gösterilmez) geminin sonuçlandı. Ayrıca, deneyler sonunda, biz parafin yağı - banyo gracilis arterler - izole ve onların reaktivite basınç myograph test ex vivo. Parafin yağı banyo damar benzer şekilde insülin ve asetilkolin (damar açıcı) ile uyardığında damar denetlemek için tepki gösterdi (veri gösterilmez). Tutarlı insülin kaynaklı vazodilatasyon açıkça bu çalışmada açıklanan IVM Protokolü güvenilir sonuçlar üretir gösterir.

Aynı fare her iki teknikleri uygulayarak avantajı bazı içsel sınırlamaları bir tekniği diğer tarafından üstesinden gelir: CEUS MBV rahatsız edilmeden kas içinde vivo içinde tahmin ediyor ama bireysel damarları değil görülebilir; MBV tahmin edemez de olsa IVM bireysel gemiler, görmek mümkün kılar. Bir gelecek planı IVM mikroskobu birlikte cremaster kas adductor kas kontralateral tarafında CEUS ile kullanmaktır. Bu değişiklik bir tahmin (CEUS kullanarak) MBV ve kılcal damarlar (IVM kullanarak) doğrudan bir optik erişim sağlayabilir. Protokol daha değiştirilebilir; kuyruk kanül için kullanılan 4 yönlü konnektör 5-yönlü bağlayıcıyı geçirilir. Bu, biz (2,9 noktasında açıklanmıştır) ikinci CEUS ölçüm yaparken anestezi tüp ayırma önleyebilirsiniz. Deneyim, fareler geçerli protokol iyi tolere. Bu iletişim kuralı için yapılan bir başka değişiklik kullanılan insülin kelepçe oranıdır. Biz supra fizyolojik olarak kabul edilir 7.5 mU/kg/dak kelepçe oranı kullanılır. Bağlı olarak çalışma,-ebilmek var olmak kullanılmış bir daha düşük insülin kelepçe oranı (örneğin 3 mU/kg/dak).

Açıklanan protokol güvenilir bulduk, dikkat edilmesi gereken belirli sınırlamalar vardır. Bazı durumlarda Arteryel çap ölçümü en uygun olduğunda. Hazırlık adımları çalıştırma modeli ile biraz tecrübe gerektirir. Bu gemi rahatsız ile yeni yağ ilave ve Arter dinlensin başka bir 30 dk için gerekli olduğunun çapı değiştirme parafin yağı gemi ortamından kaçak değil ki çok önemlidir. Buna ek olarak, parafin yağı yüzeyinde ışığın (protokol 1.14. adımında açıklandığı) yansıması bazen çok parlak, arter görüntülemek zorlaştırır. Bu ışık bir açıyla parafin yağı yüzey ve Arter paralel düşer böylece ışık kaynağının yönlendirerek yokedilebileceğini.

Sonuç olarak, bu çalışmada açıklanan IVM ve CEUS tekniklerin birleşimi, insülin damarlara farklı seviyelerde farklı etkileri ölçmek olanak verir. IVM gracilis arter CEUS kullanarak ölçülen aşağı akım mikrovasküler perfüzyon katkıda ters yönde vasküler değişiklikler görmemizi sağlar. Biz aynı fare daha iyi birkaç deneysel tekniklerin birleşimi değerlendirmek vasküler işlevi savunucusu.

Açıklamalar

Yazının içeriğini ve yapısını yazarlar tüm sorumluluğu kaldı ise görsel Sonics Inc açık erişim ücretleri kaplı.

