Method Article

Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanılarak Sıvı Nano-ölçekli Nesnelerin dinamik Süreçlerinin İncelenmesi

DOI:

10.3791/54943

⸱

February 5th, 2017

 , 
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, nano ölçekli dinamik süreçleri gözlem için kullanıldığı şekilde, su içinde AuNPs transmisyon elektron mikroskobu için bir sıvı akımı numune tutucu çalışmasını açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tamamen sıvı içinde gömülü Örnekleri Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) ve KÖK için numune tutucuya monte mikroakışkan odasını kullanarak tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (STEM) ile nano ölçekli mekansal çözünürlükte incelenebilir. mikroakışkan sistem ince Silikon Nitrür (SİN) membran pencereleri destekleyen iki silikon mikroçip oluşur. Bu makalede, örnek yükleme ve veri toplama temel adımları açıklar. En önemlisi sıvı bölmesine doğru bu şekilde ince bir sıvı tabakasını ve bir vakum sızdırmazlık sağlayan, monte sağlamaktır. Bu protokol, aynı zamanda, doğru montaj sağlamak üzere Numune yükleme işlemi esnasında yerine getirmek için gerekli bir test de içerir. Örnek elektron mikroskobu ile yüklendikten sonra, sıvı kalınlığı ölçülür gerekmektedir. Bir çok ince sıvı bir balon oluşturulur olduğu gibi sıvı olmadan, gösterebilir ise hatalı tertibatı bir çok-yoğun bir sıvı ile sonuçlanabilir. Son olarak, iletişim kuralıele alınabilir nasıl görüntüler alınır ve ne kadar dinamik süreçler açıklar. AuNPs ihtiva eden bir numune, saf su ve tuzlu su içinde hem olarak görüntülenir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel tarama transmisyon elektron mikroskopisi (STM) analizi için uygun örnekler, yüksek vakum altında bir yerleşim için uygun olan, özellikle kuru, katı numuneler aralığı ile sınırlıdır. Ancak, birçok bilimsel ve teknolojik sorular nano ölçekli malzeme ve sıvı ortamda süreçleri ile ilgilidir. Tamamen sıvı içinde gömülü Örnekleri şimdi Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) ve KÖK 1 numune tutucuya monte mikroakışkan odasını içeren bir kavram kullanarak KÖK ile ele alınabilir. Bu büyüme, fesih ve nanopartiküllerin 2, 3, 4, 5 toplama süreçleri, 6 dahil olmak üzere çeşitli araştırma konularının önemli süreçler, yeni bir bakış açısı sağladığından Bu yeni geliştirilmiş bir tekniktir, giderek daha popüler hale gelmiştir. Sadece metallerin, aynı zamanda biominerals 7 ve biyolojik sistemler 8, 9, 10, 11 incelenebilir. Sıvı faz KÖK örnek yükleme ve görüntü elde etme kuru örneklerin KÖK için farklıdır ve özel eğitim gerektiren bir protokol içerir.

Mikroakışkan sistemi (Şekil 1A bakınız) Silisyum nitrür enerji 12 200 keV de elektron ışını için saydam (SİN) membran pencereleri destekleyen iki silikon mikroçip oluşur. Boyutların ve bu mikroçip işleme Detayları, 13 başka yerde 12 bulunabilir. Numune genellikle nano ölçekli nesneleri içerir. Bu yazıda altın nanopartiküller (AuNPs) gözlendi. AuNPs (aşağı doğru yolculuk elektron ışını ile ilgili olarak) en üst pencerede hareketsiz ya LIQU floatİD. KÖK içinde nano ölçekli uzamsal çözünürlük AuNPs üzerinde elektron ışını tarama ve Annüler Karanlık Alan (ADF) detektörü 9 kullanılarak iletilen dağınık elektronları toplayarak elde edilir. İki mikroçipler sıvı akış TEM tutucu 1 (tutucu hem STEM için çalışır ve TEM ama TEM sahibi olarak anılacaktır) ucuna küçük bir yuvaya yerleştirilir. bir sıvı bölmesi mikroçip arasında oluşturulmuş şekilde mikroçip biri bir aralayıcı içerir. İki mikroçip her iki O-halkaları sıvı bölmesine 13 (Şekil 1B'ye bakınız) vakum sızdırmazlığı sağlar.

Bu makalenin amacı, ilgilenen kullanıcılar bu yeni yeni tekniğin kolay erişim bulabilirsiniz böylece örnek yükleme ve veri toplama temel adımları göstermektir. Belirli Company'den temin edilebilen bir sistem kullanılır, ancak protokol aynı zamanda diğer şirketlerin sistemleri için de geçerlidir. tekniktirbir sıvı tutucu sistemi 13 ile çalışırken geleneksel TEM ve STEM ve pratik yönlerini bir dizi daha karmaşık dikkate alınmalıdır. En önemlisi sıvı bölmesine doğru bu şekilde ince bir sıvı tabakasını ve bir vakum sızdırmazlık sağlayan, monte sağlamaktır. Bu nedenle, temiz çalışma ve sıvı akış TEM tutucu hazırlanması ve montaj sırasında toz oluşumunu önlemek için önemlidir. Özellikle, O-ring ve iki silisyum mikroçip tüm kirleticilerden arınmış olması gerekir. mikroçip birinde toz Hatta küçük parçacıklar ciddi yararlı bir uzamsal çözünürlük ulaşılmasını önleyebilir monte hücrenin, kalınlığını artırabilir. kontaminasyon veya hasar deney sonrasında elektron mikroskobu bırakılabilir, böylece bir vakum mühür önemlidir. Bu protokol yükleme işlemi ve birkaç gerekli testleri açıklar. Elektron mikroskobu çalışması basittir, bukatı numunelerin mikroskopi ile karşılaştırıldığında bazı ekstra adımları gerektirir t. Sıvı kalınlıkları artmasıyla, daha fazla elektron emilir ve sıvı tarafından dağınık; Sıvı kalınlığı ölçüm gereklidir. Son olarak, protokol ele alınabilir nasıl görüntüler alınır ve ne kadar dinamik süreçler açıklar.

