Yöntem makalesi

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

DOI:

10.3791/55001

⸱

27 Aralık 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronal Tau proteininin agregatları, Alzheimer hastalığı hastalarının nöronlarının içinde bulunur. Hastalığın gelişimine, Tau'nun artmış, anormal fosforilasyonu eşlik eder. Hastalıktaki Tau fonksiyonlarının ve işlev bozukluklarının moleküler araştırması sırasında, Tau'nun çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi kullanılır. Burada, NMR çalışmaları için izotopik zenginleştirme ile bakterilerde Tau'nun rekombinant üretiminin ayrıntılı protokollerini sunuyoruz. Tau'nun ısı kararlılığından ve yüksek izoelektrik noktasından yararlanan saflaştırma adımları açıklanmaktadır. Tau'nun rekombinant aktive edilmiş ERK2 ile in vitro fosforilasyonu için protokol, çoklu fosforilasyonların üretilmesine izin verir. Protein numunesi, bu adımların yayınlanmasında veri toplama için hazırdır. Spektrometrede kayda başlamak için parametre kurulumu daha sonra dikkate alınır. Son olarak, NMR verilerine dayalı olarak modifiye Tau'nun fosforilasyon bölgelerini belirleme stratejisi açıklanmaktadır. Bu metodolojinin, immüno-tespit veya kütle spektrometresi (MS) gibi fosforilasyon bölgelerini tanımlamak için kullanılan diğer tekniklere kıyasla faydası tartışılmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

21. yüzyılda sağlık temel güçlüklerden biri gibi Alzheimer hastalığı (AH) gibi nörodejeneratif hastalıklar bulunmaktadır. Tau mikrotübül (MT) oluşumunu teşvik eden bir mikrotübüle bağlı proteindir. Tau eşit çeşitli nörodejeneratif hastalıkların iyi bilinen AD olduğu sözde tauopatıler, yer almaktadır. Bu hastalıklarda, Tau çiftlenmiş helezon şeklinde lifler (PHF'ler) kendine gruplar ve fosforilasyon 1 ile posttranslasyonel modifikasyonlar (PTMS) birçok kalıntıları modifiye bulunur. Tau proteininin fosforilasyonu MT stabilizasyonu AD nöronları karakterize fonksiyon patolojik kaybı fizyolojik fonksiyonun iki düzenlenmesinde implike edilmektedir.

Hastalıklı nöronların PHF'lerin entegre Dahası, Tau proteini, kaçınılmaz 2 hiperfosforilatlandırılmaya edilir. 2-3 fosfat gruplarını içeren normal Tau aksine, PHF'lerin içinde hiperfosforilize Tau 5-9 Phosphat içeriyorE grupları, 3. Tau hiperfosforizasyon'un bazı bölgelerde ve fosforilasyon patolojik sitesi olarak adlandırılan ek yerleriyle fosforilasyonuna stokiyometri artışa hem de karşılık gelir. Ancak, üst üste seviye 4 nicel farklılıklara rağmen, AD ve fosforilasyon normal erişkin modelleri arasında var. Nasıl özel fosforilasyon olayları etkisi fonksiyonu ve Tau disfonksiyon büyük ölçüde bilinmemektedir. Biz, moleküler düzeyde PTMS tarafından Tau düzenleme deşifre hedefliyoruz.

Tau moleküler yönlerini anlayışı derinleştirmek için, teknik zorlukların üstesinden gelmek için var. İlk olarak, Tau çözelti içinde yalıtılmış bir içsel düzensiz protein (IDP) 'dir. Bu tür proteinler, fizyolojik koşullar altında, iyi tanımlanmış üç boyutlu bir yapıya sahip olmaması ve fonksiyon (lar) ve yapısal özelliklerini incelemek için, özellikle biyo-fiziksel yöntemler gerektirir. Tau yerinden edilmiş kişilerin artan sınıf için bir paradigma olduğunu sık sık ilişkili bulunduBöyle nörodejeneratif hastalıklar gibi patolojiler, bu nedenle görevlerini altında yatan moleküler parametreleri anlamak için ilgi artmaktadır. İkincisi, Tau fosforilasyonu karakterizasyonu uzun 441 amino asit Tau izoformunun dizisi boyunca 80 potansiyel fosforilasyon siteleri ile, bir meydan okumadır. Antikorların bir dizi Tau fosforile epitoplarına karşı geliştirilmiş ve nöronlar ve beyin dokusunda patolojik tau saptanması için kullanılır. Fosforilasyon olayları Proline zengin bölgede yakın çoğu prolin-yönelimli kinazlar tarafından hedef en az 20 sitelerinde yer alabilir. Nitel (hangi sitelerin?) Ve (Ne stoikiometri?) Kantitatif karakterizasyonu bile en son MS teknikleri 5 tarafından zordur.

