Yöntem makalesi

Yemlerin metagenomic Analizi

18.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54936

⸱

13 Ocak 2017

 ,  ,  ,  , 
1Biosciences, University of Exeter

Bu makalede

Özet

Silajlık sığır yemlerinin mikrobiyomunu araştırmak için

Metagenomik kullanılmıştır. Analiz, av tüfeği dizilimi ile gerçekleştirildi. Bu yaklaşım, sığır yemi içindeki mikrobiyal topluluğun bileşimini karakterize etmek için kullanılmıştır.

Özet

Metagenomik, çevresel örneklerden saflaştırılan deoksiribonükleik asidin (DNA) doğrudan analizi olarak tanımlanır ve içlerinde bulunan mikrobiyal toplulukların taksonomik olarak tanımlanmasını sağlar. İki ana metagenomik yaklaşım mevcuttur; tanımlama için taksonlar arasında yeterli varyasyon sergileyen 16S rRNA gen kodlama bölgesi ile numunede bulunan organizmaların genomlarının analiz edildiği ve "operasyonel taksonomik birimlere" atfedildiği av tüfeği dizilemesi; sıralama kapsamının kapsamına bağlı olarak türler, cinsler veya aileler.

Bu çalışmada, sığır silajında bulunan mikrobiyal topluluğu analiz etmek için av tüfeği dizilemesi kullanıldı ve DNA dizisi okumalarını kalite kontrol etmek ve filtrelemek için bir dizi biyoinformatik araçla birleştirildi, örneklenen silaj içinde bulunan mikrobiyal popülasyonların taksonomik sınıflandırmasını gerçekleştirdi ve dizilerin işlevsel açıklamasını elde etti. Bu yöntemler, silaj bozulmasının bir göstergesi olan silaj içinde bulunan potansiyel olarak zararlı bakterileri tanımlamak için kullanılmıştır. Bozulmuş silaj düzeltilmezse, yutulduğunda çiftlik hayvanları için potansiyel olarak ölümcül olabilir.

Giriş

Metagenomiks DNA'nın doğrudan analizi çevre örnekleri 1 içinde bulunan biyolojik toplulukların saflaştırılmış ve ilk sediment 2'de bulunan Kültüre edilemeyen bakteri tespit etmek için kullanılır idi. Metagenomiks yaygın olarak, insan mikrobiyomu 3 belirleme okyanus 4 içinde ve hatta kahve makineleri 5 üzerinde geliştirmek bakteri topluluklarının analizi için mikrobiyal nüfusu sınıflandırılması gibi uygulamalar, bir dizi için kullanılır olmuştur. Yeni nesil dizileme teknolojileri tanıtılması büyük sıralama hacmi ve çıkış sonuçlandı. Sonuç olarak, DNA dizilemesi, 6 daha ekonomik hale gelmiştir ve gerçekleştirilebilir sekanslama derinliği büyük ölçüde güçlü bir analitik araç haline metagenomics sağlayan artmıştır.

Metagenomic sıralama pratik, moleküler açıdan "Front-end" geliştirmeleri in büyümesini tahrik vartaksonomik sınıflandırma 7-9, fonksiyonel açıklama 10,11 ve DNA sekans verileri görsel temsilini 12,13 kullanılabilir siliko biyoinformatik araçları. Mevcut sayısının artması, kaçınılmaz sıralı genomları 15 bir "arka uç" referans veritabanı karşı gerçekleştirilen mikrobiyal topluluklar, sınıflandırılmasında daha hassasiyet sağlayan prokaryotik ve ökaryotik 14 genomları sıralı. Iki temel yaklaşım metagenomic analiz için kabul edilebilir.

Daha geleneksel bir yöntem, bakteriyel genom bölgesini kodlayan 16S rRNA geninin analizidir. 16S rRNA yüksek prokaryot türler arasında korunmuş ancak dokuz hiper-değişken bölgeleri sergiler (V1 - V9) türleri tanımlama 16 için istismar edilebilir. uzun dizileme giriş (≤ 300 bp eşleştirilmiş sonu), özellikle de iki hiper değişken bölgeleri kapsayan DNA sekanslarının analizi için izinV3 - V4 bölgesi 17. Böyle Oxford Nanopore 18 ve PacBIO 19 gibi diğer sıralama teknolojileri, ilerlemeler tüm 16S rRNA gen bitişik sıralı izin yoktur.