figure-introduction-1
Şekil 1: Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu (STEM) için sıvı Akış Hücresi. (A) monte sıvı hücrenin şematik gösterimi. Silikon Nitrür (SİN) zar pencereli iki silikon mikroçip iki O-halkaları arasında konumlandırılmış. Sıvı SİN zar arasında bulunan ve böylece elektron mikroskobunda vakum ayrılır. numune üzerinde bir odaklanmış elektron ışını tarar. Kontrast dağınık elektron elde edilir. Altın nanopartiküller (AuNPs) SİN membran sıvı içinde hareketsiz ama aynı zamanda hareket edebilensıvı. O-ring ile birlikte, iki mikroçip istifinin (B) şematik yandan görünüşüdür kesitidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Şekil 2: Si mikroçipler ve Temizleme İşlemi. (A) İki bardak aseton ve etanol, her 40-60 mL ile doldurulur. (B) Si mikroçip aseton ile dolu bir beher yerleştirilir. SİN membran ile tarafı yukarı bakmalıdır. İki Si mikroçip yansıması açıkça iki mikroçip arka tarafındaki oluk gösterir. (C), 2 dakika sonra, Si mikroçip etanol ile doldurulmuş ikinci bir behere aktarılır. başka bir 2 dakika sonra, Si mikroçip kurutma için bir temiz oda doku aktarılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-protocol-2
Şekil 3: Sıvı Akış Transmisyon Elektron Micfloroskop (TEM) Tutucu Ekipmanları. (A) plastik boru ve sıvı akışı için bir şırınga ile sıvı akışı TEM tutucu. (B) tutucu milinden kaldırıldı sıvı akış TEM sahibinin ucu, sıvı hücre bölmesi, O-ring ve iki silikon mikroçip kapağı. boru ucu sol kanattan gelen çıkıntı. (C) bir O-ring, mikroçip yerleştirme yuvayı gösteren sıvı hücre bölmesi. (D) tozsuz bir yüzeye (alüminyum folyo) Farklı cımbız. (E) iki O-ring ile sıvı hücre bölmesinin kapağı. (F) SİN membran pencereli iki silikon mikroçip. Sol: Bir ara parçası olmadan örnek mikroçip; Sağ: 200 mikron ayırıcı ile kapak mikroçip. (G) bir mikroakışkan pompa sistemi. Bu figu büyük halini görmek için buraya tıklayınızyeniden.

Mikroçip 1. Hazırlık

Mikroçip 1. Temizleme

  1. Bir toz partikül filtresi ile laminar hava akımı kaputu düşük toz seviyesine sahip bir çalışma alanı hazırlayın.
  2. yerleştirme ve mikroçip taşınması için bir lif içermeyen doku ve saf etanol ile bir ışık mikroskobu cam slayt temizleyin. Petri kabı bir temiz oda doku cam slayt yerleştirin.
    NOT: Her zaman teknik etanol kullanmaktan kaçının.
  3. Numune yerleştirme için (bir ayırıcı olmadan) 5 baz mikroçip ve 200 nm kalınlığında bir ayırıcı ile 5 mikroçip seçin.
    NOT: Pencere boyutları 20 x 400 mm 2 ve SiN kalınlığı 50 nm. boyutları hakkında bazı tolerans olduğundan, bir ışık mikroskobu kullanılarak boyutlarını kontrol edilmesi önerilir.
  4. depolama kutusundan mikroçip kaldırmak ve cam slayt üzerine koyun karbon kaplı cımbız kullanın. kendi lo sıkıca ama dikkatle mikroçip tutng taraf. SİN membran tarafı daima yukarı bakacak şekilde mikroçip anlaştım.
    NOT: Üst tarafta kırılgan SiN zarı dokunmaktan kaçının. Ayrıca mikroçip üzerinde veya daha sonra sızıntılara karşı ikamet silikon parçacıklar nedeniyle sorunlara neden olabilir onların keskin kenarlı, çatlamasını önlemek için mikroçipler taşıma ile dikkatli olun.
    NOT: yapışkan yüzeyden mikroçip kaldırmak için prosedür için Eğitim (ucuz) kukla mikroçipler üzerinde yapılabilir.
  5. bir petri çanağı bir temiz oda doku üzerine mikroçip yerleştirin. çanak kapatın ve davlumbaz transfer.
    NOT: aseton içeren adımlar kimyasal güvenliği için davlumbaz yapılmaktadır.
  6. iki adet 120 ml'lik cam beher alın. bir aseton ile Beheri ve onları temizlemek için etanol ile diğer durulayın. aseton 40-60 mL ilki ve etanol 40-60 mL diğer doldurun.
    NOT: protokolde bu adım için de HPLC dereceli sıvıları kullanmak önemlidir.
  7. transferKoruyucu çıkarmak için aseton ile behere mikroçip katman karşı. Yavaşça etkili bir mikroçip durulama elle beher taşıyabilirsiniz, ancak ters mikroçip çevirmek için dikkatli olun - bakınız Şekil 2.
  8. 2 dakika sonra, mikroçip kaldırmak ve hızlı bir şekilde etanol ile beher içine aktarabilirsiniz. Yavaşça karşı tabakanın herhangi bir kalıntıyı temizlemek için 2 dakika süreyle etanol ile elle beher hareket ettirin. alüminyum folyo ile örtün beher ve laminer hava akışı tezgah aktarın.
    NOT: mikroçipler enkaz birikimi önlemek için aktarım sırasında kurumasına izin vermeyin.
  9. kaptan mikroçip çıkarın ve yeni bir temiz oda doku üzerine koyun. Birkaç dakika kurumasını bekleyin ve Petri kabındaki ışık mikroskobu cam slayt üzerine mikroçip aktarın.
    NOT: Islak mikroçip kolayca ters çevirin, etrafında çevirmek, ya da serbest bırakılması sırasında cımbız sopa olabilir. Bu pres ile önlenebilirfiltre kağıdı üzerinde usulca mikroçip şarkı ve yatay yönde uzak cımbız çekerek.
  10. petri kapatın ve plazma temizleyici mikroçip aktarın.
  11. Plazma temizleyici içine mikroçipler ile cam slayt yerleştirin. silisyum nitrür membran hidrofilik yüzeyini işlemek için 5 dk temizleme programını çalıştırın ve hidrokarbonları çıkarmak için.
    NOT: Bizim plazma temizleyici uygulanan uygun ayarlar şunlardır: 70 mTorr'luk, O 2 için 11,5 sccm'lik ve Ar için 35.0 sccm'lik, 50 W ileri Radyo Frekans (RF) hedefin, 5 W RF aralığının gaz akışı ve maksimum RF yansıtıyordu. yüzey şarjı indükleyebilen herhangi plazma uygundur.
  12. , Petri geri mikroçip ile cam slayt koymak kapağını kapatın ve ışık mikroskobu transfer.
  13. Mümkün zar yırtığı veya kalan kir partikülleri için bir ışık mikroskobu altında mikroçip inceleyin. Pencere alanları ile özel özen ve ar gösteren küçük noktalar kontrolMembranın upture. Hasarlı zarlarla mikroçip Dismiss.
  14. petri kapatın ve laminer hava akışı tezgah saklayın.