NMR spektroskopisi çok konformerlerin topluluklar oluşturduğu dinamik sistemlerdir düzensiz proteinleri araştırmak için kullanılabilir. Yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi başvurunun oldued Tau proteini hem yapısını ve fonksiyonunu araştırmak için. 8 - Buna ek olarak, Tau fosforilasyon profilinin karmaşıklığı fosforilasyon 6 tanımlanması için NMR kullanılarak moleküler araçlar ve yeni analitik yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. bir analitik yöntemin NMR fosfat dahil ölçüde küresel bir şekilde Tau fosforilasyon tanımlanması, tek bir deneyde, tüm tek-mevkili modifikasyonlarının görselleştirme ve miktar tayini için izin verir. Tau üzerinde fosforilasyon Literatürde bol birlikte, çoğu fosforilasyonu profilinin tamamı üzerinde bir belirsizlik geniş çapta ve böylece tek tek fosforilasyon olaylarının gerçek etkisini bırakarak antikorlar ile gerçekleştirilmiştir için bu husus çok önemlidir. PKA, Glikojen-sentaz kinaz 3p (GSK3), sikline bağımlı kinaz 2 / siklin A (CDK2 / CycA), sikline bağlı kinaz 5 (CDK5) / p25 eylemi içeren rekombinant kinazlarTau doğru fosforlaştırma etkinliği görülür ivator proteini, hücre dışı sinyal ile düzenlenen kinaz 2 (ERK2) ve mikrotübül-afinite düzenleyici kinaz (Mark), bir aktif formda hazırlanabilir. Buna ek olarak, iyi karakterize edilmiş fosforilasyon desen belirli bir Tau proteini izoformlarının üretilmesi için izin Tau mutantları tau'nun fosforilasyonu kodunu çözmek için kullanılır. 8 - NMR spektroskopisi, sonra enzimatik olarak modifiye edilmiş Tau örnekleri 6 karakterize etmek için kullanılır. Tau in vitro fosforilasyonu glutamik asit (Glu) kalıntıları seçilen Ser / Thr mutasyon ile olduğu gibi sözde fosforilasyon daha zor olmasına rağmen, bu yaklaşım da yararları vardır. Gerçekten de, fosforilasyon, ne yapısal etkisi de etkileşim parametreler her zaman glutamik asit ile taklit edilebilir. Bir örnek Glu mutasyonları 9 ile yeniden değildir fosfoserin 202 (pSer202) etrafında gözlenen dönüş motifi / fosfotreonin 205 (pThr205) 'dir.

Burada, NMR incelemeleri için izotopik olarak etiketlenmiş Tau hazırlanması ilk olarak tarif edilecektir. ERK2 tarafından fosforile tau proteini fosforilasyon patolojik siteler olarak tanımlanan çok sayıda sitelerde modifiye ve böylece hiperfosforillenmiş Tau ilginç bir model temsil eder. Rekombinant ERK2 kinaz tarafından in vitro fosforilasyonuna Tau ayrıntılı bir protokol verilmektedir. 12 - ERK2 mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz / ERK kinaz (MEK) 10 ile fosforilasyonu ile aktif hale gelir. değiştirilirse izotopik olarak etiketlenmiş tau proteininin hazırlanmasına ek olarak, PTMS tespit etmek için kullanılan NMR stratejisi açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