16S rDNA göre kütüphaneleri türlerin belirlenmesi için hedeflenen bir yaklaşım sağlar ve doğal saflaştınlmış numuneler içinde meydana düşük kopya sayısı DNA algılanmasını sağlamak da, av tüfeği sıralama kütüphaneleri ya da 16S çoğaltılabilir olmayan DNA bölgeleri içerebilir türlerinin tespiti için izin rRNA işaretleyici astar dizileri kullanılan, ya da şablon dizisi ve yükseltme primer dizisinin arasındaki farklar 20,21 çok büyük çünkü. DNA polimerazlar, DNA replikasyon yüksek aslına olmasına rağmen başka, taban hataları yine PCR amplifikasyonu sırasında oluşabilir ve bu dahil hataları türler 22 menşeli hatalı sınıflandırma ile sonuçlanabilir. Şablon SEQ PCR amplifikasyonu ayrımcıDİZİLERİ da oluşabilir; Kullanılan nihai amplikon, havuzda gibi timin glikol gibi 23 ve benzer şekilde, doğal olmayan baz modifikasyonları temsil altında yüksek bir GC içeriğine sahip DNA dizileri, DNA polimeraz 24 dizileri DNA'nın çoğaltılmasında hatalarına neden durdurmak için olabilir. Buna karşılık, bir av tüfeği sıralama DNA kütüphanesi bir numune çıkarılır ve daha sonra önceden sekanslama için hazırlık için daha kısa DNA zinciri uzunluklarda parçalanmış olan saflaştırılmış DNA tümü kullanılarak hazırlanmıştır bir DNA kütüphanesidir. Finansal maliyet güvenilir bir dizi derinliği amplikon sekanslama 26 daha büyüktür ulaşmak için gerekli olsa da tüfek dizilemesi ile oluşturulan DNA dizilerinin taksonomik sınıflandırma, 16S rRNA dizilemesi amplikon 25 daha doğru karşılaştırılır. av tüfeği sıralama Metagenomiks büyük yararı olmuştur kez numune çeşitli genomlar sıralı bölgeleri gen zenginleştirilmesi için kullanılabilir olmasıdırtaksonomik 27 sınıflandırılmıştır.

Metagenomic dizi verileri biyoinformatik araçlar giderek artan aralığı ile analiz edilir. Bu araçlar, örneğin, uygulamalar geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için edebiliyoruz, eşleştirilmiş ucunun üst üste ham dizi verilerinin 28 kalite kontrol analizleri, dizinin de novo montaj komşularla ve iskeleler 30,31, taksonomik sınıflandırma ve görselleştirme okur 29 okur dizisi okur ve dizileri 7,12,32,33 ve monte dizilerin 34,35 fonksiyonel ek açıklama toplandı evi.

Mısır gibi fermente tahıllar (Zea mays) dan dünya çapında çiftçiler tarafından üretilen silaj, ağırlıklı olarak büyükbaş hayvan yemi olarak kullanılır. Silaj bakteri Lactobacillus sp ile işlenir. fermantasyon 36 yardım ancak bugüne kadar, silaj bulunan diğer mikrobiyal populasyonların sınırlı bilgi var etmek. Fermentn süreci silaj 37 içinde yaygın hale istenmeyen ve zararlı mikro-organizmaların yol açabilir. Maya ve küf ek olarak, bakteri silaj fermente anaerobik ortam yapılarına uyarlanabilir ve daha sık çiftlik hayvanlarında hastalıkların yerine silaj 38 bozulması ile ilişkilidir. Silaj siloları doldurma ve böylece silaj 39 pH artan bütirik asit, laktik asit, anaerobik sindirim ürünü dönüştürmek mümkün olduğunda yanlışlıkla topraktan eklenebilir bütirik asit bakterileri kalır. PH bu artış normal, optimum silaj fermantasyon koşulları 38 altında büyümeyi sürdürmek mümkün olacağını bozucu bakterilerin bir yükselişe yol açabilir. Clostridium spp. Listeria spp. ve Bacillus spp. Gastr hayatta bakteri sporlarına olarak, özellikle süt sığırı yemi silajında, özel bir önem taşıyorointestinal yolu 40 hayvan ve insan ölümlerine 37,39,41-44 için, nadir durumlarda, gıda zinciri girmek gıda bozulmaları yol ve olabilir. o silaj bozulma nedeniyle veteriner tedavisi ve hayvancılık kaybının tam ekonomik etkilerini tahmin etmek zor Dahası, bir salgın meydana gelmesi ise bir çiftlik zararlı olması muhtemeldir.

Metagenomic yaklaşım kullanarak biz olmak iyileştirici önlemler sağlayan, silaj örneklerinde mevcut mikrobiyal nüfusu sınıflandırmak ve ayrıca da, potansiyel olarak hayvancılık üzerinde zararlı bir etkisi olurdu silaj bozulma ile ilişkili mikrobiyal topluluklar belirleyebilir varsayılmaktadır silaj önce alınan bir besin kaynağı olarak kullanılmak üzere.

Protokol

1. Site Yeri

  1. Böyle bir çiftlikte gibi uygun bir siteden silaj örneği toplayın. Burada, çiftlik Ballydulea, Co Cork, İrlanda (51 ° 51'58.4 "N 8 ° 16'48.7" W) yer oldu.

2. DNA Ekstraksiyon

Not: DNA ekstraksiyonu, üreticinin talimatlarına göre bir ticari kit kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Resim örnek bulunan bir negatif kontrol, kütüphane Hazırlama yöntemi içinde kullanıldı.