Mikroçip üzerinde numunenin 2. Hazırlık

  1. ~ 3 M arasında bir konsantrasyonda 30 nm çapa, sitrat stabilize AuNPs ihtiva eden stok çözeltiler küçük miktarlarda karıştırılmasıyla bir sulu AuNP çözeltisi (Sitrat stabilize edilmiş) hazırlanması
  2. damlacık uygulama / numune birikimi için bir taşıma kutusunda temiz, yapışkan yüzeyde mikroçip yerleştirin.
  3. Taze plazma temizlenmiş mikroçip SİN membran tarafında örnek solüsyon bir damlacık (1-2 uL) yerleştirin (bir ayırıcı olmadan bir mikroçip kullanın) ve laminer hava akışı tezgah çözüm kurumaya bırakın.
    Not: Bu prosedür, SıN zar üzerinde AuNPs konsantrasyonunu arttırmak için tekrar edilebilir.
  4. Tuz ve / veya yüzey aktif maddelerin çıkarılması için mikroçip iyondan arındırılmış su, 1 uL uygulanır. 30 sn sonra, dikkatlicefiltre kağıdı ile su damlacığı kaldırın. mikroçipler laminer hava akışı tezgah havada kurumasını bekleyin.
    Not: AuNPs yeterince çok sayıda mikroçip yapışmış olacak ve bir daha uzak su ile yıkanır edilmez.
  5. SİN zamanla hidrofilik hale yüzey özelliklerini kaybeder gibi sıvı bir deney sırasında farklı davranmaya neden olabilir, 4 saat içinde hazırlanan örnek mikroçip kullanın. Not: Daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın.
  6. depolama ve mikroçip transferi için kapalı bir taşıma kutusu kullanın.

Sıvı Akış TEM Holder 2. Hazırlık

  1. Sıvı akış TEM yuvasını temizleme
    1. ultrasonik banyoda aseton ve etanol kullanılarak vakum parçaları ile temas halinde olması ve çalışma tezgahı üzerine yerleştirilen yeni alüminyum folyo bir parça tarafından sağlanan tozsuz yüzeye koyun tüm araçları (cımbız ve bir tornavida) temizleyin. eldiven ile çalışmaksıvı akış TEM sahibinin kirlenmesini önlemek için.
      NOT: Bir de vakum parçaları ile çalışmak için temiz olduğundan emin ise araçlar yoğun temizlenmesi gerekmez. bir vakum parçaları dokunmadan ekipman taşıma kapasitesine sahip olup olmadığını Eldiven önlenebilir.
    2. Sıvı haznesi ihtiva eden tutucu ucu gözlemlenebilir şekilde binoküler ışık mikroskobu altında sıvı akış TEM tutucu yerleştirin. Şekil 3'e bakın.
    3. tutucu ucu kapağını kaldırın ve tozsuz bir yüzeye yerleştirin.
      NOT: titanyum kapak cımbız gibi sert malzemelerin yol açtığı çizilmelere karşı duyarlıdır. Duyarlı malzemeler için, polimer kaplı cımbız kullanılması önerilir.
    4. Saf su, en az 1-2 mL (HPLC sınıfı) hazırlayın.
      NOT: Bir HPLC-grade sıvı kullanmayın etmezse, o zaman kontrol etmek için tavsiye edilir muhtemelen akış sisteminin takunya yol açabilecek mikro parçacıklar içermez kullanılan sıvılar; filtER sıvının bir mikro-gözenekli filtre ile gerektiği şekilde.
    5. Saf su 0.5 mL ile bütün akış sistemi temizlemek için bir cam şırınga (1 mL) içinde kullanın. Mikroakışkan şırınga pompa sistemi kullanılması tavsiye edilir. sıvı hücre bölmesine püskürtülmekte olan sıvı çıkarmak için bir pipet ve / veya filtre kağıdı kullanın. Sıvı akışı için tüm boru test edin. Filtre kağıdı ve / veya bir pipet kullanılarak daha sonra tutucu ucu kurutun.
    6. sahibinin ucu temiz ve kuru olduğundan emin olun ışık mikroskobu kullanın. Gerekirse, kurutulmuş çözüm tarafından geride bırakılmış olabilir herhangi bir katı artıkları çıkarmak için su veya etanol ile sahibinin ucu yıkayın. toz parçaları veya liflerin kalıntılarını da ayrılması. Dikkatle, cımbız ile bu parçaları kaldırmak ve böylece titanyum yüzeyi çizilmeye kaçınarak. Ayrıca O-ring oluklar içini kontrol edin ve temiz oda küçük bir doku parçası ile sıvı kalıntılarını ortadan kaldırmak.
      NOT: tutucu Bu prosedür ile temiz olmaz, o zaman tavsiye edilirtutucudan ucu kaldırma ve bir ultrason banyosu kullanılarak 2 dakika kızartıldı ve bir 2 dakika boyunca etanol, aseton içinde temizlenir.
    7. Işık mikroskobu altında diğer tüm uç kısımlarını (O-halkaları, kapak ve vidaları) kontrol edin ve vb toz, lifler, kaldırmak ...
      NOT: Bazen, vida ya da Si mikroçip kaynaklanan küçük parçalar da kaldırılması gerekir. Gerekirse, kısaca HPLC-grade etanol ile vakum parçaları temizlemek. uç açıklandığı gibi kapak ve vidalar, ultrason kullanılarak temizlenebilir. onların vakum sıkılığı azalan, zamanla o-ringler kırılgan hale getirebileceğinden, etanol sıkça O-halkalarını yerleştirmekten kaçının. Sistem vakum gres olmadan çalıştırılır, ancak sızdırmazlık sorunları ortaya çıkarsa, vakum gres kullanılabilir.
    8. sahibinin ilgili olukları içine O-ringleri tekrar yerleştirin ve uygun ve oluğun her tarafında çıkıntı olmadığını kontrol edin.
    9. Numune yükleme kadar tozdan sıvı akış TEM tutucu tutmak (örneğin.,) Alüminyum folyo ile kaplayıp.
  2. Sıvı akış TEM tutucu Montaj
    NOT: Aşağıdaki prosedür KÖK için optimal yönlendirme ile numune tutucu içinde mikroçip yükleme prosedürü anlatılmaktadır. Bu yapılandırmada, numune ile baz mikroçip kez mikroskop transfer üst mikroçip olacaktır. Şekil 4'e bakınız. TEM, en yüksek uzamsal çözünürlük aşağı doğru hareketli elektron ışını ile ilgili olarak, sıvı hücrenin alt kısmında elde edilir. Böylece, mikroçipler başka bir yol monte edilecektir.
    1. Uzun tarafında örnek mikroçip kapmak ve sıvı akış TEM sahibinin ucu yuvaya (cep) içine yerleştirmek için kavisli cımbız kullanın. yukarı bakacak şekilde SİN tarafını tutun. binoküler ışık mikroskobu kullanılarak yuvaya mikroçip doğru yerleşimini kontrol edin.
      NOT: mikroçip altında O-ring doğru yerleştirilmiş değilse, mikroçip f çıkıntı yapabiliryuvayı rom.
    2. bir mikropipet kullanarak örnek mikroçip üzerinde deney için filtrelenmiş sıvının 0.3 uL bir damlacık yerleştirin. Gerekirse, damlacık kılcal güçleri kendi cebinden mikroçip çekin olabilir, cımbız ile yerde mikroçip düzeltmek.
    3. İkinci mikroçip (boşluk tabaka ile bir) almak için ters kavisli cımbız kullanın. Dikkatle ters mikroçip çevirin. yuvaya baz mikroçip üzerinde boşluk mikroçip yerleştirin.
      NOT: Bu prosedür örnek mikroçip üzerinde damlacık kurumasını önlemek için yeterince hızlı yapılması gerekiyor.
    4. numune tutucu ucu altındaki ışığı yansıtan malzemeden bir parça hareket ederken bir binoküler ışık mikroskobu kullanılarak doğru yerleştirilmesi kontrol edin. Her iki mikroçipler SİN pencerelerin en üst üste elde etmek için paralel tam hizada olmalıdır.
      NOT: Windows örtüşmeyen durumda, mikroçipler bir ucu ile bir tarafında basarak tekrar konumlandırılabilirSİN membran kolayca zarar görebilir olarak cımbız, ama çok fazla mikroçip hareketli kaçının. Bazı mikroçipler (bir mikroçip penceresi diğer mikroçip pencereye dik) bir çapraz yapılandırmayla gelir; Bu yapılandırma, iki mikroçip uyum kolaylaştırır ama aynı zamanda elektron mikroskobu görüş alanını azaltır.
    5. Cımbız ile numune haznesi kapağının ön tarafına çekmek ve baş aşağı çevirin. mikroçipler dokunmadan, ucunda kapağın arka tarafını yerleştirin. Yavaş yavaş kapağı tamamen cımbız alt dalı üzerinde durmaktadır şekilde cımbız açın. iki mikroçipler üzerinde oturana kadar dikkatlice kapağı indirin. Cımbız çıkarın.
    6. Her iki mikroçip pencere hizasını tekrar kontrol edin. Gerekirse, kapağı kaldırmak mikroçip konumlandırma ayarlayın ve tekrar kapağı yerleştirin.
    7. Vidaları yerleştirin ve her zamanki yerlerde bunları düzeltmek. İki pencere hizasını kontrol edin. benf gerekli vidaları tekrar kaldırmak ve mikroçip ayarlayın.
      NOT: Bu zarar verebileceğinden, çok sıkı vidaları düzeltmek etmeyin. Vakum mühür vidaları sadece sıkın zaman elde edilir.
    8. 4 uL / ​​dakika akış hızı kullanılarak sistemi üzerinden sıvı akışını başlatarak sızdırmazlığını kontrol edin. hiçbir sızıntı ucunun iki tarafında görülürse, bu vakum sızdırmazlığı iyi bir göstergesidir.
    9. Vakum pompası istasyonu tutucu aktarın ve vakum sızdırmazlığı kontrol edin. Vakum seviyesi pompalama 5 dakika içinde en az 10 -5 mbar ulaştırılması gerekmektedir.
      NOT: Bu kullanım öncesinde bir kukla tutucu ile pompa istasyonu test etmek için tavsiye edilir.
    10. toz toplama önlemek için kendi muhafaza elektron mikroskobu sahibinin aktarın.
      NOT: Her ticari tutucu bir muhafaza ile birlikte geliyor.

