Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54981

⸱

10 Şubat 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

Bu makalede

Özet

Parkinson Hastalığı (PH), Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların, motor disfonksiyon neden dejenere. Burada, bir tirosin hidroksilaz (TH) yükseltici sırası ile tahrik EGFP ifade bir fareden ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ kullanarak transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır.

Özet

Parkinson Hastalığı (PH) bradikinezi, katılık ve titreme neden, Snc dopaminerjik nöronların belirgin dejenerasyon ile beynin genelinde yaygın nöronal kaybı vardır. floresan işaretleyici kullanarak birincil Ventral Mesensefalik (VM) kültürlerde yaşayan dopaminerjik nöronların belirlenmesi sabit hücrelerin immün dayanmadan bu nöronların seçici açığı incelemek için alternatif bir yol sağlar. Burada, izole, ayrışır ve kültür fare VM nöronlar 3 hafta boyunca. Daha sonra (bir tirosin hidroksilaz (TH) promoteri tarafından tahrik edilen) EGFP floresan kullanılarak kültürler dopaminerjik nöronların tanımlar. Bireysel nöronlar cam mikropipetler kullanarak mikrosantrifüj tüpler içine hasat edilir. Sonra, hasat edilen hücreler lize ve tek bir hücre RNA Seq kitaplıkları da 1, 2 üretmek için cDNA sentezi ve transpozon aracılı "tagmentation" yapmak,eşek = "xref"> 3, 4, 5. Bir kalite kontrol kontrolünü geçtikten sonra tek hücreli kütüphaneleri sekanslanır ve sonraki analiz gen ekspresyonunu ölçmek için gerçekleştirilir. Biz bireysel dopaminerjik ve orta beyin kültürlerinden izole edilen GABAerjik nöronlar için transcriptome sonuçlarını rapor. Bu hasat edilmiştir ve dizilenmiştir canlı TH EGFP hücrelerinin% 100 dopaminerjik nöronların olduğunu rapor etmektedir. Bu teknikler nörobilim ve moleküler biyoloji yaygın uygulamalara sahip olacaktır.

Giriş

Parkinson Hastalığı (PH) çaresiz bir, yaşa bağlı nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nispeten yaygın hastalığın nedeni tam olarak anlaşılamamıştır kalır. bradikinezi, katılık ve titreme tanısal klinik özelliklerine lider Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların belirgin nöron dejenerasyonu ile beynin genelinde yaygın nöron kaybı, vardır.

SNc dopaminerjik nöron içeren primer karma kültürler Parkinson hastalığı için, özellikle önemlidir. Ventral Tegmental Alanı (VTA) dopaminerjik nöronların ödül ve bağımlılık sorumlu tutulmuştur. Ventral Mesensefalik (VM) primer karma embriyonik kültürleri SNc ve VTA dopaminerjik (DA) nöronlar ve GABAerjik nöronlar ikisini de içerir. VM birincil kültürleri nöroprotektif tahlilleri için yararlı olabilir ve dopaminerjik nöronların seçici güvenlik aydınlatmak için. morfolojisi dayalı kültür dopaminerjik hücrelerin belirlemek için güvenilir bir yolu yoktur. obiz tek hücreli, yüksek verim RNA sıralama kütüphaneleri belirlemek ve tek dopaminerjik nöronların hasat ve inşa teknikleri geliştirmek yeniden.

Biz tek dopaminerjik ve orta beyin kültürlerinden izole edilen GABAerjik nöronlar için temsili RNA transcriptome rapor verilerini. Bu protokol, DA / GABA transcriptome çeşitli tedavilerin etkisini incelemek için nöro-koruma, nörodejenerasyon, ve farmakolojik tahliller için de kullanılabilir. dopaminerjik nöronlar primer VM kültürlerinde ifade nöronların küçük bir azınlığı temsil ettikleri için, güvenilir yaşayan kültürlerde bu nöronlar tanımlamak için yeteneği tek hücreli çalışmalarının gelişmiş bir dizi sağlayacaktır. Bu yeni teknikler hücresel düzeyde gerçekleşen mekanizmaların anlaşılması gelişmeler kolaylaştıracak ve başka bir yerde nörobilim ve moleküler biyoloji alanlarında uygulamalar olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bütün deneyler bakım ve Ulusal Sağlık Enstitüleri ve protokolleri tarafından sağlanan hayvanların kullanımı için kurallarına uygun olarak yapılmıştır California Institute of Technology Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Embriyonik Fare Beyin Birincil dopaminerjik Hücre Kültürleri 1. türetilmesi