  1. Verilen parçalama tüplerinde 978 uL sodyum fosfat tamponu ve 122 ul toprak lizis tamponu numune 400 mg - 100 ekleyin.
  2. 6.0 m / s kadar bir hızda 40 saniye boyunca homojenleştirici lizis tüpleri yerleştirerek örnekleri homojenize.
  3. Santrifüj lizatları 15 dakika 14.000 xg'de ve Protein Çökelti Çözüm 250 ml (PPS) içeren temiz bir mikro-santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. 10 kez ve santrifüj tersini çözüm karıştırın5 dakika boyunca 14.000 x g'de.
  4. Temiz bir 15 mL santrifüj tüpünde 1 ml DNA bağlama matrise süpernatant ekleyin. 3 dakika boyunca sürekli tersini tüp çözüm karıştırın. Karışım, daha sonra, 3 dakika razı yüzer 500 uL atmak için izin verir. kalan süpernatant karıştırın.
  5. 1 dakika için 14,000 x g'de bir eğirme filtresi ve santrifüj süspansiyon 600 ul aktarın. süzüntü atın ve kalan süspansiyon işlemi tekrarlayın.
  6. daha sonra 1 dakika için 14,000 x g'de santrifüj, pipetleme karışım, sıkma filtre içinde DNA bağlama matrisi yıkama tamponu 500 ul ekle.
  7. süzüntü atın ve 2 dakika tüm yıkama tamponu kaldırılır sağlamak için 14.000 xg tekrar sıkma filtresi santrifüj. 5 dakika boyunca 23 ° C'de santrifüj kurutun.
  8. Pre-sıcak (70 ˚C) DNaz içermeyen su (DES) ve yeniden askıya sıkma filtre içinde DES 100 uL DNA bağlayıcı matris. Temiz bir 1.5 ml mikro santrifüj tu spin filtre aktarınolacak ve 1 dakika DNA Zehir için 14.000 xg'de santrifüj. daha fazla analiz yapılana kadar -20 ° C'de arıtılmış, DNA saklayın.

3. DNA Saflaştırma kullanılarak DNA saflaştırma Boncuk

Not: Alınan DNA saf DNA örneği sağlamak için saflaştırma boncuklar kullanılarak saflaştırılmıştır Önceki metagenomic kütüphanesi hazırlanmasında elde edildi.

  1. kullanımdan önce, 30 dakika boyunca 23 ° C'de boncuk inkübe edin. DNA örneğine boncuk 2 hacim ilave edin ve 5 dakika boyunca 23 ° C'de çözelti inkübe edilir.
  2. 5 dakika için bir ayrıştırma mıknatıs üzerine numuneler ve süpernatant atılır. 200 uL taze% 80 etanol (EtOH) ile iki kez boncuk yıkayın. Hava, 10 dakika boyunca taneciklerin kurutulması.
  3. ayırma mıknatıs örnekleri çıkarın ve elüsyon tamponu (EB) 50 mcL, pipetleme ile karıştırın.
  4. daha sonra tekrar 3 dakika için ayrılma mıknatıs üzerine örnekleri yer, 5 dakika boyunca 23 ° C'de süspansiyon inkübe edin.
  5. Trtemiz bir tüpe DNA içeren süpernatant, ansfer. boncuk atın.
  6. Dördüncü bölümde uyarınca saflaştırılmış DNA niceliğini.

Saflaştırılmış DNA 4. Niceleme

Not: Saflaştırılmış DNA, bir florimetre ve üreticinin talimatları izlenerek, çift sarmallı (dsDNA) yüksek duyarlılık (SS) deneyi kiti kullanılarak ölçülmüştür.

  1. reaktiftir tamponu: 1 oranını 199 kullanarak bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
  2. çalışma çözeltinin 190 mcL her DNA standardının 10 mcL ekleyin.
  3. çözümü çalışma 190 mcL saflaştırılmış DNA 10 uL ekleyin. Nihai hacim 200 ul olmalıdır. 2 dakika boyunca 23 ° C'de, standart ve DNA örnekleri inkübe edin.
  4. Ekrandaki yönergeleri kullanarak florometrede DNA örnekleri daha önce standartları analiz edin.

5. Shotgun Sıralama Kütüphane Hazırlık

NOT: av tüfeği sıralama kütüphanesi kullanılarak hazırlanmıştırÜreticinin talimatlarını kullanarak ticari kütüphane hazırlık seti.

  1. 0.2 ng / ml kullanarak EB DNA örnekleri sulandırmak. Bu konsantrasyonun altında olan herhangi bir örneği, negatif kontrol, yani, mevcut konsantrasyonda bırakılır.
  2. tampon ve 5 uL enzim karışımı 10 uL saflaştırılmış DNA 5 ul karıştırın. 5 dakika boyunca 55 ° C'de inkübe edin.
  3. tampon nötralize 5 uL ilave edin ve 5 dakika boyunca 23 ° C'de çözelti inkübe edilir.
  4. Örnek özel sıralaması endekslerinin her 5 uL ve 15 uL PCR ana karışımı ekleyin.
  5. bir PCR, 10 s, 30 s boyunca 55 ° ve 30 saniye için 72 C, 95 ° C 12 döngü önce 3 dakika, 30 saniye süreyle 95 ° C, 72 ° C'de numune inkübe edin. 5 dakika boyunca 72 ° C'de son örnekleri inkübe edin.
  6. daha önce olduğu gibi, ancak EB 30 uL nihai elüsyon ile topuk kısmı arıtma ile hazırlanan DNA saflaştırılır.

6. Library Miktar ve Kalite Kontrol

NOT: hazırlanmış kütüphanelerin miktarı ve kalitesi ticari bir kit ve cihazlar kullanılarak değerlendirildi.