Sıvı içinde bir numunenin 3. KÖK

  1. KÖK için elektron mikroskobu ayarlanması NOT: Bu protokol açıklanan elektron mikroskobunun çalışma kılavuzdaki bulunabilir standart prosedürler dayanmaktadır. protokol sıvı numuneler üzerinde veri toplama için standart prosedürler ötesinde gerekli detay açıklar.
    1. hizalanmış KÖK modu ile mikroskop başlayın. numune tutucu olarak, AuNPs ince bir karbon film oluşan bir test örneği yerleştirin. aşağıdaki gibi KÖK mikroskop ayarları yapın: 0.18 nA prob akımı ve 4C bir nokta boyutu ve 30 mikron objektif diyafram seçerek 20 mrad elektron ışınının yakınsama yarı açısını ayarlamak. 8 cm kamera uzunluğunu seçin.
    2. ADF dedektörü takılıyken floresan ekranında ölçülen gösterilen akım yoğunluğunun not edin. Numune tutucu çıkarın.
      Not: Bu akım değeri sıvının kalınlığını tahmin etmek daha sonra ihtiyaç vardır.
    3. saf su, sıvı akışını başlatmak. 2 akışını aşılmamalıdıruL / dak.
    4. elektron mikroskobu sıvı akış TEM tutucu yerleştirin ve tahliye başlar. prevakumlu odasının vakum göstergesi ve tahliye süresini hem de kontrol edin. Vakum seviyesi standart ve pompalama prosedürün süresi iki faktörü ile (yaklaşık 1 dakika), normal tahliye süresi aşmıyorsa, tutucuya yerleştirin.
    5. Ana numune odasının vakum onun açılmasına izin aralığında olduğunda ışın vanasını açın. ADF düğmesine basarak ADF dedektörü yerleştirin.
      NOT: Bu protokol elektron mikroskobunun fosfor ekran üzerinde konumlandırılmış bir ADF dedektörü anlamına gelir.
    6. 512 x 512 piksel bir görüntü boyutu, 2 ms'den piksel bekleme süresi ve 20,000 büyütme kullanarak sürekli görüntü elde etme modunda mikroskop ayarlayın. x ve y yönlerinde sahne çevirerek SiN penceresinde arayın.
      NOT: mikroçipler tespit doğru numune geçen herhangi elektronları engellemekveya; Sinyal SiN bulunduğu yerde görülebilir. Şekil 5'e bakınız. Bazen, floresan ekran görüntüleyerek SiN pencere bulmak daha kolaydır.
    7. Pencere bulunduktan sonra, pencerenin kenarına görünür hale gelir, böylece (ilgili düğmeleri kullanarak) kontrast ve parlaklık ayarlarını yapın. numune aşamasının x ve y-çeviri düğmelerine basarak görüş alanının ortasına doğru kenarını taşıyın. objektif lens sıfırlama düğmesine basın.
      Not: Parlaklık büyük ölçüde sıvı içinde güçlü bir saçılma nedeniyle bir vakum numunesine göre düşürülmelidir.
    8. kaba örnek aşamasında dikey konumunu (z-çeviri) ayarlayarak SiN penceresinin kenarında keskin köşe odaklanarak devam edin. Örnek pozisyonu 5 ° sahne dönen ve geri çevirerek eucentric yükseklikte olduğundan emin olun. numune ve SİN penceresinin köşesinde Özellikleri düşük büyütmelerde vardiya olmamalıdır.
    9. Yine görüntüleme alanının ortasında pencere kenarına yerleştirmek için gerektiği gibi dikey konumunu yeniden ayarlayın. Yazılımın mağaza düğmesini kullanarak aşamada pozisyonunu saklayın.
    10. Enkaz veya yüksek kontrast (örn AuNPs) diğer nesnelerin küçük parçalar x ve y yönlerinde sahne çevirerek mevcut bir konuma taşıyın. tüm nesneleri odak keskin görünmesini sağlayacak şekilde objektif lens odağı ayarlayın.
    11. sıvı tutucu içinden ve ADF dedektör açılması yoluyla iletilen akım gösteren işletim yazılımı ile görünür fosfor ekrana ölçülen akım yoğunluğu, not edin. Denklem 1. Sıvı kalınlığı tespit edilmiştir ve 3 mikron aşmaması halinde devam edin kullanarak sıvı hücre kalınlığı hesaplayın.
      14 kullanılarak örnek olmadan ölçülen akım yoğunluğu oranı ile tespit edilebilir
      figure-protocol-3 denklem 1
      t amorf silisyum nitrür membran ve t su su tabakasının kalınlığı kalınlığı günah. Ortalama serbest yol 35 mrad 14 yarı açılma açısı dedektör l SiN = SiN 0.79 mikron, = ve l suya su = 3.0 mikron tutarı uzunlukları.
    12. Dikkatle gaz kabarcıkları mevcut değildir olduğundan emin olmak için, düşük büyütmede sıvı gözlemlemek. Gaz kabarcıkları sürekli likit akışı kullanılarak ve geçerli daha düşük 0 5 nA sonda ile önlenebilir.