  1. Çözümler ve Kültür Orta
    1. Askorbik asit stok çözeltisinin hazırlanması
      1. askorbik asit 352 mg tartılır. 20 ml'lik bir nihai toplam hacim steril H2O ekleyin. 37 ° C su banyosu içinde yer çözülmesi için. -20 ° C'de 500 uL alikotları 0.2 mikron bir şırınga ucu ve mağaza üzerinden filtre.
    2. Papain Stok Çözeltisinin Hazırlanması
      1. 15 birim / 1x Hanks'-dengeli tuz çözeltisi içinde mL (HBSS) papain seyreltilir. yukarı pipet ve 5 kez aşağı iyice karıştırın. diseksiyon gününde hazırlayın.
    3. DNaz Stok Çözeltisinin Hazırlanması
      1. DNaz 20 mg tartılır. 20 mL'lik bir toplam son hacmine steril H2O ekleyin. 0.2 mikron şırınga filtre ucu ile steril filtre. 1 ml'lik eş payları, -20 ° C'de saklayın.
    4. Dur Çözüm hazırlanması
      1. 45 ml 1 x HBSS içinde% 10 5 ml verici at at serumu ile seyreltilir. 0.2 mikron şırınga filtre ucu ile steril filtre. 4 ° C'de saklayın.
    5. % 4 Sığır Serum Albümini (BSA) stok çözeltisi hazırlanması
      1. BSA 2 g tartılır ve 45 mL'lik bir toplam son hacme 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ilave edin. Filtre 0.2 mikron şırınga filtre ucu ile sterilize edin. 4 ° C'de saklayın.
    6. Kaplama besiyerinin hazırlanması
      1. 494 ml ortam içine, L-alanil-L-glutamin (L-glutamin stabilize edilmiş bir kaynak) ve verici at serumu, 5 ml içeren 1.25 mL kültür ortamı eklenir. Filtre 0.2 mikron şırınga fil ile sterilizeter ucu. 4 ° C'de saklayın.
    7. Hücre kültür ortamının hazırlanması
      1. 196 ml kaplama ortamı içine, 4 mL B27 ve 200 uL askorbik asit ekleyin. Filtre 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C'de çözüm saklayın ve bir hafta içinde kullanın.
    8. % 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisinin hazırlanması
      Dikkat: aşağıdaki gibi paraformaldehid kullanmak için Genel önlemler şunlardır: Buhar, önlemek, cilt ve göz temasından kaçının, bir davlumbaz kullanın ısı veya çıplak alevden uzak tutun. Uygun kişisel koruyucu giysiler giyin. PFA nedenle Kullandıktan sonra iyice ellerinizi yıkayın, hassasiyete ve yanmalara neden olabilir.
      1. 1 x PBS, pH 7.4, 30 mL% 16 PFA 10 ml ekleyin.
    9. % 0.1 Triton X-100 preparasyonu
      1. Pipet 1 ml Triton X-100, 9 mL 1x PBS içine% 10'luk bir çözelti yapmak için. Pipet yavaş yavaş viskoz çözüm pipet doldurmak için izin vermek. dis 37 ° C su banyosu içinde sıcakçözmek. 4 ° C'de% 10 stok saklayın.
      2. 2 seri 1:10 seyreltiler gerçekleştirerek, örneğin,% 0.01 (% 10 stokunu:% 1 çözelti yapmak için 9 mL 1x PBS içine 1 mL% 10 sulu eriyiğine, 9 mL 1x PBS içine% 1 çözeltisi 1 ml yapmak % 0.1 çözelti).
    10. % 10 hazırlanması ve% 1 eşek serumu
      1. % 10 solüsyon 1x PBS 9 mL eşek serumu 1 ml. bir% 1 çözeltisi için 1x PBS, pH 7.4 49.5 mL eşek serumu, 0.5 mL ekleyin.
    11. 1x PBS hazırlanması
      1. O. pH metre kullanılarak pH 7.4'e çözeltinin pH'ının ayarlanması H2 450 mL 50. ml ekleyerek 1x, 10x PBS ile seyreltilir.
  2. Kültür Yemekleri Kaplama
    1. Poli-L-ornitin Kaplama
      1. Steril teknik kullanılarak 120 uL, poli-L-ornitin Tüm olarak 35 mm'lik kaplara merkezinde Coat sadece 10 mm çapında bir cam alt. 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin. poli-Lo aspire bir vakum aspiratör kullanınrnithine. Steril H 2 O ile iki kez yemekleri durulayın
    2. Laminin Kaplama (1 mg stok konsantrasyonu / ml)
      1. Steril H2O (nihai konsantrasyon, 0.01 mg / ml) ile 2 ml 20 uL laminin seyreltilir.
      2. 0.01 mg seyreltilmiş laminin 120 uL Tüm yemekler merkezinde Coat sadece 10 mm çapında bir cam alt / ml steril tekniği kullanılarak ve kullanılmadan önce 37 ° C'de 1 saat ve O / N inkübe edilir.
  3. fare Diseksiyon
    NOT: kültürü inkübatör embriyonik keseleri aktarılır bu diseksiyon yöntemleri, hücrelerin en az maruz için tasarlanmıştır. hücre canlılığı, orta beyin diseksiyon için beynin yalnızca bir kısmım korunur. gerek kalmadan daha hızlı orta beyin gelirin İzolasyon bölgesini erişmek için tüm beyin teşrih. Bu çalışmada kullanılan fare suşu için Malzemelerin tabloya bakınız.
    1. CO 2 kullanılarak gebelik gün 14 bir zamanlanmış hamile fare Euthanize.
    2. % 70 etanol ile ötenazi fare karın püskürtün. 2 x 3 dişlere sahip forseps kullanarak alt karın cilt kavramak ve künt bıçak cerrahi makas kullanarak karın boşluğu açın. her iki tarafta yanal ve proksimal hareketli iki kesim yapmak. karın boşluğuna maruz forseps kullanarak karın duvarı üzerinde katlayın.
