Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

8.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54971

⸱

11 Ocak 2017

 , 
1Department of Pharmacology, Center for Mitochondrial Diseases, The Cleveland Center for Membrane and Structural Biology, Case Western Reserve University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

In vitro bütün zar proteinlerinin çalışmalar sıklıkla bir hidrofobik zar geçiş alanına varlığı ile karmaşıktır. Dahası bu çalışmaları komplike, lipozomlar içine deterjan-çözünmüş membran proteinlerinin yeniden birleştirilmesi protein topoloji zorlamak için imkansız bir stokastik süreçtir. Bu kağıt bir lipozom tabanlı iskele kullanan bu zorlu tekniklere alternatif bir yöntem sunuyor. Protein çözünürlüğü transmembran alanının silinmesi ile arttırılır ve bu amino asitler, bir His-etiketi olarak bir bağlama yarımı ile değiştirilir. Bu bağlama Lipozomun yüzeyinde üniform bir protein topoloji zorlar, (nitrilotriasetik asit His-etiketli proteinleri (NTA (Ni2 +)) tarafından koordine Ni 2+) bir ankraj grubu ile etkileşime girer. bütünsel zar proteini, mitokondriyal Fizyon Faktörü (mff) ile Dynamin ilişkili protein 1 (Drp1) arasındaki etkileşim, inve olarak, burada bir örnek sunulmuşturBu yapı iskelesi lipozom yöntemiyle stigated. Bu çalışmada, verimli bir şekilde GTPaz aktivitesi stimüle lipozom yüzeyine çözünebilir Drp1 işe mff yeteneğini göstermiştir. Ayrıca, Drp1 belirli lipid mevcudiyetinde mff dekore edilmiş lipit şablonu tubulate edebildi. Bu örnek, yapısal ve işlevsel tahliller kullanılarak iskele lipozomlar etkinliğini göstermektedir ve Drp1 aktivitesinin düzenlenmesinde mff rolü vurgulamaktadır.

Giriş

Zara yakın protein-protein etkileşimlerini incelemek bağlı 1 dahil bütün zar proteinlerinin doğal ortamından yansıtan zorluk zorlu bir çalışmadır. Bu deterjan, çözündürme gerekliliği ve proteoliposomes protein tutarsız yönlendirmesine bağlıdır. Bu sorunları önlemek için amacıyla, bütün zar proteinlerinin çözünür etki His-Tag füzyon proteinleri olarak ifade edilmiştir, burada bir strateji bulunmaktadır ve bu bu çözünür fragmanları lipid de NTA (Ni2 +) ana grupları ile etkileşimler yoluyla iskele lipozomlara tutturulmuş yüzey. Bu iskeleler kullanılarak, lipid yakın protein etkileşimleri, lipid ve protein bileşimlerinin bir aralığı üzerinde araştırılabilir.

Biz etkili bu pr modüle lipit etkileşimleri mitokondriyal fisyon kompleksinin montajını yöneten kritik protein-protein etkileşimleri araştırmak ve incelemek için bu yöntemi uyguladıkkapsayabilecektir 2. Mitokondriyal parçalanma sırasında Dynamin-ilişkili protein 1 (Drp1) 3 adı verilen bir korunmuş membran yeniden modelleme proteini, enerji homeostazı, apoptotik sinyali ve diğer birçok düzenleyen hücresel sinyallere yanıt olarak dış mitokondriyal zarın (OMM) yüzeyi için görevlendirilir İntegral mitokondrial süreçler. 8 - Bu büyük, sitozolik GTPaz ayrılmaz OMM proteinleri 4 etkileşim yoluyla mitokondri yüzeyine işe alınır. Bu tür bir protein rolü Mitokondrial Fizyon Faktörü (mff), in vitro olarak Drp1 ile belirgin bir zayıf etkileşim aydınlatmak için zor olmuştur. Bununla birlikte, genetik çalışmalar net bir şekilde mff başarılı bir mitokondriyal fisyon 7,8 için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu yazıda anlatılan yöntem Drp1-MFF etkileşimleri teşvik eşzamanlı lipit etkileşimleri tanıtarak önceki eksikliklerin üstesinden gelmek başardı. Genel olarak, bu yeni tahlil reveamitokondriyal fisyon kompleksinin montajını rehberlik temel etkileşimleri açtı ve bu temel moleküler makinenin devam eden yapısal ve işlevsel çalışmalar için yeni bir aşama sağladı.