    13. en az 20 AuNPs ha içeren bir alana kadar x ve y yönlerinde sahne Çeviris bulundu. 1024 x 1024 piksel görüntü boyutu, 19 us piksel bekleme süresini ve 400,000 büyütme ayarlayın. edinim düğmesine basarak SiN zara yapışık AuNPs görüntüleri elde edin.
      NOT: görüntüleri hangi AuNPs güçlü kontrast ve keskin kenarlardan (bakınız Şekil 6) ile görünür elde edildikten sonra, tek bir deneme doğru şekilde kurulduğundan emin olabilirsiniz. beklenmeyen bir sorun ortaya çıkması durumunda, denemeye devam ama nedenini çözmek için emin yapmazlar.
  2. AuNPs çözünme KÖK
    1. mikroskop sıvı akış TEM yuvasını çıkarın ve sıvı akışını durdurun.
    2. cam şırınga HPLC dereceli su içinde sodyum klorür 0.1 M bir çözeltisi, en az 1 ml hazırlayın.
    3. 20 uL / ​​dakikalık bir hızda, akış sistemi ayarlamak ve tuzlu su çözeltisi 0.3 mL ile bütün akış sistemi yıkayın. sıvıyı toplamak için filtre kağıdı kullanın çıkartılmadanHortumun diğer ucunu. Daha sonra, 2 mL / dk akış sistemi yeniden ayarlayın.
    4. binoküler ışık mikroskobu kullanılarak SiN penceresinin bütünlüğünü kontrol edin. Hiçbir sızıntı görülürse, mikroskop içine sıvı akış TEM tutucu takın.
    5. ön vakum odasının vakum göstergesi ve tahliye süresini kontrol edin. Vakum seviyesi standart ise ve pompa prosedürün süresi yuvasını, iki kat (yaklaşık 1 dakika), normal tahliye süresi geçmeyen
    6. saklanan sahne konumunu kullanarak geri önceki konumuna mikroskop sahne arkasını taşıyın. 512 x 512 piksel bir görüntü boyutu, 2 ms'den piksel bekleme süresi ve 20,000X bir büyütme kullanarak sürekli görüntü elde etme modunda mikroskop ayarlayın. adımlarda 3.1.7-3.1.9 açıklandığı gibi, kontrast, parlaklık, odak ve eucentric yüksekliğini ayarlayın.
    7. x ve y yönlerinde sahne çevirerek ilgi bir yer bulun. Görüntü boyutunu ayarlamak1024 x 1024 piksel, 2 us piksel bekleme süresi ve 500.000 büyütme. Bir önceki görüntü kaydedilmiştir kez elle toplama düğmesine basarak KÖK görüntüleri bir dizi kaydedin.
      NOT: AuNPs kısa sürede elektron demeti numune üzerinde taranır olarak çözmek için başlar. Işınlanmış alanı dışındaki parçacıkların etkilenmez ve hemen sonra görülmektedir. Zaman damgası görüntü başlığında saklanır. Bir film haline görüntüleri bir dizi otomatik toplanması için yazılım kullanımı da mümkündür.
  3. Sökme ve deneyden sonra TEM tutucu temizlik
    1. Sıvı faz TEM deneyleri tamamlanır ve tutucu elektron mikroskobu çıkarıldıktan sonra, ileride deney etkileyecek bir katı parçacıkları veya kalan tuzu uzaklaştırmak için boru, sıvı haznesi ve bileşenleri temizleyin.
    2. hala sabit şekilde hafifçe arka vidayı gevşetinancak yuvaya kapağı kolayca çıkarılabilir. Ön vidayı gevşetin çıkarın ve tozsuz bir ortamda yerleştirin.
    3. kapağını çıkarın ve depolama için tozsuz bir ortamda yerleştirin.
    4. cebinden iki mikroçip çıkarın. dikkatli bir şekilde su içinde ya da deney kalan çözelti içine daldırılmasıyla ayırın. yukarı SİN membran tarafı ile doku kağıt üzerinde mikroçip yerleştirin ve daha fazla analiz için havada kurumaya bırakın.
    5. O-halkalarını çıkartın ve HPLC-grade su ile ilgili oluklar temizleyin. tozsuz bir ortamda O-halkalarını saklayın.
    6. HPLC-grade 5 mL su Tüm boru (giriş ve çıkış), her bir temizlemek için bir cam şırınga (5 mL) eritilir. TEM tutucu ucu altına yerleştirilen küçük bir beher ile sıvı toplayın. Yıkama işleminden sonra, bir sıvı bölmesi kalan sıvının çıkması için bir pipet ve / veya filtre kağıdı kullanırlar.
    7. TEM sahibinin ucu kontrol edin ve silikon mikro kırık kenarları gibi artıklarını ortadan kaldırırçipler, elyaflar, veya toz. Tuz hala görünür ise, temizleme işlemi tekrarlayın. kendi oluklar O-halkalarını dönün.
    8. TEM tutucu ve tozsuz bir ortamda bileşenlerini saklayın.
  4. 3.2 Prosedür alternatif: altın nanopartiküller hareketli KÖK
    NOT: farklı montaj işlemi sıvı AuNPs hareketini çalışma gereklidir.
    1. adımı 1.2 atlayın. hemen adımda 2.2 TEM Tutucu koymadan önce silikon mikroçip üzerine AuNPs yükleyin. SİN zara AuNPs güçlü bir ek önlemek için her zaman bir sıvı tabaka ile kaplı örnek tutun. Protokolün diğer adımlar aynıdır. KÖK görüntüleri bir dizi aşama 3.2.6 elde edilir.