      NOT: Rahim şimdi maruz kalmaktadır. Plevra boşluğu ve pnömotoraks oluşturulmasını maruz kalmaları da hayvan kurtarmak değil sağlar.
    3. rahim ayırmak için uterin horn iki ucunu kesin. Bir steril bir muhafaza içinde bir Petri kabı içine yerleştirin.
    4. her el düz uçlu forseps kullanarak embriyo kesesi açın ve embriyo çıkarın. Hızla forseps ile boyun başını kısma başını kesmek. dorsal yüzeyi erişilebilir şekilde sıkıca burnu üzerine yerleştirilen forseps ile baş stabilize.
    5. Diğer ha düzenlenen forseps kullanaraknd, sadece mezensefalonun sırtın önce deri ve kafatası katmanı çimdik. Cildi ve orta hat boyunca kaudal kafatasını geri soyma. korteks ve mesencephalon ve beyincik üzerinde aralarında bir ucu ile sırt çevresinde forseps yerleştirin.
    6. Pinch ve kaudal tarafında rostral tarafında ve beyincik üzerinde ön beyin geride bırakarak, tüm Ortabeyin çıkarın. bir mikroskop altında soğuk HBSS ile bir Petri kabındaki yerleştirin.
    7. kalan embriyoların için prosedürü tekrarlayın.
    8. ventral yüzü artık erişilebilir, böylece mikroskop altında, beyin segmentinde ters çevirin. Şimdi 4 kadran görünür vardır. nazikçe meninksler kavrayarak ve yukarı doğru beyin uzak çekerek meninkslerin ve damarsal tüm kaldırın.
    9. Ortabeyin ayıran beyin segmenti stabilize etmek için forseps kullanabilir. Yaklaşık segmentinde merkezinde ventrikül içine forseps bir tong yerleştirin. i işaret ederek, ilk tutam dorsal olunDaha sonra mediale her iki tarafta çanak, nto. her iki tarafta yan keser yaparak alt iki kadran alın.
      NOT: ilgi doku yoğun görünen ventral alt bölümünde yer almaktadır. Bu bölge VTA ve SNC hem de içerir.
    10. Trim ve daha az yoğundur doku atmak: Bu üst ve alt kolikül içerir. Petri kabı ayrı bir alan üzerinde taze HBSS VTA ve SNC her ikisini de içeren disseke doku yerleştirin.
      NOT: fare beyin gelişiminin bu aşamasında (E14) ise, ventral orta beyindeki ilgi bölge zona incerta ve diğer hipotalamik hücre gruplarından bir ventrikül ile ayrılır. Gelişmekte olan embriyonik fare beyninin daha uzun yapısı erişkin fare beyninde birbirlerine daha yakın bulunan bu alanlarda, arasında ayrım sağlar.
    11. Kalan tüm beyin kesimleri için tekrarlayın.
    12. tüm beyin bölümleri disseke edildikten sonra, çeyrek ea forseps ve bir No. 11 neşter kullanabilirsinizyaklaşık olarak eşit büyüklükte parçalar halinde CH orta beyin bölümü.
  4. Hücreler dissociating
    1. hücrelerin enzimatik işlem
      1. HBSS tüm dörde orta beyin kesimleri sürebilir ve bir 15 ml konik tüp içine yerleştirmek için geniş çaplı bir P1000 pipet kullanın. segmentler tüpün dibe ve dörde parçaları ile alınmıştır HBSS kaldırmak edelim.
      2. 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içine tüp papain çözeltisi 500 ul ilave edin ve koyun. 7.5 dakika sonra tüp Flicking parmak hücreleri tekrar.
      3. geniş çaplı bir P1000 ucu kullanarak, deoksiribonükleaz I (DNase) solüsyonu 1 mL bir alikotu pipetleyin yalnızca orta beyin bölümleri. segmentler tüpün dibine yerleşmek için izin verin.
      4. geniş çaplı bir P1000 ucu kullanarak, durulama, soğuk durdurma çözeltisi 1 mL içeren 15 ml tüp sadece orta beyin bölümleri aktarın. segmentler tüpün dibine dinlendiriniz ve üzerinde durulama tekrarDaha fazla ce.
    2. Hücre Süspansiyon Mekanik toz haline getirilmesi
      1. Taze durdurma çözeltisi ve pipet up 1 mL son durulama değiştirin ve aşağı 7x hücreleri çiğnemek için P1000 pipet ile. hücre parçalama en aza indirmek için aşırı öğütme kaçının.
      2. yavaş tüpünün dibine% 4 BSA çözeltisi 200 uL pipetleme hücre süspansiyonu altında yatan. Dikkatle hücre süspansiyonu katmanı bozmamak için pipet çekebilirsiniz. 6 dakika boyunca 280 xg'de santrifüj sonra P1000 ile süpernatan aspire ve orta kaplama 1 mL tekrar süspansiyon hücreleri.
  5. Hücreler Sayma ve Kaplama
    1. hemasitometre kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin. orta kaplama ile, 1000 hücre / uL hücre süspansiyonu seyreltilir.
    2. Bir vakum aspiratör kullanılarak, en fazla üç yemekler gruplar halinde, kaplamalı yemekleri laminin aspire. Levha 120 uL (1.2 x 10 5 hücre / çanak (78.5 mm2 )) Yemekleri kaplanmış yüzeye hücre süspansiyonu hemen her toplu aspire sonra. Bu kurumasını ve dengesiz bir yüzey oluşturan yemekler önler.
    3. 1 saat sonra, dikkatli bir şekilde hücrelerin bozulmasını en aza indirmek için, kültür kabı bir giremeyen alanına kültür ortamının 3 ml.
    4. 3 hafta içinde 3 gün aralıklarla, hücre kültür tabaklarında tam bir değiştirilen ortam içinde bir buçuk gerçekleştirin.