Teşekkürler

Ing teşekkür ediyoruz. Duncan van Groen bu çalışmada kullanılan görüntü analiz yazılımı (ImageGrabber) programlama için. Sağlanan bu araştırma için fon tarafından bilimsel araştırma (grant 016.136.372) Hollanda Teşkilatı VIDI hibe.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C57BL/6 FarelerCharles nehriKullanılan fareler,
Vevo 2100 yüksek çözünürlüklü ultrason sistemiVisualSonics inc.
MS250 doğrusal olmayan dönüştürücüVisualSonics inc.
Vevo 2100 yazılımıVisualSonics inc.
Ultrason jeli (Aquasonic 100, renksiz)CSP Medical133-1009Ultrason dalgalarını iletmek için kullanılan ultrason jeli
VortexVWR international58815-234
Isıtma yastığı Pantlab
Freestyle Hassas Xceed AbbottHiperinsülinemik-öglisemik kıskaç sırasında kan şekeri seviyesini ölçmek için
İnsülin NovorapidNovo Nordisk
Glukoz monohidrat Merck Millipore 1083421000
Tamponlu tuzlu su çözeltisiB. Braun152118062
PE-20 tıbbi boruBecton, Dickinson and Company427405
İğne, 27 Gauge Becton-Dickinson & Co305109
Tıbbi bant3M
Ultrason probu tutucuDahili Şirket İçi
Pamuklu çubuklarÇoklu Eşdeğer
Krem tüy dökücüÇoklu Eşdeğer
Jel doku yapıştırıcısıDerma + flexGA30005-2222
İnfüzyon pompasıHarvard AparatHarvard Apparatus PHD 2000
Küçük ince düz makasGüzel Bilim Araçları (FST)14090-09
İğne tutucuGüzel Bilim Araçları (FST)12500-12
İnce uçlu düz forsepsGüzel Bilim Araçları (FST)11251-20
StereomikroskopOlympusSZX12
KameraBaslerscA1390-17gc
Görüntü Yakalayıcı programıDahili şirket içiGörüntü elde etme sistemi
ZamanlayıcıVWR33501-418
Şırıngalar, 1 mLFisher14-817-25
Işık kaynağı, fiber optikSchottKL1500İdeal olarak ayarlanabilir kollara sahiptir
Parafin yağıÇoklu Eşdeğer
Adı< / strong> <strong>Company< / strong> Katalog Numarası< / strong>Comments< / strong>
Microbubbles< / strong>
1,2-Distearoyl-sn-glisero-3-fosfokolin & nbsp;Avanti Polar Lipidler850365C
polioksietilen stearat   Sigmap3440
perflorobütan gazı F2 KimyasallarıC4F10 (g)
Decon FS200 ultrasonik banyo Decon Ultrasonik Ltd
Vialmix Lantheus Tıbbi Görüntüleme515370-0810
Multisizer Coulter SayacıBeckman Coulter Inc
tarafından şirket içinde yetiştirildi.

