Parkinson Hastalığı (PH), Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların, motor disfonksiyon neden dejenere. Burada, bir tirosin hidroksilaz (TH) yükseltici sırası ile tahrik EGFP ifade bir fareden ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ kullanarak transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik
Bu makalede
Özet
Özet
Parkinson Hastalığı (PH) bradikinezi, katılık ve titreme neden, Snc dopaminerjik nöronların belirgin dejenerasyon ile beynin genelinde yaygın nöronal kaybı vardır. floresan işaretleyici kullanarak birincil Ventral Mesensefalik (VM) kültürlerde yaşayan dopaminerjik nöronların belirlenmesi sabit hücrelerin immün dayanmadan bu nöronların seçici açığı incelemek için alternatif bir yol sağlar. Burada, izole, ayrışır ve kültür fare VM nöronlar 3 hafta boyunca. Daha sonra (bir tirosin hidroksilaz (TH) promoteri tarafından tahrik edilen) EGFP floresan kullanılarak kültürler dopaminerjik nöronların tanımlar. Bireysel nöronlar cam mikropipetler kullanarak mikrosantrifüj tüpler içine hasat edilir. Sonra, hasat edilen hücreler lize ve tek bir hücre RNA Seq kitaplıkları da 1, 2 üretmek için cDNA sentezi ve transpozon aracılı "tagmentation" yapmak,eşek = "xref"> 3, 4, 5. Bir kalite kontrol kontrolünü geçtikten sonra tek hücreli kütüphaneleri sekanslanır ve sonraki analiz gen ekspresyonunu ölçmek için gerçekleştirilir. Biz bireysel dopaminerjik ve orta beyin kültürlerinden izole edilen GABAerjik nöronlar için transcriptome sonuçlarını rapor. Bu hasat edilmiştir ve dizilenmiştir canlı TH EGFP hücrelerinin% 100 dopaminerjik nöronların olduğunu rapor etmektedir. Bu teknikler nörobilim ve moleküler biyoloji yaygın uygulamalara sahip olacaktır.
Giriş
Parkinson Hastalığı (PH) çaresiz bir, yaşa bağlı nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nispeten yaygın hastalığın nedeni tam olarak anlaşılamamıştır kalır. bradikinezi, katılık ve titreme tanısal klinik özelliklerine lider Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların belirgin nöron dejenerasyonu ile beynin genelinde yaygın nöron kaybı, vardır.
SNc dopaminerjik nöron içeren primer karma kültürler Parkinson hastalığı için, özellikle önemlidir. Ventral Tegmental Alanı (VTA) dopaminerjik nöronların ödül ve bağımlılık sorumlu tutulmuştur. Ventral Mesensefalik (VM) primer karma embriyonik kültürleri SNc ve VTA dopaminerjik (DA) nöronlar ve GAB....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bütün deneyler bakım ve Ulusal Sağlık Enstitüleri ve protokolleri tarafından sağlanan hayvanların kullanımı için kurallarına uygun olarak yapılmıştır California Institute of Technology Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Embriyonik Fare Beyin Birincil dopaminerjik Hücre Kültürleri 1. türetilmesi
- Çözümler ve Kültür Orta
- Askorbik asit stok çözeltisinin hazırlanması
- askorbik asit 352 mg tartılır. 20 ml'lik bir nihai toplam hacim steril H2O ekleyin. 37 ° C su banyosu içinde yer çözülmesi için. -20 ° C'de 500 uL alikotları 0.2 mikron bir şırınga ucu ve mağaza üz....