RNA Dizileme için 2. Hasat Kültür-dopaminerjik nöronlar

Not: hücre hasat ve tek hücreli RNA dizilim protokolü genel bir bakış, Şekil 1 'de verilmiştir.

  1. Adımlar Deney Günü öncesinde gerçekleştirmek için
    1. 15 dakika boyunca 2 O distile H sonra tekrar 15 dakika süre ile% 100 etanol içinde sonike ve temizleyin borosilikat cam kılcal boruları. boru boşaltın ve RNaz inaktive ila 200 ° C'deki bir fırında gece boyunca fırında.
    2. yeni açılmış kullanınRNaz içermeyen pipet uçları, bir mikrosantrifüj tüpü içinde RNaz inhibitör çözeltisinin 1 pL (20 uL toplam hacim) ile dizileme kiti 10x liziz tamponu 19 uL karıştırılarak 10x reaksiyon tamponu bir stok solüsyonu hazırlanır. kısaca bir mikro santrifüj kullanarak karışımı aşağı Spin ve buz üzerinde tutmak.
    3. (Hasat nöronlar toplamak için kullanılan), ayrı ayrı 0.2 ml PCR tüplerin her 10x reaksiyon tamponu, 2 ul ekle. nöronlar belirlenmesi uygun etiketler hasat ve mağaza 4 ° C'de dondurulmuş edilecek olan tüpler Etiket.
  2. Adımlar Deney günü gerçekleştirmek için
    1. Hasat Pipetler Fabrikasyon.
      1. Bir Mikroelektrot çektirmesi ve microforge cam kaplı ısıtma filament kullanarak pişmiş kılcal borudan - (8 mikron 2) büyük uç çapı mikropipetler çekin. Uzun bir konik mikropipetler oluşturmak için çektirme ayarlayın. kalibre edilmiş bir göz merceği mercek ağı ve yüksek güç OB ile donatılmış microforge kullanın(- 20 mikron 10) istenen uç boyutu mikropipet ucu kırmak için, öznel.
      2. Microforge pipet tutucu içine mikropipet sabitleyin ve microforge üzerine tutucu monte edin. onu ısıtmak için filamanın güncel Microforge ve anahtarının mekanik manipülatör kullanılarak cam kaplı ısıtma filament üzerinde odak noktası haline mikropipet ucu getir. ısıtılmış iplik pipet dokunun. Pipet uygun çapına eridi zaman akımını kapatın.
        NOT. akım kapatılması filaman aşağı aniden hareket ve istenen çapta büyük bir açık uçlu pipet üreten, pipet ayırmak neden olur.
      3. gerekli olana kadar kapalı bir kutuda tamamlanmış mikropipetler saklayın.
    2. Nöronlar Hasat.
      NOT. Kültür nöronlar, daha önce yayınlanan bir protokolün 6 değiştirilmiş bir versiyonu aşağıdaki hasat edilmiştir.
      1. iyice clBir su duruladıktan sonra sıvı dezenfektan ve su kullanarak kültürler yemekleri ve toplama tüpleri ile temas hücre hasat odanın tüm yüzeyleri EAN. % 80 etanol ile dezenfekte yüzeyleri aşağı silin ve sonra RNaz inhibitör infüzyon silin.
      2. buz ile iki yalıtılmış kaplar, normal (su) buz ile diğeri kuru buz ile başka doldurun. Düzenli buz üzerinde 10x reaksiyon tamponu 2 uL daha önce doldurulmuş 0.2 mL PCR toplama tüpleri yerleştirin.
      3. RNaz ücretsiz Dulbecco'nun PBS (DPBS) 2 mL ile durulayın ve hasat için DPBS 1 mL ile değiştirin, çanak kültür ortamı tahliye, inkübatör nöronları içeren kültür çanak çıkarın.
      4. 40X faz hedefi, bir Hg lambası ve bir GFP filtre seti ile donatılmış bir ters, Epifloresans mikroskop kullanılarak birincil orta beyin kültürlerde floresan, TH-pozitif nöronlar tanımlayın.
      5. Motorlu veya manuel mil kullanarak hücre soma üzerinde pipet yerleştirincromanipulator. mikropipet tutucu yan bağlantı noktasına bağlı plastik boru aracılığıyla ağız yoluyla uygulanan hafif bir emme kullanılarak cam mikropipet içine nöron aspire. Hemen banyo solüsyonu hücreyi içeren mikropipet çıkarın.
      6. 0.2 ml PCR tüp toplama içeren reaksiyon tamponu içindeki pipet ucu yerleştirin ve altına yakın, tüpün kenarına ucu bölünürler. Mikropipet arkasında steril 21 G şırınga iğnesi yerleştirerek ve dışa baskı uygulayarak mikropipet kırık ucundan - (1.5 mL 0.5) Kalan sıvıyı boşaltınız.
      7. Bir masaüstü mikro santrifüj kullanılarak 5 saniye boyunca toplama tüpü Santrifüj ve kuru buz içinde dondurmak. -80 ° C'de tek hücre ihtiva eden toplama tüpleri saklayın. Tipik olarak, 5 hücreleri, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile tabak başına hasat edilir.

