Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro
Bu makalede
Özet
Özet
In vitro bütün zar proteinlerinin çalışmalar sıklıkla bir hidrofobik zar geçiş alanına varlığı ile karmaşıktır. Dahası bu çalışmaları komplike, lipozomlar içine deterjan-çözünmüş membran proteinlerinin yeniden birleştirilmesi protein topoloji zorlamak için imkansız bir stokastik süreçtir. Bu kağıt bir lipozom tabanlı iskele kullanan bu zorlu tekniklere alternatif bir yöntem sunuyor. Protein çözünürlüğü transmembran alanının silinmesi ile arttırılır ve bu amino asitler, bir His-etiketi olarak bir bağlama yarımı ile değiştirilir. Bu bağlama Lipozomun yüzeyinde üniform bir protein topoloji zorlar, (nitrilotriasetik asit His-etiketli proteinleri (NTA (Ni2 +)) tarafından koordine Ni 2+) bir ankraj grubu ile etkileşime girer. bütünsel zar proteini, mitokondriyal Fizyon Faktörü (mff) ile Dynamin ilişkili protein 1 (Drp1) arasındaki etkileşim, inve olarak, burada bir örnek sunulmuşturBu yapı iskelesi lipozom yöntemiyle stigated. Bu çalışmada, verimli bir şekilde GTPaz aktivitesi stimüle lipozom yüzeyine çözünebilir Drp1 işe mff yeteneğini göstermiştir. Ayrıca, Drp1 belirli lipid mevcudiyetinde mff dekore edilmiş lipit şablonu tubulate edebildi. Bu örnek, yapısal ve işlevsel tahliller kullanılarak iskele lipozomlar etkinliğini göstermektedir ve Drp1 aktivitesinin düzenlenmesinde mff rolü vurgulamaktadır.
Giriş
Zara yakın protein-protein etkileşimlerini incelemek bağlı 1 dahil bütün zar proteinlerinin doğal ortamından yansıtan zorluk zorlu bir çalışmadır. Bu deterjan, çözündürme gerekliliği ve proteoliposomes protein tutarsız yönlendirmesine bağlıdır. Bu sorunları önlemek için amacıyla, bütün zar proteinlerinin çözünür etki His-Tag füzyon proteinleri olarak ifade edilmiştir, burada bir strateji bulunmaktadır ve bu bu çözünür fragmanları lipid de NTA (Ni2 +) ana grupları ile etkileşimler yoluyla iskele lipozomlara tutturulmuş yüzey. Bu iskeleler kullanılarak, lipid yakın protein etkileşimleri, lipid ve protein bileşimlerinin bir aralığı üzerinde araştır....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. İskele Liposome Hazırlık
Not: İdeal olarak, bu ilk uygulamalar DOPC (1,2-dioleoil-sn -glisero-3-fosfokolin veya PC) DGS-NTA (Ni2 +) (1,2-dioleoil oluşan nispeten basit ve idi iskelesi (kullanmalıdır - sn -glisero-3 - [(N - (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit) sukkinil]. (nikel tuzu)) Yapı bu deneylerin rahatsız lipid yük, esneklik ve eğrilik tek tek faktörler olarak dahil edilebilir potansiyeli olan zara yakın etkileşimlerini değiştirmek. Bu değişiklikler, fosfatidilserin veya kardiyolipin (CL), fosfatidiletanolamin (DOPE veya PE) veya galaktosil (β) seramid gibi özel lipit bileşenlerin, be....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Drp1 ve mff arasındaki etkileşim mitokondriyal reaksiyonu için önemli olduğu gösterilmiştir, ancak bu etkileşim, in vitro olarak özetlemek zor olmuştur. Amacımız daha iyi Drp1 ve MFF etkileşim burada hücresel ortamı taklit etmek oldu. Bu amaçla, lipozomlar NTA (Ni2 +) ana grupları arasında sınırlayıcı konsantrasyonlarını ihtiva eden yukarıda tarif edildiği gibi bir lipid filmi rehidre ile hazırlanmıştır. Çözeltisi (Şekil 1a) donukluk ile kanıtlandığı .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, yekpare zar proteinleri içeren, protein-protein etkileşimlerinin araştırılması için bir yöntem sunmaktadır. modüler lipozom iskele kullanarak, araştırmacılar lipid yakın bir ortamda bir veya daha fazla protein aktivitesini değerlendirmek yeteneğine sahiptirler. 26 - Daha önce yapılan çalışmalar, plazma zarının 24 reseptör enzim için de benzer bir yöntem gösterilmiştir. Biz lipit kofaktör birleştirmek ve mitokondriyal fisyon makine mechanoenzymatic çekirdeğini oluşturan prote.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Amerikan Kalp Derneği'nden (SDG12SDG9130039) alınan fonu takdir etmek istiyor.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fosfatidilkolin (DOPC) | Avanti Polar Lipidler | 850375 | |
| Fosfatidiletanolamin (DOPE) | Avanti Polar Lipidler | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipidler | 790404 | |
| Sığır Kalbi Kardiyolipin (CL) | Avanti Polar Lipidler | 840012 | |
| Kloroform | Acros Organics | ||
| Lipozom Ekstruder | Avanti Polar Lipidler | 610023 | |
| Cu / Rh Negatif Leke Izgaraları | Ted Pella | 79712 | |
| Mikrofüj Tüpü | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Mikrotitre Plaka şeritleri | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Anında Mavi Coomassie Boya | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnezyum Klorür | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Jel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Yükleme Boyası | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malakit Yeşil Karbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Amonyum Molibdat Tetrahidrat | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratuvar Filmi | Parafilm | PM-996 | |
| Uranil Asetat | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Mikroskop | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Soğutmalı CentriVap Konsantratör | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Mikroplaka okuyucu | Moleküler Cihazlar |
Kaynaklar
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