Kaynaklar

  1. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Rowe, J. W., Andres, R. Glucose intolerance in uremia. Quantification of pancreatic beta cell sensitivity to glucose and tissue sensitivity to insulin. The J Clin Invest. 62, 425-435 (1978).
  2. Chiu, J. D., et al. Direct administration of insulin into skeletal muscle reveals that the transport of insulin across the capillary endothelium limits the time course of insulin to activate glucose disposal. Diabetes. 57, 828-835 (2008).
  3. Herkner, H., et al. Transcapillary insulin transfer in human skeletal muscle. Eur J Clin Invest. 33, 141-146 (2003).
  4. Yang, Y. J., Hope, I. D., Ader, M., Bergman, R. N. Insulin transport across capillaries is rate limiting for insulin action in dogs. J Clin Invest. 84, 1620-1628 (1989).
  5. Clerk, L. H., et al. The vasodilatory actions of insulin on resistance and terminal arterioles and their impact on muscle glucose uptake. Diabetes Metab Res Rev. 20, 3-12 (2004).
  6. Vincent, M. A., et al. Microvascular recruitment is an early insulin effect that regulates skeletal muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 53, 1418-1423 (2004).
  7. Barrett, E. J., et al. The vascular actions of insulin control its delivery to muscle and regulate the rate-limiting step in skeletal muscle insulin action. Diabetologia. 52, 752-764 (2009).
  8. Vincent, M. A., Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G., Barrett, E. J. Active role for the vasculature in the delivery of insulin to skeletal muscle. Clin Exp Pharmacol Physiol. 32, 302-307 (2005).
  9. Clark, M. G., Rattigan, S., Barrett, E. J., Vincent, M. A. Point: There is capillary recruitment in active skeletal muscle during exercise. J Appl Physiol (1985). 104, 889-891 (2008).
  10. Wallis, M. G., et al. Insulin-mediated hemodynamic changes are impaired in muscle of Zucker obese rats. Diabetes. 51, 3492-3498 (2002).
  11. Eringa, E. C., Stehouwer, C. D., Roos, M. H., Westerhof, N., Sipkema, P. Selective resistance to vasoactive effects of insulin in muscle resistance arteries of obese Zucker (fa/fa) rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, 1134-1139 (2007).
  12. Bonner, J. S., et al. Muscle-specific vascular endothelial growth factor deletion induces muscle capillary rarefaction creating muscle insulin resistance. Diabetes. 62, 572-580 (2013).
  13. Kubota, T., et al. Impaired insulin signaling in endothelial cells reduces insulin-induced glucose uptake by skeletal muscle. Cell Metab. 13, 294-307 (2011).
  14. Levy, B. I., et al. Impaired tissue perfusion: a pathology common to hypertension, obesity, and diabetes mellitus. Circulation. 118, 968-976 (2008).
  15. Schelbert, H. R. Coronary circulatory function abnormalities in insulin resistance: insights from positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 53, 3-8 (2009).
  16. Wong, T. Y., et al. Associations between the metabolic syndrome and retinal microvascular signs: the Atherosclerosis Risk In Communities study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 2949-2954 (2004).
  17. Bonadonna, R. C., et al. Role of tissue-specific blood flow and tissue recruitment in insulin-mediated glucose uptake of human skeletal muscle. Circulation. 98, 234-241 (1998).
  18. Ellmerer, M., et al. Reduced access to insulin-sensitive tissues in dogs with obesity secondary to increased fat intake. Diabetes. 55, 1769-1775 (2006).
  19. Ellmerer, M., et al. Physiological hyperinsulinemia in dogs augments access of macromolecules to insulin-sensitive tissues. Diabetes. 53, 2741-2747 (2004).
  20. Vincent, M. A., et al. Mixed meal and light exercise each recruit muscle capillaries in healthy humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, 1191-1197 (2006).
  21. de Jongh, R. T., Serne, E. H., RG, I. J., de Vries, G., Stehouwer, C. D. Impaired microvascular function in obesity: implications for obesity-associated microangiopathy, hypertension, and insulin resistance. Circulation. 190, 2529-2535 (2004).
  22. Ketel, I. J., et al. Obese but not normal-weight women with polycystic ovary syndrome are characterized by metabolic and microvascular insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab. 93, 3365-3372 (2008).
  23. Khan, F., et al. Impaired microvascular function in normal children: effects of adiposity and poor glucose handling. J Physiol. 551, 705-711 (2003).
  24. Clark, M. G. Impaired microvascular perfusion: a consequence of vascular dysfunction and a potential cause of insulin resistance in muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295, 732-750 (2008).
  25. Serne, E. H., et al. Impaired skin capillary recruitment in essential hypertension is caused by both functional and structural capillary rarefaction. Hypertension. 38, 238-242 (2001).
  26. Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
  27. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg Endosc. 17, 939-942 (2003).
  28. Cardinal, T. R., et al. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front Physiol. 2, 91(2011).
  29. Duling, B. R. The preparation and use of the hamster cheek pouch for studies of the microcirculation. Microvasc Res. 5, 423-429 (1973).
  30. Wei, K., et al. Quantification of myocardial blood flow with ultrasound-induced destruction of microbubbles administered as a constant venous infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  31. Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G. Lipid infusion impairs physiologic insulin-mediated capillary recruitment and muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 51, 1138-1145 (2002).
  32. Barrett, E. J., Keske, M. A., Rattigan, S., Eringa, E. C. CrossTalk proposal: De novo capillary recruitment in healthy muscle is necessary. J Physiol. 592, 5129-5131 (2014).
  33. Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126, 2728-2738 (2012).
  34. Boer, M. P., et al. Globular adiponectin controls insulin-mediated vasoreactivity in muscle through AMPKalpha2. Vascul Pharmacol. 78, 24-35 (2016).
  35. van den Brom, C. E., et al. Myocardial Perfusion and Function Are Distinctly Altered by Sevoflurane Anesthesia in Diet-Induced Prediabetic Rats. J Diabetes Res. 2016, 5205631(2016).
  36. Meijer, R. I., et al. Perivascular adipose tissue control of insulin-induced vasoreactivity in muscle is impaired in db/db mice. Diabetes. 62, 590-598 (2013).
  37. Meijer, R. I., et al. Insulin-induced changes in skeletal muscle microvascular perfusion are dependent upon perivascular adipose tissue in women. Diabetologia. 58, 1907-1915 (2015).
  38. Sun, D., Kaley, G., Koller, A. Characteristics and origin of myogenic response in isolated gracilis muscle arterioles. Am J Physiol. 266, 1177-1183 (1994).
  39. Jonk, A. M., et al. Microvascular dysfunction in obesity: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Physiology (Bethesda). 22, 252-260 (2007).
  40. Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14, 403-438 (2007).
  41. Horber, F. F., et al. Isoflurane and whole body leucine, glucose, and fatty acid metabolism in dogs. Anesthesiology. 73, 82-92 (1990).
  42. Sui, H., et al. Quantifying insulin sensitivity and entero-insular responsiveness to hyper- and hypoglycemia in ferrets. PLoS One. 9, 90519(2014).
  43. Pires, N. M., et al. Local perivascular delivery of anti-restenotic agents from a drug-eluting poly(epsilon-caprolactone) stent cuff. Biomaterials. 26, 5386-5394 (2005).
  44. Young, D. A., Chi, M. M., Lowry, O. H. Energy metabolism of skeletal muscle biopsies stimulated anaerobically without load in vitro. Am J Physiol. 250, 813-820 (1986).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Artery apMikrovask ler Kan HacmiHiperins linemik euglisemik KlemplemeKuyruk Ven Kan lUltrason Prob
Intravital mikroskobu ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi fare Hindlimb, insülin kaynaklı vazodilatasyon ve kas perfüzyon çalışmaya kombine
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.