  1. kullanımdan önce, 30 dakika boyunca 23 ° C'de kitleri inkübe edin.
  2. 2,000 rpm'de 1 dakika için tampon ve vorteks 2 uL DNA 2 ul ekleyin.
  3. o tüpün dibinde olduğundan emin olmak için numune aşağı doğru döndürün.
  4. aracı haline örnek tüpleri, analiz bandı ve ipuçları takın ve yazılım tarafından yönlendirildiği gibi analizi gerçekleştirmek.

7. Adı geçen DNA Sekanslama

  1. 300 bp eşleştirilmiş uç sıralama 45 kullanarak bir sıralama servis ve diziye hazırlanan ve sayısal DNA dizileme kütüphaneleri örnekleri aktarın.

Ham Sıra Verilerin 8. Analiz

NOT: Linux işletim sistemini kullanan her program için komutlar protokol adımı aşağıda gösterilmiştir. s için kullanılan boru hattıSequence veri analizi, Şekil 1 'de gösterilmiştir. programlar analizden önce kullanıcı tarafından monte edilmelidir. Bu işlem, her bir örnek için tek tek gerçekleştirilmelidir.

  1. Analiz ve ileri ardından komut satırı / yol Dosyaya / fastqc için yazarak FastQC 46 kullanılarak DNA dizisi veri görselleştirmek ve ham raw_read1.fastq raw_read2.fastq okur ters.
  2. -o output_fastqc ve -f fastq ham okuma dosyalarının dosya biçimini yazarak bir çıkış klasörü belirtin.
  3. Çıktı dosyası (Şekil 2) görüntüleyin.
    yol Dosyaya / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq.

9. Kalite Kontrol Kesme ve Filtreleme Sıra Veri

  1. Komut satırı java-jar / yol Dosyaya / trimmomatic-0.35.jar içine yazarak kırpma programı, Trimmomatic 28 çalıştırın.
  2. Belirtin dosyalar 'PE' yazarak uç dosyaları eşleştirilmiş. Devlet bu 16 merkez processing birimi (CPU) -threads 16 yazarak program tarafından kullanılmalıdır.
  3. Ham ileri isimlerini yazarak QC kontrolüne iki dosyaları listelemek ve okur ters. çıkış dosyalarının önek -baseout Silaj yazarak belirlenir.
  4. ILLUMINACLIP yazarak program seçenekleri tanımlayın: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LİDERİ: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 ÜRÜN: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36.
  5. Tamamlandığında, daha önce olduğu gibi FastQC kullanılarak kesilmiş dizileri analiz ve başarılı yapılmıştır kırparak sağlamak için ham dizi verilerine çıktı karşılaştırın.
    NOT: yazılım aracı, Trimmomatic, önde gelen düşük kaliteli veya N üsleri kaldırarak daha okur kesilmiş (aşağıda kaliteli 3), düşük kaliteli veya N üsleri firar kaldırma (aşağıda kalite 3) ve her bir 4-baz geniş sürgülü pencere okumak taramaları yapılabilir. parametreler tabanı başına ortalama kalite herhangi 36 baz uzunluğunda altına okur düşmesi daha sonra 20 altına düşerse ve ne zaman kesmek için kuruldu. Son olarak, 15 baz FR kesilmiş edildiom her başkanı okumak ve okuma başından itibaren 200 üsleri korumak için kırpılmış edildi okur. Bu son adım, uzun sequencing zaman bazı kalite sorunları aşmak için yapıldı (> 200 bp) okur. Bu özel örneklerin 28 için ayarlanabilir.
    java-jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout silaj ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LİDERİ: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 ÜRÜN: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36

10. metagenome Meclisi

  1. , Eşleşmemiş kesilmiş Birleştirme eşleşmemiş okur tarafından takip kedi yazarak okur; silage_read2_unpaired.fastq silage_read1_unpaired.fastq. yazarak yeni bir dosya dosyaları yazın> silage_merged_unpaired.fastq
    cat silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq> silage_merged_unpaired.fastq
  2. De novo sıralı DNA monte etmek için, yazarak / yol-to tarafından kollar (St. Petersburg genom montajcı) 30 kullanın-dosya / spades.py. 16 CPU'lar --meta yazarak uygulanan gereken metagenomic parametresi 16 t yazarak ve kullanılacak olduğunu belirtin.
  3. ileri kesilmiş tanımlamak kullanarak -1 silage_read1_paired.fastq okur ve ters -2 silage_read2_paired.fastq tarafından okur. Birleştirilmiş çiftlenmemiş -s silage_merged_unpaired.fastq tarafından belirlenir okur.
  4. silage_spades -o yazarak çıkış klasörü tanımlayın.
    yol Dosyaya / spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades

11. Eşli uç Oku Bindirme

  1. DNA dizisinin çiftleri komut satırı / yol Dosyaya / flash içine yazarak FLAŞ (Short hızlı Uzunluğu Ayarı okur) 29 kullanılarak okur Birleştirme. 16 CPU'lar Silaj -o yazarak 16 ve çıkış öneki -t kullanılarak kullanılması gerektiğini belirtin.
  2. kesilmiş tespit silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq yazarak okur
    yol Dosyaya / flaş 1 -t6 -o silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq parladı

