Erişkin nöral kök hücrelerin (aNSC'ler) genişletilmesi için kültür sistemlerinin kurulması, aNSC'lerin tedavi için incelenmesine ve uygulanmasına olanak sağlar. Subkallozal bölge (SCZ) son zamanlarda yetişkin farelerde yeni bir nöroblast oluşturan bölge olarak kabul edilmiştir. Burada, SCZ-aNSC'lerin izolasyonu, genişletilmesi ve farklılaştırılması için yöntemler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü
Bu makalede
Özet
Özet
Yetişkin nöral kök hücreler (aNSC'ler) hasarlı beyin dokusunun yenilenmesi için kullanılabilir. NSC'ler üç tip hücreye farklılaşma ve çoğalma potansiyeline sahiptir: nöronlar, astrositler ve oligodendrositler. aNSC'den türetilen bölgelerin tanımlanması ve aNSC özelliklerinin karakterize edilmesi, aNSC'lerin potansiyel kullanımı ve nöral rejenerasyondaki rollerinin aydınlatılması için kritik öneme sahiptir. Beyaz cevher ve hipokampus arasında yer alan subkallozal bölgenin (SCZ) son zamanlarda aNSC'ler içerdiği ve sürekli olarak nöroblastlara yol açtığı bildirilmiştir. SCZ'den gelen aNSC'lerin düşük bir yüzdesi nöronlara farklılaşır; Çoğu hücre, oligodendrositler ve astrositler gibi glial hücrelere farklılaşır. Bu hücrelerin travmatik kortikal yaralanma için terapötik bir potansiyele sahip olduğu öne sürülmektedir. Bu protokol, yetişkin bir fare beyninden SCZ-aNSC'ler üretme sürecini ayrıntılı olarak açıklar. SCZ içeren koronal dilimleri elde etmek ve SCZ'yi tüm beyinden hassas bir şekilde incelemek için 1 mm aralıklı bir beyin matrisi kullanılır. SCZ bölümleri başlangıçta bir nörosfer kültürüne tabi tutulur. İyi geliştirilmiş bir kültür sistemi, özelliklerinin doğrulanmasına izin verir ve NSC'ler üzerindeki araştırmaları artırabilir. Bir nörosfer kültür sistemi, proliferasyonu belirlemek ve gerçek NSC'leri toplamak için yararlı bir araç sağlar. Tek katmanlı bir kültür aynı zamanda proliferasyon ve farklılaşmayı test etmek için in vitro bir sistemdir. Önemli bir şekilde, bu kültür sistemi, NSC'ler için nörosfer kültür sisteminden daha homojen bir ortam sağlar. Bu nedenle, ayrı bir beyin bölgesi kullanarak, bu kültür sistemleri, aNSC'ler ve terapötik kullanımlar için uygulamaları hakkındaki bilgimizi genişletmek için yardımcı olacaktır.
Giriş
NSC'ler kendini yenileme ve çoklu soy farklılaşması özelliklerine sahiptir. Bu özellikleri doğrulamak için, bir nörosfer kültür sistemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Nörosfer kültür sistemi 1990'ların başında geliştirildi ve standart bir kök hücre kültürü sistemi olarak görev yaptı1. Kendini yenileme potansiyeline bağlı olarak, NSC'ler sürekli olarak çoğalır ve bir süspansiyon kültüründe bir hücre kütlesi oluşturur. Hücre sayısı ve nörosferin büyüklüğünün, NSC'lerin proliferasyon özellikleri ile yakından ilişkili olduğu düşünülmektedir. Tek katmanlı kültürler, NSC'lerin bakımı ve farklılaşması için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Nörosfer kültürü ile k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Malzemeler ve kültür besiyeri hazırlanması 1.
- SCz diseksiyonu ve ayrışma için, alüminyum folyo ile beyin matrisi, iki ucu keskin jilet ve forseps sarın ve daha sonra otoklav ile sterilize.
- Bütün fare beyin yıkamak için soğuk PBS tamponu 50 ml hazırlayın.
- Bir diseksiyon mikroskobu kurmak ve beyin (otoklav makas ve forseps) diseksiyonu için gerekli cerrahi aletler ve SCZ (1 ml şırınga, 30 G iğne, beyin matris ve ince forseps) izolasyonuna hazırlar.