figure-protocol-4
Şekil 4: Sıvı Akış TEM Tutucu Montaj. (A) th sıvı hücre bölmesionun oluk yerleştirilen e küçük O-ring. içerlek üstten görünüşünü göstermektedir. (B) temel mikroçip, ilgili yuvaya yerleştirilir. ilave mikroçip ışık yansıması görülebilir bu açı yandan görünümünü göstermektedir. (CD), çözeltinin bir damlacık mikroçip eklenir. Kapak mikroçip (EG) Yerleştirme. Sıvı hücre bölmesine kapağının (HI) yerleştirilmesi. Iki vida ile kapağın (J) Tespit. (K) sıvı akış TEM tutucu Montajlı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-protocol-5
Şekil 5: İlk Konumlandırma ve KÖK mikro fotolar kullanarak Odaklama. SİN penceresini bulmak için (A), sahne parlak sig doğru hareket ettirilirnal. Bazı elektronlar pencereye yakın geçmesi için silikon mikroçip yeterince ince. (B) koyu (daha az saçılma) SİN membran penceresinde parlak görünen bazı AuNPs gösteren odaklanmış SiN penceresinin kenarına. mikroçip kenarı aşırı saçılma parlak. (C) SİN penceresinin köşesinde yapılır Odaklama. görüntü odakta odaklı altında ve durumları üzerinde odaklı göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sıvı akış TEM tutucu sıvı AuNPs davranışını incelemek için kullanılmıştır. AuNPs kararlı bir şekilde saf suda SİN membran üzerinde immobilize edilmiş ve sıvı faz gövdesinin (Şekil 6) kullanılarak nano çözünürlüğü ile görüntülendi. Mükemmel kontrast kuvvetle-saçılma altın elde edildi. o takılı sıvı akış TEM tutucu ile 8 pA / cm² olurken kuru test numunesi için ölçülen fosfor ekranda akım yoğunluğu, 20 pA / cm² oldu. 200 nm spacer kalınlık göre beklenen olandan çok daha büyük Denklem 1, t su = 2.4 ± 0.5 um, kullanma. Bununla birlikte, kalınlık nanometre uzaysal çözünürlüğü ile AuNPs görüntülenmesi için çok büyük değil. Sıvı kalınlığı nedeniyle mikroçip SİN membranlar, olmayan düzlük şişkin ve enkaz mikroçipler üzerinde bulunan için ayırıcı tarafından belirlenen 200 nm daha kalındır.

16 sırasında şeklini muhafaza rağmen reaktif radyoliz ürünleri (e - aq, H • H +, • OH) elektron demeti etkileşimi ile gelen menşeli su AuNPs 15 şeklinde bir değişikliğe yol tek altın atomlarını okside olabilir. sıvı akış sisteminin ikinci bir deneyde, klorür iyonlarının tatbik etmek için kullanılmıştır, ancak, AuNPs stabilitesi değiştirildi. Klorür iyonları tetrachloroaureat formunda oksitlenmiş altın atomuna stabilize edebilen, AuCl 4 -. Şekil 7 sonuçlarına benzer yavaş yavaş KÖK görüntüleme time-lapse serisi sırasında çözünmüş AuNPs, 16 daha önce rapor olduğunu göstermektedir. Kullanılan elektron doz oranı için, 30 nm büyüklüğünde AuNPs çözmek için ~ 300 s sürdü.