12. Taksonomik Sınıflandırma

  1. Tür / yol-dosya / kraken ve / yol Dosyaya / standart --db yazarak veritabanını belirtin.
  2. 16 CPU'lar --threads 16 yazarak kullanılması gerektiğini tanımlamak ve FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt --output kullanarak bir çıkış klasörü tanımlamak. girdi dosyasının adını yazın; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq
    yol Dosyaya / kraken --db standart --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq
    NOT: Kraken 7 kullanılarak monte DNA dizisi iskelelerinin sınıflandırılması mevcut tüm Prokaryot genom dizileri içeren en son standart Kraken veritabanı karşı tamamlandı.
  3. -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt> FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int kesim yazarak çıktı dosyası ve yeni bir dosya aktarma kolonlar 2 ve 3
  4. Web tarayıcısında çıktı dosyasını açın.
    -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt> FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int kesilmiş
  5. KtImportTaxonomy yazarak Kronu 12 içine yeni bir dosya aktarın. FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int yazarak giriş dosyası belirtin. FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html -o yazarak çıkış dosyası belirleyin.
    yol Dosyaya / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html

13. Fonksiyonel Notu

  1. MG-RAST 47 web sitesi, http://metagenomics.anl.gov/ gidin. Gerekirse yeni bir kullanıcı olarak kayıt. Giriş yaptıktan sonra, "Yükle" butonuna tıklayın. Adım 10 monte iskeleleri yükleyin.
  2. Dosyaları yükledikten sonra, "Gönder" ve talimatları izleyin tıklayın ve analiz tamamlanmasını bekliyor.
  3. Analiz tamamlandıktan sonra, em yoluyla gönderilen linki görmekMG-RAST dan veya alternatif ail, "İlerleme" üzerine tıklayın. tamamlanan işlerin bir listesi vardır. İlgili iş kimliği ve ardından "indirme sayfasına" bağlantısına tıklayın.
  4. indirme sayfasında, başlığı "Protein Kümelenme% 90" başlığı altında, 550.cluster.aa90.faa tahmin protein dosyasını indirmek için protein butonuna tıklayın.
  5. Olarak varsayımsal belirli bir cazy enzim sınıfa ait proteinleri sınıflandırmak için, cazy veritabanına 48 indirilen proteinleri karşılaştırın. dosyalarından enzim karbonhidrat-aktif veritabanı (cazy) indirin şunlardır: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip ve PL.zip. Bu dosyalar sırasıyla aşağıdaki enzim sınıfları temsil: Yardımcı Etkinlikler (AA), Karbonhidrat esterazlar (CE), glikosid hidrolazlar (GH), Glukozil transferazlar (GT) ve Polisakarit Liyazlar (PL).
  6. veritabanı dosyaları halletmek ve USEARCH UBLAST ALGOR kullanarak cazy veritabanı proteinleri protein benzerliği belirleyerek proteinleri açıklamaithm 49. 5 veritabanı .txt dosyaları tip yineleme yapmak (* .txt olarak i için) bash döngü kullanmak için "* .txt olarak i için; yapmak".
  7. ublast algoritmasını kullanmak için parametre -ublast ile yazarak / yol Dosyaya / usearch8 tarafından USEARCH çalıştırın. Sonra MG-RAST, "mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa" indirilen protein dizi dosyasının adını yazın.
  8. Veritabanı dosyasını belirtmek için "$ i -DB" ve 1e -5 ° e-değer eşiği belirlemek için tipini, türünü "-evalue 1e-5" kullanılacak.
  9. Bir hedef dizinin bulunmasından sonra aramayı sona erdirmek ve bu nedenle, hedef enzim sınıfına, örneğin, GH, tip 1 "-masaccepts" ait olarak, protein sekansı sınıflandırmak için.
  10. 16 CPU'lar türü kullanılan "16 -threads" ve atab ayrılmış metin türü "-blast6out" olarak çıktı dosyasının formatını belirtmek için gerektiğini tanımlamak için kullanılır. Çıktı dosya türü "$ i.ublast" tanımlamak için. t, bash döngü sona erdirmek içinYPE "; done"
    * .txt Olarak i;
    do / yol Dosyaya / i -evalue usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -DB $ 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 $ i.ublast -blast6out;
    tamam

14. görselleştirme cazy Açıklaması

  1. bash döngü kullanarak her enzim sınıfı için protein kimliği listeleri, bir Venn diyagram olarak cazy açıklama çıkışı görselleştirmek oluşturmak için. "* .ublast Içinde i için; yapmak" yazın.
  2. Çıktı dosyası ve yeni bir dosyaya sütun 1 aktarmak için yazın "kedi $ i | -f 1> $ i.list kesti".
  3. döngü ve türünü sonlandır "; done".
  4. bir metin editörü .list dosyaları açın. , Web sitesine gidin 5 gibi set sayısını seçmek ve ayrı bir kutuda her liste dosyasının içeriğini yapıştırın. Bir .SVG dosyası olarak ortaya çıkan şeması indirin.
    i * .ublast en çok;
    Kedi $ i do | kesme -f 1> $ i.list;
    tamam

Sonuçlar

Biyoinformatik işleme önce, çiğ dizisi kesilmiş edildi okur ve adaptörler Trimmomatic yazılımı 28 kullanılarak uzaklaştırıldı. Kesme ve süzme aşamasından sonra, sırayla% 50 düşürülmüştür okuma sayısı (Tablo 1) okur. Ortalama taban phred puanı (Şekil 2) kalite kontrolden geçtikten sonra> 30 idi.