3. Tek hücreli RNA Seq Kütüphane oluşturma

    Üretimi
    NOT: Aşağıdaki adımlar, ticari sıralama kiti reaktifleri kullanın.
    1. PCR kabine buz üzerinde aşağıda reaktifler getirin. (2 uL 5x birinci zincir tamponu, 0.25 uL DTT (100 mM), 1 pL dNTP karışımı (10 mM), 1 uL oligonükleotid: bir PCR kabin içinde oda sıcaklığında aşağıdaki reaktifler birleştirerek bir birinci şerit ana karışımı artı% 10 Hazırlama 12 uM), 0.25 uL RNaz inhibitörü ve 1 pL transkriptaz (100 birim) ters. Bu ters transkriptaz ana karışımı (reaksiyon başına 5.5 uL toplam hacim) 'dir.
    2. kuru buz üzerinde -80 ° C den numune almak ve PCR kabine getirmek. Tek hücre örneği aşağıdakileri ekleyin: 1 mcL 1 ve 1 uL RNA ani sayısal 3 'primer. 72 ° C'de sıcak kapak termo önceden ayarlanmış bir soğutucu bloğu üzerine örnekleri getirin.
    3. 72 ° C'de 3 dakika boyunca ısıl olarak inkübe edin ve daha sonra bir PCR soğutucu raf örnekleri koydu.Her reaksiyon tüpüne (adım 3.1.1 itibaren) ana karışımı 5.5 mcL ekleyin ve hafifçe pipetleme karıştırın. 5 saniye için 0.2 uL tüpler Spin ve aşağıdaki şekilde PCR inkübe: 42 ° C, 90 dakika, 10 dakika süre ile 70 ° C. 4 ° C'de tutun.
  1. Kuvvetlendirilmiş İlk cDNA saflaştırılması.
    NOT: PCR yükseltilmiş cDNA manyetik boncuklar üzerinde immobilizasyonu ile saflaştırılmıştır. 0.2 ml tüpler için bir manyetik ayırma cihazı kullanın.
    1. 1.5 ml tüpler içinde, manyetik boncuklar kısım. Her kullanımdan önce, en az 30 dakika süre ile oda sıcaklığına kadar kordon alikotları getirmek ve dağıtmak için iyice karıştırın. Vortex manyetik boncuk eşit oranda karıştırılır kadar.
    2. Her bir örnek için, manyetik boncuklar 25 uL ekleyin. iyice karıştırın aşağı en az 10x tüm hacim yukarı pipetleme ve karıştırın. 8 dakika boncuk cDNA bağlama sağlamak için oda sıcaklığında inkübe edilir.
  2. PCR Master Mix Hazırlanması
    1. Bir addit tüm reaksiyonlar için DS-cDNA amplifikasyon PCR master karışımı hazırlayınuğratarak% 10 5 uL 10X PCR tamponu, 2 uL dNTP karışımı (10 mM), 2 pL PCR primeri 2 (12 uM), 2 uL 50x 2 polimeraz karışımı ve 39 ul nükleaz serbest su karıştırılarak (50 uL toplam hacim / reaksiyon).
  3. First Strand amplifikasyonu
    1. Sıvı tamamen berrak görünene kadar, manyetik ayırma cihazı ≥5 dk örnekleri ve manyetik boncuk yerleştirin ve süpernatant kalmadı boncuklar vardır.
    2. Ayırma cihazda örnekleri tutulması, süpernatant pipet ve atın. tüpün yanından sıvıyı toplamak için 5 saniye süreyle örnekleri Spin. Daha sonra, 30 saniye boyunca manyetik ayırma cihazda örnekleri yerleştirin bir P10 pipet ile kalan tüm süpernatant kaldırmak.
    3. Önceki aşamadan elde edilmiş boncuklara bağlanan her boru ihtiva eden DNA PCR Master Mix 50 ul ekleyin. ısıtılmış kapak ile, bir önceden ısıtılmış bir termal döngü cihazı (95 ° C) yerleştirilir. Aşağıdaki progra kullanılarak termal çevrim başlarm: 1 dakika boyunca 95 ° C, 15 sn için 95 ° C 26 döngü, 30 saniye 65 ° C, 6 dakika, 68 ° C. Daha sonra 72 ° C'de 10 dakika. 4 ° C'de tutun.
      NOT: Daha fazla bilgi için sıralama kullanıcı kılavuzuna başvurun ve örnek ayarlarını optimize etmek için.
  4. Amplifiye edilmiş çift dallı cDNA saflaştırılması
    1. Her bir örnek için boncuk 90 uL ekleyin. iyice karıştırın aşağı en az 10x tüm hacim yukarı pipetleme ve karıştırın. 8 dakika boncuk cDNA bağlama sağlamak için oda sıcaklığında inkübe edilir. Sıvı tamamen berrak görünene kadar, ≥5 dakika manyetik ayırma cihazda örnekleri artı boncuk yerleştirin ve süpernatant kalmadı boncuklar vardır.