Bugüne kadar, Drp1 ve mff arasındaki etkileşimlerin incelenmesi mff 9, esneklikleri ile komplike olan, Drp1 heterojenitesi 2,10 polimerler, ve zorluk arındırıcı ve sağlam bir transmembran alanı 11, tam uzunlukta mff yeniden yapılandırmak. Biz onun transmembran (MffΔTM-His 6) eksik His-etiketli MFF sulandırmak için NTA (Ni 2+) iskele lipozomlar kullanarak bu zorlukların ele. E aşırı ifade edildiğinde MffΔTM derece çözünür olduğunu, bu strateji, avantajlı olmuştur. E. coli ve bu izole protein kolayca iskele lipozomlar üzerinde yeniden çözüldü. Bu lipit şablonlarına gergin olduğunda, MFF membran yüzeyinde aynı, dışa bakan yönünü üstlendi.Bu avantajlar, örneğin kardiyolipin gibi mitokondriyal lipidler, ek olarak, membran 11 mff katlama ve sağlam bir yapıya eklenmiştir. Kardiyolipin de bu bozukluğu bölge stabilize etmek ve fisyon makine aksamını kolaylaştırabilir Drp1 2,12 değişken alanı ile etkileşime girer.

Bu sağlam yöntem zara yakın protein etkileşimlerini değerlendirmek istiyoruz gelecek çalışmalar için yaygın olarak uygulanabilir. Ek bağlantısı / afinite etkileşimler kullanımı sayesinde, bu membran yeniden oluşturma çalışmaları sofistike hücreleri içinde membran yüzeyinde bulunan ek karmaşıklık taklit etmek için arttırılabilir. Aynı zamanda, lipid bileşimleri, daha doğru bir şekilde, bu makromoleküler kompleksler doğal ortamları taklit etmek için modifiye edilebilir. Özet olarak, bu yöntem, kritik hücresel proc sırasında membran morfolojileri şekillendirmede göre proteinlerin katkı ve lipidler incelemek için bir araç sağlaresses.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İskele Liposome Hazırlık

Not: İdeal olarak, bu ilk uygulamalar DOPC (1,2-dioleoil-sn -glisero-3-fosfokolin veya PC) DGS-NTA (Ni2 +) (1,2-dioleoil oluşan nispeten basit ve idi iskelesi (kullanmalıdır - sn -glisero-3 - [(N - (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit) sukkinil]. (nikel tuzu)) Yapı bu deneylerin rahatsız lipid yük, esneklik ve eğrilik tek tek faktörler olarak dahil edilebilir potansiyeli olan zara yakın etkileşimlerini değiştirmek. Bu değişiklikler, fosfatidilserin veya kardiyolipin (CL), fosfatidiletanolamin (DOPE veya PE) veya galaktosil (β) seramid gibi özel lipit bileşenlerin, belirlenen miktarda eklenmesi ile elde edilebilir.