- N2 ortamında hazırlanması:
- F-12 / DMEM (+ L-glutamin + sodyum bikarbonat)% 2 B27,% 1, N2 takviyeleri ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile orta hazırlayın.
Not: büyüme orta....
- F-12 / DMEM (+ L-glutamin + sodyum bikarbonat)% 2 B27,% 1, N2 takviyeleri ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile orta hazırlayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bilinmeyen nörojenik bölgeden aNSCs için kültür sistemi tanımlayan bu hücrelerin anlamak için beyin tamir 12 potansiyel kullanımını geliştirmek için gereklidir. Farklı gelişim evrelerindeki ya da farklı bölgelerde NSC'lerde farklı 3,4 davranır bilinmektedir. Son zamanlarda, bu SCZ türetilmiş hücreler SVZ türetilmiş hücreler 7-9 ile karşılaştırıldığında in vivo ve in vitro nöronal farklılaşma için farklı potansiyelleri sergilediği bil.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda erişkin fare SCZ gelen NSCs oluşturmak ve çeşitli uygulamalar için onları korumak için ayrıntılı bir protokol açıklar. SCZ-NSCs arındırmak ve genişletmek için gerekli in vitro kültür sistemi kurulması için üç kritik adımlar vardır. İlk olarak, SCZ bölgesi hassas diğer potansiyel nörojenik bölgeler (Şekil 1B) dışarı parçalara sağlamak için önemlidir. SCZ bölgeler içeren kalın ve hassas Bölümler 1 mm'lik aralıklı beyin matriksi ile elde edilmiştir, ve daha sonra ince bir iğne kortik.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Kore Bilim, BİT ve Gelecek Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Beyin Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir (Hibeler NRF-2015M3C7A1028790); ve Sağlık ve Refah Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi'nden alınan bir hibe ile, Kore Cumhuriyeti (HI14C3347).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| < güçlü > Orta bileşenler< / güçlü > | |||
| DMEM / F12 | Gibco | 11320-033+ | L-glutamin, +Sodyum bikarbonat |
| Kalem/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 takviyesi | Gibco | 17502-048 | |
| B27 takviyesi | Gibco | 17504-044 | |
| Büyüme faktörü | |||
| bFGF | R& D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Tampon | |||
| PBS (10x) | BİYOÇÖZÜM | BP007a | 1x seyreltme |
| HBSS | Gibco | 14175-095< | |
| güçlü>Ayrışma tamponu | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Alet | |||
| İnce forseps | WPI | 555229F | |
| Makas | Storz | E3321-C | |
| Beyin matrisi (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Çift kenarlı tıraş bıçağı | DORCO | ST-300 | |
| 30 G iğne | SUNGSHIM | N1300 | |
| Malzemeler | |||
| 15 ml tüpler | SPL | 50015 | |
| 50 ml tüpler | SPL | 50050 | |
| 35 mm çanak | SPL | 10035 | Petri kabı |
| 100 mm çanak | SPL | 10090 | Petri kabı |
| Kapak kayması, (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 kuyulu çanak | SPL | 32012 | kaplamasız |
| 6 kuyulu çanak | SPL | 32006 | kaplamasız |
| Kaplama malzemeleri | |||
| PLO | Sigma | P4957 | %0.01 |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg / ml |
| < güçlü > primer antikorlar & | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | fare (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | tavşan (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | keçi (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | tavşan (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | sıçan (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | fare (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Sıçan (1:500) |
| İkincil antikorlar | |||
| anti-fare 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-fare cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-fare 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| tavşan karşıtı 488 | Alexa | A21206 | |
| tavşan karşıtı cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-tavşan 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| keçi karşıtı 488 | Alexa | A11055 | |
| keçi karşıtı cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| keçi karşıtı 647 | Invitrogen | A21447 | |
| sıçan önleyici 488 | Invitrogen | A21208 | |
| sıçan önleyici cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| sıçan önleyici 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| < güçlü > immün boyama malzemeleri< / güçlü > | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | PBS Triton X-100 usb'de% 0.1 Triton X-100% 3 BSA |
| 22686 | |||
| %4 PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Yaşam Teknolojisi | H3570 | Boyama çekirdekleri için boya |
Kaynaklar
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