Su sağlama olarak AuNPs hareketleri R, bir üçüncü deneyde (Şekil 8) 'de incelenmiştir. Deneyden önce, sıvı akış TEM tutucu tuzu izlerini ortadan kaldırmak için temizlendi. İlk deneyde farklı olarak, alternatif bir örnek hazırlama yaklaşımı SıN zar 14 AuNPs zayıf bir eki elde etmek için kullanıldı. çözüm kurumasına izin vermeden bu deneyde, AuNP çözüm silikon mikroçip üzerine yerleştirildi ve sıvı akış TEM tutucu toplandı. Bu şekilde, AuNPs kolay kullanılan doz oranında görüntüleme hata'ya membran kopuk. Kalan AuNPs SİN pencereye yakın görüş alanı içinde kalırken AuNPs bazıları, uzak toplu çözümler görüş alanından taşındı. Bu AuNPs hareketleri gözlendi ve sonunda onlar aglomere. Bir süre sonra, bu topaklar da SiN zarından müstakil ve görüş alanının dışında ve çözüm taşındı.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figure-results-1
Şekil 6: Saf Su katmanı Başı Çap AuNPs 30 nm Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (STEM) Mikrografik. Resimdeki orijinal görüntünün seçilen bir alandır. görüntü boyutu piksel bekleme süresi 19 us oldu 1024 x 1024 piksel oldu piksel boyutu 0.73 nm idi ve büyütme 400,000X oldu. Elektron doz bu şekilde 7.1 x 10 4 E - oldu / nm². Sıvı kalınlık 2.4 mikron tutarı için hesaplandı böylece fosfor ekranda ölçülen akım yoğunluğu, 8 pA / cm 2 idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 7: Time-lapse SerileriSaline AuNPs ve KÖK Mikrografilerinin. (AD) Görüntüler 30 s aralıklarla KÖK görüntülerin time-lapse serisi elde. AuNPs kademeli klorür iyonları bir sonucu olarak, sıvı içinde çözülür. pixel bekleme süresi 2 us, zaman atlamalı serilerinin çerçeve süresi 1.75 sn, piksel boyutu 0.44 nm idi ve büyütme 500,000X oldu. Görüntü başına elektron dozu, 1.2 x 10 4 E - oldu / nm². Sıvı kalınlığı 2.4 mm idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 8: Saf Su içinde hareket AuNPs mikrografı STEM. Birkaç oklarla seçilir olan AuNPs, (A) sin membran. (B) Hareket parçalarıSeçilen AuNPs ait (A). Bazı AuNPs görüntüleme zamanında görüş alanından uzağa taşıyın. Kalan AuNPs SİN zar boyunca yanal olarak hareket eder ve topaklaştırma başlar. Çerçeve süresi 0.52 sn, 1 ms olan kritik bir küme boyutu ulaştıktan sonra, onlar zardan sevk ve view.The piksel bekleme süresinden alanında uzaklaşın, piksel boyutu 1.8 nm idi ve büyütme 120,000X oldu. Görüntü başına elektron dozu 3.5 x 10 2 E - oldu / nm² ve sıvı kalınlığı 2.4 um idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokol dinamik süreçleri gözlem de dahil olmak üzere, bir sıvı içinde AuNPs kök sağlar. sahibinin montajı kolay-öğrenme tekniğidir. sıvı akış TEM tutucu ile çalışan, ancak çeşitli yönleri göz önünde bulundurulmalıdır. Örneğin, O-ring üzerine Si mikroçip ya da büyük parçacıkların bir biçimde kırılmış kenarlar sıvı hücre kaçağına yol açabilir. Öte yandan, büyük parçacıklar (> 200 nm; örneğin, toz veya Si enkaz) SİN membran üzerinde sıvı hücrenin bir kalınlığının artması sonucu düşük uzaysal çözünürlüğü düşük görüntüleme kontrast veya giden ve dahi neden olabilir SİN pencereleri kırmak için. Önemli olarak, tuz ya da diğer kimyasal kalıntılar istenmeyen bir şekilde deney sonuçlarını etkileyebilir. Nedenle, numune hazırlama ve tutucu montaj farklı adımlar dikkatli ve temiz ve tozsuz bir ortamda yürütülmektedir önemlidir.

Sıvı ce kalınlığıLL elde çözünürlük hem de elde edilen görüntülerin 17 kontrastını belirler. Bu kalınlık iki Si mikroçip biri üzerinde bulunan aralama ile ayarlanabilir. numune boyutlarına bağlı olarak, bir sıvı, farklı hücre kalınlıkları gerçekleştirilebilir. Bütün ökaryotik hücreler en fazla 5 um daha büyük ara parçalar gerekir iken AuNPs çalışma için, küçük, ara parçaları (200-500 nm) kullanmak mümkündür. sıvı hücre kalınlığı, ayrıca sıvı hücre ve çevresindeki vakum arasındaki basınç farkından kaynaklanan SİN membran pencerelerin şişkin etkilenir. Bu etki daha büyük SiN zar pencereleri ile daha belirgin hale gelir. Bu nedenle, sıvı hücre kalınlığının en aza indirmek için, küçük SİN membran aralıkları kullanmak tavsiye edilir. durumda iki küçük pencereler arasında bir örtüşme, farklı bir taban mikroçip kullanarak çapraz konfigürasyonda monte edilebilir bulmak zordur. Alternatif uygulamalar, largely şişkin önlemek ve örnek yükleme ile ilgili ayağı 19 tarafından desteklenen bir monolitik mikroçip 18 veya membran pencere, ancak bu sergi dezavantajları oluşmaktadır. güncel teknoloji en zorlu yönlerinden biri sıvı kalınlığı üzerinde tam kontrol eksikliğidir. Genellikle sıvı burada görüldüğü gibi, kullanılan boşluk boyutları ne beklendiğini daha kalındır. Çeşitli gruplar kapalı sıvı odalarının 4, 20, 21, 22 kullanılır; Sıvı kalınlığı sıvı içinde bir baloncuk uyararak azaltılabilir olarak bu sistemler, uzamsal çözünürlük ile ilgili bazı avantajları vardır. Alternatif olarak, SİN pencereler ince bir sıvı tabakası yol daraltmak zorunda olabilir. Ayrıca daha ince sıvılar sonuçlanan Üçüncüsü, diğer ince pencerelerin kasa mevcuttur (örn grafen) 23,Bu protokol açıklanan sistem ile mümkün olandan. Bununla birlikte, sistemlerde sıvı akış imkansızdır.

bir yüksek çözünürlüklü mikroskopi tekniği gibi, deney safhaları içinde değerlendirilmelidir. en önemli özelliği, sıvı ya da numune ile elektron ışınının etkileşimdir. Bir çok katı numuneler 24 için elde uzamsal çözünülürlüğünü sınırlar radyasyon hasarı ek olarak, sıvı örnekleri de elektron demeti tarafından oluşturulan radyoliz ürünleri 15, 25 tarafından etkilenmektedir. Bu ürünler deney etkileyebilir beri, dikkatli veri yorumlama ve deneysel tasarım 26 esastır. mikroskop ayarları, belirli bir çalışmanın amaçlarına göre seçilmelidir. ADF STEM, WHI sıvı hücre büyük kalınlıklarda yüksek atom numarası (Z) görüntüleme nanopartiküller için daha güçlüle TEM düşük Z malzemeler üzerinde daha iyi bir kontrast sağlar ve genellikle hızlı ama daha ince sıvı tabakaları 3 gerektirir. ADF yerine detektörü kullanılarak BF KÖK kalın tabakalar 27 düşük Z malzemeleri görüntülenmesi için avantajlıdır, çünkü parlak saha (BF) detektörü zaman, resim sıvı hücre kullanılır. Sıvı hücre kalınlığı arttıkça, daha fazla akım gereklidir. Bununla birlikte, bu radyoliz ürün konsantrasyonunu arttırmaktadır ve radyasyon hasarı artırır. Ayrıca, kontrast bir ters çok kalın sıvı (su> 10 um) ADF detektör içinde gözlenmediğine dikkat edilmelidir.

Sıvı koşullar mikroskop tutucu çıkarmadan ve örnek ve sıvı hem de alışverişi bizim deneyler arasında değişti. Tuz halindeki konsantrasyonun değişmesi ile birlikte, örneğin, tek bir olabilir (başka bir sıvı içinde akan sıvının diğer özelliklerini değiştirmek için kolaylıkla mümkündürBelirli bir pH değeri 16 ayarlamak için tampon çözeltileri kullanmak ya da organik çözeltiler veya diğer katkı maddeleri) taşıyabilirler. Tutucu de mikroakışkan sisteminden akan sıvı mikroskop takılı ise, sıvının değiştirmek de mümkündür. Bununla birlikte, bu durumda, hangi zaman örnek değişiklikleri sıvı etmektedir bilinmemektedir. Elektrotlar destekleyen mikroçip mevcuttur, bu nedenle nano ölçekli elektrokimya deneyleri 28 yapılabilir olması da dikkat çekicidir.