  1. Temiz bir cam test tüpünde kloroform içinde çözündürülmüş olan lipitler birleştirin. ince bir lipid film meydana getirmek üzere tüp dönerken kuru azot gazı ile çözücü buharlaşır. Bir centrifuga olan, kalan solventin çıkması37 ° C'de 1 saat l evaporatör.
    NOT: Çeşitli lipozom formülasyonları protokollerde kullanılmaktadır aşağıda açıklanan: iskele lipozomlar (3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96.7 mol% DOPC), kardiyolipine ile iskele lipozomlar (3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% 'si kardiyolipin / 86.7 mol% DOPC), kardiyolipin esnek iskele lipozomlar (3.3 mol%' si DGS-NTA (Ni2 +) /% 10 mol kardiyolipin / 35 mol% 'si DOPE / 51.7 mol% DOPC) ve zenginleştirilmiş bir iskele lipozomlar (% 10 mol DGS-NTA (Ni2 +) / 35 mol% 'si DOPE / 40 mol%' si DOPC / 15 mol% 'si kardiyolipin).
  2. 37 ° C'ye ön-ısıtılmış, Tampon A (25 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit), KOH ile 7.5 değerine ayarlandı, 150 mM KCI, pH) ilave nihai lipid konsantrasyonu 1 olacak şekilde - 2 mM arasındadır. Tam lipid karışımı (Şekil 1a) tekrar süspansiyon arada sırada burgaç gibi karıştırılarak 37 ° C'de 30 dakika kuluçkalayın.
  3. tamamen donmuş (Roug kadar sıvı azot tüpü, plastik bir test tüpüne transfer koyunhly 30 s), ve tam çözülmüş (yaklaşık 1 oluncaya kadar 37 ° C su banyosu içinde yer - 2 dakika). 4 dondurma-çözme döngüsü (Şekil 1b) bir toplam tekrar edin.
  4. 4 filtre destekleri ve tampon maddesi içinde bir polikarbonat filtresi ıslatma ve üretici talimatlarına göre ekstruder araya getirilmesiyle, bir lipid ekstruder hazırlayın. filtre üzerinden 21 kez lipid çözeltisi a'ya. Homojen bir boyut dağılımına (Şekil 1c) sağlamak için yumuşak, sabit basınç kullanın.
    NOT: Bu protokol açıklanan Bütün deneyler için, bir 1.0 um polikarbonat filtre ekstrüzyon için kullanılmıştır. Anyonik lipidler ile Drp1 etkileşimi 50 nm ile 400 nm arasında, 12 ya da daha büyük 13 arasında lipozom çaplarının çeşitli gözlenebilir. Bu nedenle, 1 um'lik filtre boyutu her iki GTPaz aktivitesi ve elektron mikroskopisi için ideal olarak seçilmiştir. Diğer lipozom çapları istenirse, dev tek lamelli vesiküller 14,15 (GUVs) ya da küçük unilamell hazırlanmasıar kullanılabilir 16 (SUV) vezikülleri. Dinamik ışık saçılım lipozom boyutu heterojen 13 değerlendirmek için de kullanılabilir.
  5. 4 ° C'de haddelenmiş lipozomlar saklayın ve 3 sonra atın - 5 d.

Protein Bağlanma Analizi İskele Lipozomlar 2. Kullanım

  1. Örnek hazırlama
    1. En az 15 dakika boyunca, skafold lipozomlar (50 uM son% 40 mol PC / 35 mol% 'si PE / 15 mol%' si CL /% 10 mol DGS-NTA (Ni2 +)) (5 uM nihai) MffΔTM His ile etiketlenmiş inkübe Tampon A + BME'de oda sıcaklığında (25 mM HEPES, 150 mM KCI, 10 mM β-merkaptoetanol (BME), pH, KOH ile 7.5 değerine ayarlanır). Bir mff içermeyen kontrol için, NTA (Ni2 +) maruz kalan bir His-etiketli kontrol bağlamak için (GFP gibi) protein ve kalkan lipozomlar inkübe edin.
      Not: Önceki bir çalışmada 2'de tarif edildiği gibi MffΔTM ifade edildi ve saflaştınldı. GFP benzer şekilde saflaştırılmıştır fakat iyon değişim aşaması çıkartılmıştır. BME, bu experimen için gerekli olants Drp1 faaliyet ve montaj özelliklerini değiştirebilir oksidasyona karşı duyarlı olduğu için.
    2. Drp1 (son 2 uM) ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir.
      Not: Önceki bir çalışmada 2'de tarif edildiği gibi Drp1 ifade edildi ve saflaştınldı. Drp1 ile kuluçkalamadan sonra, membran deformasyon bağlayıcı nükleotid etkisi 2 ile mM MgCI2 ve 1 ya mM GTP, 1 mM GMP-PCP veya Tampon A + BME, bir saat daha inkübe ederek araştırılabilir.
  2. Negatif Leke Transmisyon Elektron Mikroskobu (EM) Analizler
    1. Aktarım 5 laboratuar film tabakaya örnek ul ve örnek bir karbon ile kaplanmış Cu / Rh Düzeneği. , Örnek üzerinde ızgara 1 dakika inkübe filtre kağıdı üzerinde aşırı sıvı leke ve% 2 uranil asetat bir damla transfer. 1 dakika kuluçkalayın filtre kağıdı üzerinde aşırı leke leke ve bir ızgara kutusuna aktarılır. Vakum O / N altında saklayın tam kuruma sağlamak.
    2. Bir transmisyon elektron Microsc kullanarak görüntü örnekleri18.500 at ope - 30,000X büyütme protein ve lipozom morfolojileri 17 ultrastrüktürel değişiklikleri gözlemek için.
      Not: ultrastrüktürel değişiklikler, ImageJ 13 gibi, görüntü analizi yazılımı kullanılarak belirlenebilir (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein dekorasyon çıplak lipit şablonları ile karşılaştırıldığında ölçülebilir. Buna ek olarak, boru biçimli bölümlerin çapları düzenekleri 13 en dış kısmından ölçülebilir. Daha detaylı analiz cryo-elektron mikroskobu 17 kullanılarak yapılabilir. Bu yöntem, bu kaplama örneği, ağır metal lekeleri kullanılmadan çözücünün görüntü doğal protein-yağ derlemeler için kullanılabilir. Bu şekilde, altta yatan lipit morfolojisi değişiklikler dahil olmak üzere negatif leke, belirgin olmayan ayrıntılı yapısal özellikler, incelenir ve ölçülebilir.