    2. Numuneler, manyetik ayırma cihazı üzerinde iken, süpernatant kaldırmak ve atın. manyetik ayırma cihazda örnekleri tutun. boncuk bozmadan her bir örnek taze yapılmış% 85 etanol 140 mcL ekleyin. 30 saniye bekleyin. süpernatant Pipet. cDNA bea bağlı kalacaktırYıkama işlemi sırasında DS.
    3. bir kez daha etanol yıkama tekrarlayın.
    4. Kısaca tüpün yanından sıvıyı toplamak için örnekleri dönerler. daha sonra, 30 s için manyetik bir ayırma cihazıyla ilgili numuneler bir pipetle kalan etanol çıkarın. Pelet kuru ve artık parlak olana kadar (bir çatlak görünür yani önce) 2.5 dakika - 2 oda sıcaklığında örnekleri yerleştirin.
      NOT: Sadece kuru kadar sadece pelet kurutun. pelet hiçbir parlaklık ile mat bakacağız. pelet kuru değilse, etanol yükseltilmiş cDNA kurtarma oranı ve verimi azaltacak olan, örnek kuyularda kalacaktır. Pelet fazla kuru ise, topak çatlaklar olur. Bu rehydrate daha uzun 2 dakika sürer ve güçlendirilmiş cDNA kurtarma ve verimini azaltabilir.
    5. boncuklar kuru olduğunda, boncuk pelet kapsayacak şekilde elüsyon tamponu 22.5 mcL ekleyin. Manyetik ayırma cihazı örnekleri çıkarın ve boncuklar tekrar süspansiyon iyice karıştırın. İçinde10 dakika boyunca oda sıcaklığında cubate rehidrate.
    6. tüpün yanından sıvıyı toplamak için 5 saniye süreyle örnekleri Spin. Solüsyon tamamen berrak olana kadar, ≥1 dakika geri manyetik ayırma cihazda örnekleri yerleştirin.
      NOT: boncuklar küçük bir nüfus inkübasyon sırasında mıknatıs karşı pelet olmayabilir. süpernatant ile tekrar süspansiyon ve daha sonra (mevcut pelet bozmadan) boncuk geri kalanı zaten pellet haline gelmiş mıknatıs doğru onları pipet için yukarı ve aşağı bu unpelleted boncuklar pipetle.
    7. Hiçbir boncuk süpernatant kalmayıncaya kadar inkübasyon devam edin. Bir nükleaz içermeyen, düşük adhezyon tüpüne her tüpten saflaştırılmış cDNA ihtiva eden berrak bir aktif madde aktarın. -20 ° C'de örnek bilgi ve mağaza ile her tüp etiketleyin. Numuneler süresiz -20 ° C'de saklanabilir.
  5. DNA konsantrasyonu ve parça boyutu ölçümü
    1. 1 uL al miktarının bir kalite kontrol denetimi yapmakBir florometrede cDNA iquot. (Aynı 1'de tarif edilmektedir), bir elektroforez sistemi ile DS-cDNA'nın 1 uL (3 ng) değerlendirilmesi.
  6. DNA fragmantasyonu
    NOT: Bir DNA Örnek hazırlama kiti kullanın.
    1. bir tübe cDNA 20 uL (35 ng toplam) ekleyin. Tagment DNA 25 uL (TD) cDNA içeren tüp tampon ekleyin.
    2. tüp TDE1 (Tagment DNA Enzim) 5 mcL ekleyin. yukarı pipet ve 10x aşağı karıştırın. Her numune için yeni bir ucu kullanın. 1 dakika boyunca 20 ° C'de 280 x g'de santrifüjleyin.
    3. ısıtmalı kapaklı bir PCR örnekleri yerleştirin ve en çalıştırın: 55 ° C, 5.5 dakika. Çabuk 50 uL QG çözeltisi (jel özütleme kiti) ekleyin. yukarı pipet ve 10x aşağı karıştırın. bir sonraki aşamada direkt olarak devam edin.
  7. Parçalanmış DNA'nın saflaştırılması
    1. boncuk, pipet up 170 mcL ekleyin ve aşağı 10x karıştırın. 10 dakika boyunca bekletin. mıknatıs tüpler koyun. Tüpler 10 dakika mıknatıs üzerinde bekletin.Numuneler, manyetik ayırma cihazı üzerinde iken, süpernatant pipet ve atın.
    2. mıknatıs üzerinde tüp bırakın ve% 85 etanol 200 mcL ekleyin. Daha sonra etanol kaldırmak, 30 saniye bekletin. etanol yıkama tekrarlayın. Oda sıcaklığında tüp 1,000 xg Spin.
    3. geri mıknatıs tüpü koyun. herhangi bir artık etanol Pipet. Numuneler, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kuru olsun.
    4. jel özütleme kiti elüsyon tamponu 21 uL ekleyin. Tüp mıknatıs, pipet yukarı kapalı oturalım ve 10x aşağı karıştırın. Tüp, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
    5. 5 dakika boyunca mıknatısa tüp dönün. yeni bir tüp içine çözeltisi (saflaştırılmıştır DNA) Pipet 20 uL.
  8. Parçalanmış DNA Etiketleme ve PCR amplifikasyon