Çalışmanın amaçları suda AuNPs ile sınırlı değildir, ancak örneklerin çok çeşitli silika, titanyum oksit ve polimerleri de dahil olmak üzere, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak incelenebilir. Nesnelerin hareket satın olan bir görüntü yakalamak için çok hızlı ise, viskozite% 50 gliserol ve% 50 sudan oluşan bir karışım kullanılarak bir büyüklük sırasına göre azaltılabilir.

Söz konusu noktalarından,bir çok avantaj, olasılıklar ve dezavantajları da belirgin hale gelir. 1) Herhangi bir deney tüm numune (gözlem altında nesne, sıvı ve SİN membranların) ile elektron demetinin dinamik etkileşiminden etkilenir;: sıvı faz KÖK ile çalışırken, dikkat edilmesi gereken en önemli dezavantajları yönündedir 2) numune işleme sıkıcı ve örnek veya mikroçip bir mikrometre büyüklüğünde partiküller içerdiğinden ince bir sıvı tabakası elde etmek için çoğu zaman zordur; 3) Sıvı kalınlığı genellikle ayırıcı tarafından belirlenen amaçlanan kalınlığı büyük ölçüde farklıdır; ve 4) uzaysal çözünürlüğü ve kontrast güçlü sıvı kalınlığı ve gözlem ve sıvı altında nesnenin değişim yoğunluğu arasındaki fark bağlıdır.

Halen, bol yöntemler nanometre mekansal çözünürlüğe sahip sıvı nesnelerin mikroskopi için var. Amorf buz elektron mikroskobu, güçlü bir tekniktir 29 olduğunuancak alan deney prosedürleri tüm deneyler buz numunenin hazırlanmasını sağlar ve zaman çözümlü deneyler imkansız, hassastır. X-ışını mikroskobu 30, 31 prensip olarak kullanılabilir, ancak sınırlı bir uzaysal çözünürlüğe sahip ve laboratuvarlarda yaygın olarak mevcut değildir. Sıvı içinde atomik kuvvet mikroskopisi kurulan ancak yüzey teknik yalnızca 32, 33, 34, 35 olmuştur. Işık mikroskobu yeterli uzaysal çözünürlüğü göstermez. Şu anda, sıvı içinde elektron mikroskobu sıvı nano nesnelerin ve işlemlerin doğrudan mikroskopi için en güçlü teknik görünüyor.

Sıvı faz TEM ve KÖK henüz rutin analitik teknikler değil ama yine de gelişiyor. dikkate almak parametre sayısı oldukça büyüktür ve bu ofte olduğunun zor deney sonuçlarını çoğaltmak. Ayrıca, nicel veriler soruşturma kapsamında etkileri elektron demeti bir sonucu olarak ortaya çıkan süreçlerle iç içe çünkü elde etmek zordur. Burada açıklanan protokol, böylece deney ilgili tüm baz yönleriyle için muhasebe, deneysel protokol haline getirmeyi amaçlamaktadır. Biz bu protokol gelişmekte olan bu alanda deneysel çalışmaların daha iyi tekrarlanabilirlik yol umuyoruz.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E. Arzt'a INM aracılığıyla verdiği destek için teşekkür ederiz. Araştırma kısmen 2014 Leibniz Yarışması tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Binoküler ışık mikroskobuLeicaM60 CMO
JEOLARM200Ftaramalı transmisyon elektron mirkoskopu
Sıvı akışı TEM numune tutucuDENS ÇözümleriOkyanus Mikroakışkan
şırınga pompasıHarvard ScientificPicoPlus
Plazma temizleyiciGatanSolarus950
< güçlü > Kimyasallar< / güçlü >
Aseton, Rotisolv ve nbsp; Ayrıca HPLCSigma-Aldrich7328.2
Sigma-Aldrich34877-2.5Liçin chromasolv Plus
, Rotisolv HPLC sınıfıCarl RothP076.2
Altın kolloid sitrat stabilize, çap 30 nmİngiliz-BiocellEM. GC20
< güçlü > Malzemeler< / 50
silikon mikroçipler; m x 0,40 mmOkyanus sistemiDENS Çözümleri
50 nm kalınlığında, 20 & mikro boyutlarında silisyum nitrür membranlı ara silikon mikroçipler; m x 0,40 mm ve 200 nm ara parça kalınlığı OkyanussistemiDENS Çözümleri
Mikroakışkan gözetleme tüpüUpchurch Scientific1570
Plastik Değiştirilebilir uçlar Cımbız
(ESD PVDF (SV) uçlu Anti-Manyetik Anti-Asit Paslanmaz Çelik gövde)ideal-tek2ASVR.SA
Teflon kaplı bükülmüş çelik cımbız ("PTFE" ile EMS SA Kaplama)ElektronMikroskobu Bilimleri78322-7Te
Teflon kaplı geniş gaga çelik cımbız (EMS 2A "PTFE" Kaplama)Elektron Mikroskobu Bilimleri78322-2ATe
Hamilton şırınga, 1 mL, gaz geçirmez (Model 1001 TLLX SYR)Hamilton81323
Temiz oda dokusu Sontara Micropure AP (224 x 224mm)DuPontSontara MicroPure
Küresel sapma düzeltici ileSu için, HPLCEtanol nm kalınlığında ve 20 & mikro boyutlarında silisyum nitrür membranlı güçlü > bazlı için için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).">Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  2. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).">Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
  3. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).">de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
  4. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).">Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
  5. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).">Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
  6. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).">Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
  7. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).">Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
  8. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).">Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
  9. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).">de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
  10. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).">Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
  11. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).">Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
  12. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).">Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
  13. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).">de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
  14. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).">Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
  15. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).">Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
  16. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).">Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
  17. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).">Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
  18. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).">Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
  19. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).">Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
  20. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).">Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
  21. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).">Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).
  22. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).">Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
  23. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).">Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  24. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).">Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  25. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).">Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
  26. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).">Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
  27. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).">Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
  28. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).">Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
  29. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).">Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
  30. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).">Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
  31. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).">Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
  32. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).">Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
  33. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).">Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
  34. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).">Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
  35. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).">Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Scanning Transmission Electron MicroscopyLiquid Phase STEMMicrofluidic ChamberSilicon Nitride MembraneGold NanoparticlesLiquid Cell ThicknessVacuum SealElectron Beam ImagingSample LoadingDynamic Process Analysis

Related Articles