Enzimatik Deneyi ilişkin yapı lipozomların 3.

Not: A Colorimetrik GTPaz tahlil 18 GTP hidrolizi yoluyla fosfat kurtuluş ölçmek için kullanılmıştır. Alternatif GTPaz deneyleri 19 mevcuttur ve gerektiğinde uygulanabilir.

  1. (150 uM nihai) iskele lipozomlar Tampon A + BME (hacim = 30 ul) içinde, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca birlikte His-etiketli MffΔTM (mff) Fis1ΔTM (Fis1), veya GFP (tüm 5 uM nihai) inkübe edin. Drp1 (500 nM nihai) ilave edin ve oda sıcaklığında (hacim = 80 ul) ilave bir 15 dakika kuluçkalayın.
    Not: Fis1 mff 2'ye benzer şekilde saflaştırılmıştır, fakat iyon değişim kromatografisi adımı atlandı. His-etiketli GFP amacı NTA (Ni2 +) baş gruplarım korumak ve diğer proteinler ile spesifik olmayan yük etkileşimleri önlemektir. herhangi bir etki GFP yokluğunda gözlemlenen ise, o zaman bu denetim gerekmeyebilir. (Ilgilenilen proteine ​​benzer boyutta) alternatif bloke proteinler de kullanılabilir, ancak GFP SCAF etkileşimlerin doğrudan görselleştirme sağlarlipozomlar katlayın.
  2. Bir ısıl transfer tüpleri, 37 ° C olarak ayarlanmış ve GTP ve MgCI2 ilave reaksiyonları başlatmak (sırasıyla 1 mM, 2 mM son; hacim = 120 uL).
  3. İstenen zaman noktalarında (örneğin, t = 5, 10, 20, 40, 60 dakika), Mg + 2 ve kenetlenmesi reaksiyonu durdurmak için 0.5 M EDTA 5 uL ihtiva eden bir mikro-titre plaka çukurlarına reaksiyon 20 ul transfer.
  4. Sonuçları kalibre etmek için Tampon A + BME içinde KH 2 PO 4 sulandırarak fosfat standartlar kümesi hazırlayın. standartlar yararlı bir dizi 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 ve 0 uM'dir. 0.5 M EDTA 5 uL ihtiva eden çukurlara, her biri 20 uL ekleyin.
  5. Her bir oyuğa 150 ul malakit yeşil maddesi (1 mM malakit yeşili karbinol, 10 mM amonyum molibdat tetrahidrat, ve 1 N HCl) ekleyin ve OD ilave edildikten sonra 650 5 dakika okuyun.
    Not: GTP kararsız asittir ve malakit yeşili maddesi varlığında hidrolize olur. Bu t sağlamakmalakit reaktifi ekleme ve okuma arasındaki o zaman tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için sabittir.
  6. Fosfat konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak aykırı OD 650 işaretlenmesiyle standart bir eğri oluşturur. Bir numunede OD 650 ve fosfat konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi belirlemek için lineer regresyon kullanın.
  7. Doğrusal regresyon kullanılarak uM fosfat protein Reaksiyon numunelerin OD 650 dönüştürün. Zamanın bir fonksiyonu olarak, fosfat konsantrasyon çizilerek her reaksiyon karışımı, fosfat üretimi oranını belirlemek ve Drp1 konsantrasyonu (0.5 uM) ile hızının bölünmesiyle kedi k dönüştürmek.
    NOT: Sadece ilk doğrusal oran fosfat nesil oranını belirlemek için kullanılması gerektiğini ve 3 veri noktalarının en az kullanılmalıdır. Reaksiyonun oranı, ilk üç veri noktası doğrusal değildir yeterince hızlı olması halinde bir işaret (örneğin, doğrusal bir uyum R2 az 0.9)en az 3 zaman noktaları ile ificantly kısa zaman süreci yapılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Drp1 ve mff arasındaki etkileşim mitokondriyal reaksiyonu için önemli olduğu gösterilmiştir, ancak bu etkileşim, in vitro olarak özetlemek zor olmuştur. Amacımız daha iyi Drp1 ve MFF etkileşim burada hücresel ortamı taklit etmek oldu. Bu amaçla, lipozomlar NTA (Ni2 +) ana grupları arasında sınırlayıcı konsantrasyonlarını ihtiva eden yukarıda tarif edildiği gibi bir lipid filmi rehidre ile hazırlanmıştır. Çözeltisi (Şekil 1a) donukluk ile kanıtlandığı ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, yekpare zar proteinleri içeren, protein-protein etkileşimlerinin araştırılması için bir yöntem sunmaktadır. modüler lipozom iskele kullanarak, araştırmacılar lipid yakın bir ortamda bir veya daha fazla protein aktivitesini değerlendirmek yeteneğine sahiptirler. 26 - Daha önce yapılan çalışmalar, plazma zarının 24 reseptör enzim için de benzer bir yöntem gösterilmiştir. Biz lipit kofaktör birleştirmek ve mitokondriyal fisyon makine mechanoenzymatic çekirdeğini oluşturan prote...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Amerikan Kalp Derneği'nden (SDG12SDG9130039) alınan fonu takdir etmek istiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fosfatidilkolin (DOPC)Avanti Polar Lipidler850375