Örtüşen bölgelerde tek uzun okur oluşturmak için FLASH yazılımı 29 kullanılarak birleştirildi vardı DNA dizilerinin çiftleri, örtüşmeyen ayrı bir dosyada tutuldu okur. 45.47% başarılı bir şekilde birleştirilebileceğini (105.343) okur. Üst üste binmesini takiben ortaya çıkan genişletilmiş fragmanlar Kraken yazılımını 7 kullanarak bakteriyel taksonomik sınıflandırma yapıldı ve daha sonra Kronu yazılımı (Şekil 3) ile görüntülendi, okur FLASH kullanarak okur.

Şekil 4'te görülebilir. Metagenome en bol türler Lactobacillus spp. (% 24; Firmicutes), Corynebacterium spp. (% 8, Actinobacteria'lar) Propionibakteri türleri. (% 3; Actinobacteria'lar) ve Prevotella spp. (% 3; Bacteroidetes). hastalığa yol açan hayvan sağlığı için önemli ve türleri de gözlenmiştir; Clostridium spp. (% 1), Bacillus spp. (% 0.6), Listeria spp. (% 0.2) silaj numunede mevcut olduğu tahmin edildi.

Fonksiyonel açıklama okur monte gerçekleştirildi. Metagenome kesilmiş ve filtre kullanarak Maça assembler 30 kullanılarak toplandıpaired-end ve eşleştirilmemiş 92284 iskele üreten okur. selülaz tanımlamak için, proteinler MG-RAST kullanılarak tahmin ve enzim karbonhidrat-aktif veritabanı (cazy) kullanılarak açıklamalı bulundu. 97.562 tahmin edilen protein arasında, 6357 cazy veritabanı (Şekil 5) oluşturan beş enzim sınıflarından birinde varsayımsal karbohidrat aktif enzim olarak bilgi notları eklendi. Sonuçlar birden fazla cazy enzim sınıfı ek açıklama içeren olanlar da dahil, protein ek açıklamalar dağılımını gösteren InteractiVenn yazılımını 50 kullanarak bir Venn diyagramı olarak görüntülendi. Bunlardan, 3861 glikozit hidrolaz aktivitesi için tahmin edilen ve daha fazla işlevi onaylamak için laboratuarda karakterize edilecektir.

figure-results-1
Şekil 1: Silaj Analizi için Biyoinformatik Metagenomiks Boru Hattı. Iki temel yaklaşım vardısilaj, taksonomik sınıflandırma ve fonksiyonel ek açıklama mikrobiyomları araştırmak için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: Önce tabanı Başına ve Kırpma ve Adaptör Temizleme sonra Dizisi kalitesi. FASTQC dan başına tabanı dizisi kalitesi arsa dizisinin uzunluğu boyunca ortalama phred skor öncesi ve sonrası kalite kontrol okur gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: Taksonomik sınıflaKatı Silaj bakteriyel mikrobiyomu bir yon. FLASH Kraken 7 kullanılarak gerçekleştirildi ve daha sonra kronu ile görüntülendi gelen kesilmiş ve üst üste dizinin sınıflandırılması okur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: Katı Silaj bakteriyel mikrobiyomu 4 En Bol şubelerinin taksonomik Sınıf Dağılımı. Dört en bol filum içinde bakteri her sınıfın yüzdesi. Firmicutes: Clostridia (kırmızı) ve Basiller (koyu mavi); Proteobacteria: delta / epsilon (pembe), alfa (mavi soluk), gama (turuncu) ve beta (turkuaz); Bacteroidetes: Flavobacteriia (koyu mavi) ve Bacteroidia(soluk yeşil); Actinobacteria'lar: Coriobacteriia (koyu mor) ve diğer Actinobacteria'lar (koyu yeşil). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5: Katı Silaj mikrobiyomu içinde Öngörülen Proteome cazy Açıklaması. Katı silaj mikrobiyomları tahmin proteom cazy açıklamalarla beş enzim sınıflarının dağılımını gösteren Venn şeması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

# Ham okur # Filtreli okur (eşli) # Okur parladı
(Eşli) (Çoklu)
2.374.949 x2 231.679 x2 1.892.534 105.343
# Filtreli okur

Tablo 1: Dizileme Özeti Tablosu okur.

Tartışma

Siliko analizinde bir çevresel örneklerin içinde mevcut olan mikrobiyal topluluklar için mükemmel bir fikir verebilir iken, taksonomik sınıflandırmaların ilgili kontroller ile birlikte ve sıralama uygun bir derinlik bütününü yakalamak için elde edildiğini yapılabilir göstermiştir kritik olduğunu 51 mevcut nüfus.

herhangi bir hesaplama analizi ile, benzer bir hedefe ulaşmak için birçok yollar vardır. Bu çalışmada kullanılan metodlar silaj mikrobiyomları üzerinde analizler bir dizi elde etmek için bir araya getirildi uygun ve basit yöntemler, örnekleridir. Çeşitli ve biyoinformatik araçları ve teknikleri giderek artan sayıda örneği Phylosift 8 ve MetaPhlAn2 52 için, metagenomic verileri analiz etmek için kullanılabilir ve bu numunenin kendi alaka soruşturma ve analiz req öncesinde değerlendirilmelidir53 edinilmiş. Metagenomic analiz yöntemleri sınıflandırma, sıralama derinliği ve sıralama kalitesi için kullanılabilir için veritabanları ile sınırlıdır.