    NOT: Bu adımda Saflaştırılmış DNA, sınırlı döngü PCR programı ile amplifiye edilir. PCR adımı da indeksi 1 (i7) ve dizin 2 (i5) yanı sıra ortak adaptörleri (küme üretimi ve sıralama için gerekli) (P5 ve P7) ekler. DNA s başvurunDaha fazla ayrıntı için yeterli hazırlık rehberi.
    1. Yeni bir tüp içinde endeks 2 primerlerin 5 uL (beyaz kapak) ekleyin. Yeni bir pipet kullanarak indeksi 1 astar (turuncu kapak) 5 mcL ekleyin. Her tüpe PCR master karışımı 15 mcL ekleyin.
    2. Her tüpe, PCR primeri kokteyli 5 ul ekle. tüpe saflaştırılmış DNA 20 uL ekleyin. 5 kez - yavaşça aşağı 3 yukarı pipet ve.
    3. bir PCR aşağıdaki programı kullanarak PCR yapın: 72 ° C 3 dakika süreyle, 98 ° C 30 saniye, 10 saniye, 30 saniye 63 ° C, 3 dakika 72 ° C sıcaklıkta 98 ​​° C arasında 5 çevrim için. 10 ° C'de tutun. PCR temiz-up hemen geçin ya da en fazla 2 gün 4 ° C'de örneği saklayın.
  9. Amplifiye edilmiş DNA parçaları saflaştırma işlemi
    1. Oda sıcaklığına kadar boncuk getirin. Taze% 85 etanol hazırlayın. PCR makineden numuneleri almak ve kısaca aşağı doğru döndürün.
    2. tüpe boncukların 30 uL ekleyin. Yavaşça pipet yukarı ve aşağı 10x karıştırın. Tüp 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Yeri bac5 dakika için bir mıknatıs üzerinde k. mıknatıs üzerinde tüp ile süpernatant atın bir pipet kullanın.
    3. Her tüpe% 85 etanol içinde 200 uL ekleyin. Pipet 30 saniye sonra söner etanol. % 85 etanol yıkama tekrarlayın. Pipet 30 saniye sonra söner etanol.
    4. mıknatıs üzerinde hareketsiz tüpler ve kapaklar açıkken, 15 dakika havada kurumaya boncuk izin verir. mıknatıs tüpleri çıkarın.
    5. elüsyon tamponu 32.5 uL ekleyin. Yavaşça yukarı pipet ve 10x aşağı. 15 dakika - 10 mıknatısı kapalı kuluçkaya yatmaktadır.
    6. 2 dakika süreyle mıknatıs tüpleri dönmek veya süpernatant geçene kadar. Dikkatli bir şekilde yeni bir tüpe süpernatan 30 ul transfer.
  10. DNA Konsantrasyonu ve Fragment Boyutu ölçümü
    1. Bir florometrede cDNA 1 ul DNA konsantrasyonu miktarının bir kalite kontrol denetimi yapmak. elektroforez ile DNA fragmanı boyutunu belirler. DS-cDNA 1 mcL (3 ng) değerlendirin.
  11. Ardışık
    1. Bir sıralama tesisine tek bir hücre RNA Seq kütüphaneleri getirin. 100 bp sıralama önceden yayınlanmış bir protokol 4 aşağıdaki bir düzendir okur oluşturun.
      NOT: Her sıralama kütüphane eşleme okur benzersiz> 20 milyon üretir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada, bir tirosin hidroksilaz promotör sekansı ile tahrik eGFP eksprese eden bir fare ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ (Şekil 1) kullanılarak, RNA transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır. veriler toplandı ve dizilenmiştir TH-EGFP-pozitif hücre% 100 aşağıdaki üç DA-ilişkili gen kopyalarının varlığı, Th, dopa dekarboksilaz (DDC), ve dopamin transportörü DAT göre, dopaminerjik nöronların olduğunu göster...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İşte biz o tek hücre RNA seq ile her hücreyi çalışma, bir floresan etiketi kullanarak heterojen bir nüfus tek hücreleri izole. Biz hasat edilmiş ve dizilenmiştir canlı TH EGFP hücrelerinin% 100 aşağıdaki üç DA-ilişkili gen transkriptleri, Th, DDC ve slc6a3 varlığına dayanarak, gerçekten de dopaminerjik nöronların olduğunu rapor etmektedir. RNA Sek tarafından değerlendirilen TH-eGFP pozitif hücrelerin bu üç gen ifade etti. Bu, her bir TH-eGFP hücresi dopaminerjik nöronlar 8,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (DA017279, AG033954, DA037743), Michael J. Fox Vakfı ve Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü'ndeki Millard ve Muriel Jacobs Genetik ve Genomik Laboratuvarı'nı finanse eden Caltech İnovasyon Girişimi'nden alınan hibelerle desteklenmiştir. RNA-Seq kütüphane protokolünü optimize ettiği ve yardım sağladığı için Brian Williams'a teşekkür ederiz. Hesaplama eğitimi için Henry Amrhein'e teşekkür ederiz. Barbara J.W.'ye ekipmanlarını ve laboratuvar alanını kullandığı için teşekkür ederiz. Kütüphane sıralaması ve tesis yönetimi için Igor Antoshechkin'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PapainWorthington Biyokimya Şirketi 
Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 1xGibco 14175-095
Donör At SerumuThermo Scientific SH30074.03
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma A7030-50G
Ortam: Nörobazal ortamGibco 21103-049
Stabilize edilmiş bir L-glutamin, L-alanil-L-glutamin formu içeren kültür ortamı: GlutaMAXGibco 35050-0610.5 mM nihai konsantrasyon.
L-Askorbik asitSigma A7506
B27Gibco 17504-04450x stok çözeltisi, 1x nihai konsantrasyon.
35 mm cam tabanlı tabaklarMatTek   P35GC-1.5-10-C
Poli-L-OrnitinSigma P4957
LamininSigma L2020-20 ° C'de saklanır; 20'de C ve mikro; L alikotları
Deoksiribonükleaz I (DNaz)Sigma DN25
Mavi pipet uçları P1000Sorenson Bioscience Inc. 10130
10 mm sığ Petri kabıVWR 25384-324
37 & derece; C Su banyosu
37 & derece; C, %5 nem inkübatörü
%16 paraformaldehit (PFA)Elektron Mikroskobu Bilimleri 15710
Triton X-100Sigma  X100-500ML
Eşek serumuEquitech SD-0100HI%100 stok çözeltisi, %1 nihai konsantrasyon.
Standart Desen cerrahi makasGüzel Bilim Aletleri14000-14
Forseps - 2x3 dişGüzel Bilim Aletleri11022-14
Forseps - Dumont #55Güzel Bilim Aletleri11295-51
Forseps - Dumont #5Güzel Bilim Aletleri11252-23
10x PBS, pH 7.4Gibco 70011-044
Dulbecco'nun Fosfat tamponlu çözeltisi (DPBS) 1xGibco14190-144500 mL
21 G iğneBD PrecisionGlide İğne305167 100 iğne
Mikropipet çektirme SutterAletmodeli P-87
Mikromanipülatör Sutter Enstrümanı  MP-285
Sıralama Kiti: Illumina Dizileme için SMARTer Ultra Düşük RNA KitiClontech634936100 rnxs, Advantage2PCR Kiti
oligonükleotid dahil (12 ve mikro; M): SMARTer IIA oligonükleotid (12 & mikro; M)SMARTer Kitinden >
Ters transkriptaz (100 ünite)SMARTcribe ters transkriptazSMARTer Kitinden  
Astar 13' CDSIIa astarı SMARTer Kitinden
Primer 2IS PCR astarıSMARTer Kitinden
50x 2 polimeraz karışımı50x Avantaj 2 polimeraz karışımıSMARTer Kitinden
10x PCR tamponu 10x Avantaj2 PCR tamponuSMARTer Kitinden
RNA Sivri UçlarıThermoFisher4456740
PCR soğutucu rafIsoFreeze PCR soğutucu raf
DNA Örnek Hazırlama Kiti (Illumina/Nextera) NexterFC-121-103024 Örnek
PCR ana karışımıNextera PCR ana karışımı (NPM)Nextera Kitinden >
PCR primer kokteyli (PPC) Nextera PCR primer kokteyli (PPC) Nextera Kiti
FlorometredenQubit ThermoFisherQ33216
HS DNA BioAnalyzer kitiAgilent5067-4626110 rxns
Elektroforez sistemi Agilent 2100 Biyoanalizör.G2938C
Manyetik boncuklar: Agencourt AMPure Beckman CoulterA638805 mL
RNAse silme: RNAse Zap mendillerAmbionAM9786Boyut 100 Yaprak
Qubit ds HS TestKiti Moleküler problar Q32854500 tahlil
Jel ekstraksiyon kiti: Qiaquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen 28704
Cam kılcal boru(Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm OD)
MicroforgeNarishige (veya eşdeğeri) 
SıralayıcıIllumina HiSeq cihazı
GENSAT tirozin hidroksilaz-eGFP fare suşu MMRRC stok numarası: 000292-UNCStok Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Fare Bölgesel Araştırma Merkezi
LS003126

Kaynaklar

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek Hücre HasadıVentral Mezensefalik KültürlerHücre İzolasyonuFloresan MikroskobucDNA SenteziGen Ekspresyon Analizi
RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.