Fosfatidiletanolamin (DOPE)Avanti Polar Lipidler850725
DGS-NTA(Ni2+)Avanti Polar Lipidler790404
Sığır Kalbi Kardiyolipin (CL)Avanti Polar Lipidler840012
KloroformAcros Organics
Lipozom EkstruderAvanti Polar Lipidler610023
Cu / Rh Negatif Leke IzgaralarıTed Pella79712
Mikrofüj TüpüBeckman357448
GTPJena BiosciencesNU-1012
GMP-PCPSigma AldrichM3509
Mikrotitre Plaka şeritleriThermo Scientific469949
EDTAAcros Organics40993-0010
Anında Mavi Coomassie BoyaExpedeonISB1L
HEPESFisher ScientificBP310
BMESigma AldrichM6250
KClFisher ScientificP330
KOHFisher ScientificP250
Magnezyum KlorürAcros Organics223211000
4 - 20% SDS-PAGE JelBio Rad456-1096
4x Laemmli Yükleme BoyasıBio Rad161-0747
HCLFisher ScientificA144S
Malakit Yeşil KarbinolSigma Aldrich229105
Amonyum Molibdat TetrahidratSigma AldrichA7302
Laboratuvar FilmiParafilmPM-996
Uranil AsetatPolysciences21447
Tecnai T12 100 keV MikroskopFEI
Optima MAXBeckman
TLA-55 RotorBeckman
Soğutmalı CentriVap KonsantratörLabconico
Mastercycler Pro ThermocyclerEppendorf
VersaMax Mikroplaka okuyucuMoleküler Cihazlar
268320010

Kaynaklar

  1. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  2. Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
  3. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
  4. Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
  5. Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
  6. Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
  7. Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
  8. Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
  9. Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
  10. Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
  11. Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
  12. Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  13. Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
  14. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  15. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  16. Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
  17. Mears, J. A., Hinshaw, J. E. Chapter 13 Visualization of Dynamins. Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).
  18. Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
  19. Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
  20. Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
  21. James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
  22. Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
  23. Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
  24. Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
  25. Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
  26. Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
  27. Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
  28. Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
  29. Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. Lateral diffusion of membrane proteins. J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).
  30. Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
  31. Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lipid-proksimal EtkileşimlerMitokondriyal Bölünme FaktörüDinamin İlişkili Protein 1Lipozom EkstrüzyonuTransmisyon Elektron MikroskobuGTPaz Aktivite AnaliziMalakit Yeşili ReaktifiHis-tag Bağlama
İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.