Burada gösterilen biyoinformatik işleme yerel, yüksek enerjili makinede yapıldı; Ancak bulut tabanlı sistemler de mevcuttur. Bu bulut tabanlı hizmetler, uygun bir güçlü yerel iş istasyonunda yüksek maliyetli yatırımı kalmadan gerekli hesaplama gücü kiralama için izin verir. Bu yöntemin bir potansiyel uygulama bu nedenle gıda zincirine girmesini engel hiçbir zararlı bakteri mevcut olduğundan emin olmak için tarımda kullanılmadan önce silaj değerlendirmek olacaktır.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, silaj örnekleri için Andrew Bird'e ve DNA dizileme kütüphanelerinin hazırlanmasındaki yardımları için Exeter Dizileme Servisi'nden Audrey Farbos'a teşekkür eder. Exeter Üniversitesi'ndeki Exeter Sıralama Hizmeti ve Hesaplamalı çekirdek tesisler. Tıbbi Araştırma Konseyi Klinik Altyapı ödülü (MR/M008924/1). Wellcome Trust Kurumsal Stratejik Destek Fonu (WT097835MF), Wellcome Trust Çok Kullanıcılı Ekipman Ödülü (WT101650MA) ve BBSRC LOLA ödülü (BB/K003240/1).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MP Bio 116560200DNA EkstraksiyonuFastDNA SPIN Kiti
FastPrepMP Bio116004500DNA Ekstraksiyonu
Agencourt AMPure XP boncuklarıBeckman CoulterA63880DNA Saflaştırma
Elüsyon TamponuQiagen19806DNA Saflaştırma
Qubit FlorometreTermo FisherQ33216DNA Kantifikasyon
Qubit dsDNA HS TestKiti Thermo FisherQ32854DNA Miktar Tayini
Nextera XT DNA Kütüphanesi HazırlıkKiti IlluminaFC-131-1024Kütüphane Hazırlığı
Nextera XT İndeks KitiIlluminaFC-131-1001Kütüphane Hazırlama
TapeStation 2200AgilentG2964AADNA Miktar Tayini
HS D100 ScreenTapeAgilent5067-5584DNA Miktar Tayini
HS D100 ScreenTape ReaktifleriAgilent5067-5585DNA Kantifikasyonu
TapeStation İpuçlarıAgilent5067-5153DNA Kantifikasyonu
TapeStation TüpleriAgilent401428 ve 401425DNA Kantifikasyonu
HiSeq 2500IlluminaDNA Dizilimi - bir Sıralama hizmeti
Yüksek Güçlü Analiz İş İstasyonuÇeşitliYerel veya bulut tabanlı, kullanıcı tarafından tercih edilen sistem
Toprak için