- Askorbik asit stok çözeltisinin hazırlanması
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada, bir tirosin hidroksilaz promotör sekansı ile tahrik eGFP eksprese eden bir fare ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ (Şekil 1) kullanılarak, RNA transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır. veriler toplandı ve dizilenmiştir TH-EGFP-pozitif hücre% 100 aşağıdaki üç DA-ilişkili gen kopyalarının varlığı, Th, dopa dekarboksilaz (DDC), ve dopamin transportörü DAT göre, dopaminerjik nöronların olduğunu göster.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İşte biz o tek hücre RNA seq ile her hücreyi çalışma, bir floresan etiketi kullanarak heterojen bir nüfus tek hücreleri izole. Biz hasat edilmiş ve dizilenmiştir canlı TH EGFP hücrelerinin% 100 aşağıdaki üç DA-ilişkili gen transkriptleri, Th, DDC ve slc6a3 varlığına dayanarak, gerçekten de dopaminerjik nöronların olduğunu rapor etmektedir. RNA Sek tarafından değerlendirilen TH-eGFP pozitif hücrelerin bu üç gen ifade etti. Bu, her bir TH-eGFP hücresi dopaminerjik nöronlar 8,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (DA017279, AG033954, DA037743), Michael J. Fox Vakfı ve Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü'ndeki Millard ve Muriel Jacobs Genetik ve Genomik Laboratuvarı'nı finanse eden Caltech İnovasyon Girişimi'nden alınan hibelerle desteklenmiştir. RNA-Seq kütüphane protokolünü optimize ettiği ve yardım sağladığı için Brian Williams'a teşekkür ederiz. Hesaplama eğitimi için Henry Amrhein'e teşekkür ederiz. Barbara J.W.'ye ekipmanlarını ve laboratuvar alanını kullandığı için teşekkür ederiz. Kütüphane sıralaması ve tesis yönetimi için Igor Antoshechkin'e teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Papain | Worthington Biyokimya Şirketi | ||
| Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Donör At Serumu | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Ortam: Nörobazal ortam | Gibco | 21103-049 | |
| Stabilize edilmiş bir L-glutamin, L-alanil-L-glutamin formu içeren kültür ortamı: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM nihai konsantrasyon. |
| L-Askorbik asit | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x stok çözeltisi, 1x nihai konsantrasyon. |
| 35 mm cam tabanlı tabaklar | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poli-L-Ornitin | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | -20 ° C'de saklanır; 20'de C ve mikro; L alikotları |
| Deoksiribonükleaz I (DNaz) | Sigma | DN25 | |
| Mavi pipet uçları P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm sığ Petri kabı | VWR | 25384-324 | |
| 37 & derece; C Su banyosu | |||
| 37 & derece; C, %5 nem inkübatörü | |||
| %16 paraformaldehit (PFA) | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Eşek serumu | Equitech | SD-0100HI | %100 stok çözeltisi, %1 nihai konsantrasyon. |
| Standart Desen cerrahi makas | Güzel Bilim Aletleri | 14000-14 | |
| Forseps - 2x3 diş | Güzel Bilim Aletleri | 11022-14 | |
| Forseps - Dumont #55 | Güzel Bilim Aletleri | 11295-51 | |
| Forseps - Dumont #5 | Güzel Bilim Aletleri | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco'nun Fosfat tamponlu çözeltisi (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G iğne | BD PrecisionGlide İğne | 305167 100 iğne | |
| Mikropipet çektirme Sutter | Alet | modeli P-87 | |
| Mikromanipülatör | Sutter Enstrümanı | MP-285 | |
| Sıralama Kiti: Illumina Dizileme için SMARTer Ultra Düşük RNA Kiti | Clontech | 634936 | 100 rnxs, Advantage2PCR Kiti |
| oligonükleotid dahil (12 ve mikro; M): SMARTer IIA oligonükleotid (12 & mikro; M) | SMARTer Kitinden > | ||
| Ters transkriptaz (100 ünite) | SMARTcribe ters transkriptaz | SMARTer Kitinden | |
| Astar 1 | 3' CDSIIa astarı | SMARTer Kitinden | |
| Primer 2 | IS PCR astarı | SMARTer Kitinden | |
| 50x 2 polimeraz karışımı | 50x Avantaj 2 polimeraz karışımı | SMARTer Kitinden | |
| 10x PCR tamponu 10x Avantaj | 2 PCR tamponu | SMARTer Kitinden | |
| RNA Sivri Uçları | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR soğutucu raf | IsoFreeze PCR soğutucu raf | ||
| DNA Örnek Hazırlama Kiti | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Örnek |
| PCR ana karışımı | Nextera PCR ana karışımı (NPM) | Nextera Kitinden > | |
| PCR primer kokteyli (PPC) | Nextera PCR primer kokteyli (PPC) | Nextera Kiti | |
| Florometreden | Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kiti | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Elektroforez sistemi | Agilent 2100 Biyoanalizör. | G2938C | |
| Manyetik boncuklar: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse silme: RNAse Zap mendiller | Ambion | AM9786 | Boyut 100 Yaprak |
| Qubit ds HS Test | Kiti Moleküler problar | Q32854 | 500 tahlil |
| Jel ekstraksiyon kiti: Qiaquick Jel Ekstraksiyon Kiti | Qiagen | 28704 | |
| Cam kılcal boru | (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm OD) | ||
| Microforge | Narishige (veya eşdeğeri) | ||
| Sıralayıcı | Illumina HiSeq cihazı | ||
| GENSAT tirozin hidroksilaz-eGFP fare suşu | MMRRC stok numarası: 000292-UNC | Stok Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Fare Bölgesel Araştırma Merkezi |
Kaynaklar
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