Kaynaklar

  1. Riesenfeld, C. S., Schloss, P. D., Handelsman, J. Metagenomics: genomic analysis of microbial communities. Annu. Rev. Genet. 38 (1), 525-552 (2004).
  2. Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59 (1), 143-169 (1995).
  3. Human Microbiome Project Consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  4. Venter, J. C., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science. 304 (5667), 66-74 (2004).
  5. Vilanova, C., Iglesias, A., Porcar, M. The coffee-machine bacteriome: biodiversity and colonisation of the wasted coffee tray leach. Sci. Rep. 5, 17163(2015).
  6. Hayden, E. C. Technology: The $1,000 genome. Nature. 507 (7492), 294-295 (2014).
  7. Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Gen. Biol. 15 (3), 46(2014).
  8. Darling, A. E., et al. PhyloSift: phylogenetic analysis of genomes and metagenomes. PeerJ. 2 (12), 243(2014).
  9. Buchfink, B., Xie, C., Huson, D. H. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND. Nat. Meth. 12 (1), 59-60 (2015).
  10. Moreno-Hagelsieb, G., Hudy-Yuffa, B. Estimating overannotation across prokaryotic genomes using BLAST+, UBLAST, LAST and BLAT. BMC Res Notes. 7 (1), 651(2014).
  11. Hauser, M., Steinegger, M., Söding, J. MMseqs software suite for fast and deep clustering and searching of large protein sequence sets. Bioinf. 32 (9), 1323-1330 (2016).
  12. Ondov, B. D., Bergman, N. H., Phillippy, A. M. Interactive metagenomic visualization in a Web browser. BMC Bioinf. 12, (2011).
  13. Kolde, R., Vilo, J. GOsummaries: an R Package for Visual Functional Annotation of Experimental Data. F1000Res. 4, 574(2015).
  14. Reddy, T. B. K., et al. The Genomes OnLine Database (GOLD) v.5: a metadata management system based on a four level (meta)genome project classification. Nuc. Aci. Res. 43 (1), 1099-1106 (2015).
  15. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).
  16. Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J. Micro. Met. 69 (2), 330-339 (2007).
  17. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6(2014).
  18. Mikheyev, A. S., Tin, M. M. Y. A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer. Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1097-1102 (2014).
  19. Schadt, E. E., Turner, S., Kasarskis, A. A window into third generation sequencing. Hum. Mol. Genet. 20 (4), 853-853 (2011).
  20. Shapiro, B., Hofreiter, M. A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA. Science. 343 (6169), 1236573(2014).
  21. Der Sarkissian, C., et al. Ancient genomics. Phil. Trans. R. Soc. B. 370 (1660), (2015).
  22. Patin, N. V., Kunin, V., Lidström, U., Ashby, M. N. Effects of OTU Clustering and PCR Artifacts on Microbial Diversity Estimates. Microb Ecol. 65 (3), 709-719 (2013).
  23. McInroy, G. R., Raiber, E. -A., Balasubramanian, S. Chemical biology of genomic DNA: minimizing PCR bias. Chem. Commun. 50 (81), 12047-12049 (2014).
  24. Aller, P., Rould, M. A., Hogg, M., Wallace, S. S., Doublié, S. A structural rationale for stalling of a replicative DNA polymerase at the most common oxidative thymine lesion, thymine glycol. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 814-818 (2007).
  25. Ranjan, R., Rani, A., Metwally, A., McGee, H. S., Perkins, D. L. Analysis of the microbiome: Advantages of whole genome shotgun versus 16S amplicon sequencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 469 (4), 967-977 (2016).
  26. Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
  27. Li, X., Rao, S., Wang, Y., Gong, B. Gene mining: a novel and powerful ensemble decision approach to hunting for disease genes using microarray expression profiling. Nuc. Aci. Res. 32 (9), 2685-2694 (2004).
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  29. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinf. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  30. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 19 (5), 455-477 (2012).
  31. Nurk, S., Meleshko, D., Korobeynikov, A. metaSPAdes: a new versatile de novo metagenomics assembler. , (2016).
  32. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  33. Tanaseichuk, O., Borneman, J., Jiang, T. Phylogeny-based classification of microbial communities. Bioinf. 30 (4), 449-456 (2014).
  34. Bose, T., Haque, M. M., Reddy, C., Mande, S. S. COGNIZER: A Framework for Functional Annotation of Metagenomic Datasets. PLoS ONE. 10 (11), 0142102(2015).
  35. Sharma, A. K., Gupta, A., Kumar, S., Dhakan, D. B., Sharma, V. K. Woods: A fast and accurate functional annotator and classifier of genomic and metagenomic sequences. Genomics. 106 (1), 1-6 (2015).
  36. Eikmeyer, F. G., et al. Metagenome analyses reveal the influence of the inoculant Lactobacillus buchneri CD034 on the microbial community involved in grass ensiling. J. Biotech. 167 (3), 334-343 (2013).
  37. Driehuis, F., Elferink, S. J. W. H. O. The impact of the quality of silage on animal health and food safety: A review. Vet. Quart. 22 (4), 212-216 (2000).
  38. Dunière, L., Sindou, J., Chaucheyras-Durand, F., Chevallier, I., Thévenot-Sergentet, D. Silage processing and strategies to prevent persistence of undesirable microorganisms. Anim Feed Sci Technol. 182 (1-4), 1-15 (2013).
  39. Vissers, M. M. M., et al. Minimizing the Level of Butyric Acid Bacteria Spores in Farm Tank Milk. J. of Dairy Sci. 90 (7), 3278-3285 (2007).
  40. Te Giffel, M. C., Wagendorp, A., Herrewegh, A. Bacterial spores in silage and raw milk. Antonie van. , (2002).
  41. Wiedmann, M. ADSA Foundation Scholar Award-An Integrated Science-Based Approach to Dairy Food Safety: Listeria monocytogenes as a Model System. J. of Dairy Sci. 86 (6), 1865-1875 (2003).
  42. Low, J. C., Donachie, W. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. Vet J. 153 (1), 9-29 (1997).
  43. Schoder, D., Melzner, D., Schmalwieser, A. Important vectors for Listeria monocytogenes transmission at farm dairies manufacturing fresh sheep and goat cheese from raw. J.Food. , (2011).
  44. Lindström, M., Myllykoski, J., Sivelä, S., Korkeala, H. Clostridium botulinumin Cattle and Dairy Products. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 50 (4), 281-304 (2010).
  45. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456 (7218), 53-59 (2008).
  46. Andrews, S. Babraham Bioinformatic- FastQC: A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. , (2015).
  47. Keegan, K. P., Glass, E. M., Meyer, F. FMG-RAST, a Metagenomics Service for Analysis of Microbial Community Structure and Function. Methods Mol. Biol. 1399, Chapter 13 207-233 (2016).
  48. Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nuc. Aci. Res. 37, Database issue 233-238 (2009).
  49. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinf. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  50. Heberle, H., et al. InteractiVenn: a web-based tool for the analysis of sets through Venn diagrams. BMC Bioinf. 16 (1), 213(2015).
  51. Ni, J., Yan, Q., Yu, Y. How much metagenomic sequencing is enough to achieve a given goal. Sci. Rep. 3, 1968(2013).
  52. Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nat. Meth. 12 (10), 902-903 (2015).
  53. Oulas, A., et al. Metagenomics: tools and insights for analyzing next-generation sequencing data derived from biodiversity studies. Bioinform Biol Insights. 9 (9), 75-88 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Shotgun SekanslamaSilaj MikrobiyomuMikrobiyal ToplulukDNA EkstraksiyonuTaksonomik S n fland rmaFonksiyonel A klamaBiyoenformatik Ara larDNA Sekanslama K t phanesiKarbonhidrat Aktif Enzimler
Yemlerin metagenomic Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.