15 N 1. üretimi, 13C-tau (Şekil 1)

  1. BL21 pET15b-Tau rekombinant T7 ifade plazmid 13,14 Transform (DE3) Yetkili Escherichia coli bakteri hücreleri 15.
    Not: en uzun (441 amino asit kalıntıları) Tau izoform cDNA kodlama pET15b plasmidde Ncol ve Xhol sınırlama siteleri arasında klonlanmıştır.
    1. Yetkili BL21 1.5 ml'lik plastik bir tüp içinde plasmid DNA, 100 ng plazmid DNA ug başına 1-5 x 10 7 koloni oluşturan (DE3) hücreleri nazikçe 50 ul karıştırın.
      Not: ökaryotik cDNA ifade için kodon-optimize kullanımı bakteri türleri insan Tau üretmek için gerekli değildir.
    2. 42 ° C'de 10 saniye boyunca, daha sonra 30 dakika karıştırıldı ve ısı şoku buz üzerinde hücre karışımı yerleştirin. Lütfen, buz üzerinde 5 dakika için tüp ve oda sıcaklığında LB (Luria-Bertani) orta 1 ml. yumuşak altında 30 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta bakteriyel bir süspansiyon inkübeçalkalama.
  2. ampisilin antibiyotik, 100 ug / ml içeren LB ortamında bir agar plakası üzerine bir aşılama köprüsü eşit hücre süspansiyonu 100 ul kullanılarak yayıldı.
  3. 37 ° C'de 15 saat için seçim plaka inkübe edin.
  4. Yaklaşık 2 haftalık bir süre için, kültür adımına geçmeden kadar 4 ° C 'de bir seçim plaka tutun.
    Not: bakteri kültürü (% 50 gliserol) bir gliserol stoku, -80 ° C'de saklandı, daha sonraki bir aşamada başlangıç ​​kültürü olarak hazırlanabilir.
  5. Otoklavlanmış M9 tuzlarının 1 L (6 g 2 Na HPO 4, 3 gr KH 2 PO 4 mi, 100 mM CaCl2, 10 mi 100x MEM vitamin kompleman 1 ml 1 M MgSO 4, 1, 1 mi, 100 mg / ml ampisilin ekleme , 0.5 g NaCI).
    NOT: beyaz bir çökelti hızlı bir şekilde dağılır M9 tuzları CaCI2 çözeltisi ilave edilmesi üzerine oluşturacaktır.
  6. 15 N, 300 mg 13 C-tam orta, 15 1 g çözünürNH4CI ile 13 ° C M9 ortam 6 -glükoz 10 ml 2 g. -Filtre sterilize doğrudan M9 ortama, bir 0.2 mikron filtre kullanarak izotop çözümü.
  7. ampisilin, 100 ug / ml ile takviye edilmiş LB ortamı 20 ml seçeneklerini plaka bakteri dönüştürülmüş pET15b-Tau bir aşılama köprüsü bir koloni ile askıya alınması.
  8. 6 saat boyunca 37 ° C'de aşılandı orta inkübe edin.
  9. Plastik bir spektrometre küvet içinde bakteriyel kültür on kat seyreltme 1 ml, 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk ölçülür.
    Not: 3,0-4,0 600 OD tekabül eden bakteriyel kültür bulanıklığı doygunluk büyüme fazı ulaşılır belirtir.
  10. 2 L'lik bir Erlenmeyer plastik bölmeli bir kültür şişesi içinde, ampisilin (100 ug / ml nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş M9 büyüme ortamı, 1 L doymuş LB kültür 20 ml ekleyin.
  11. 10 ° ayarlanmış programlanabilir inkübatör kültür şişesi yerleştirinC ve 50 rpm. Ertesi gün sabah erkenden 200 rpm ve 37 ° C geçmek için inkübatör Program.
  12. Plastik bir spektrometre küvet içinde bakteri kültürü, 1 ml'lik Ölçü OD 600. 1 M IPTG 400 ul (izopropil P-D-1-tiogalaktopiranosid) OD 600 biraraya getiren tau proteininin ekspresyonunu indüklemek için yaklaşık 1.0 arasında bir değere ulaştığında (-20 ° C'de saklanan) stok çözeltisi ekleyin.
  13. ilave 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübasyon devam edin. 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ile bakteri hücreleri toplamak.
  14. -20 ° C'de bakteriyel pelet dondurun. Gerekirse bir süre için, saflaştırma adımı kadar donmuş tutun.

15 N 2. saflaştırılması, 13C-tau (Şekil 2)

  1. 121 ° C'de otoklav katyon değişimli (CEX), saflaştırma, tamponlar, 20 dakika boyunca 15 psi altında. 4 ° C'de saklayın tamponlar.
  2. bakteriyel hücre pelet çözülme ve 45 ml iyice tekrar süspansiyon haline getirinekstraksiyon cex bir tampon maddesi (50 mM NaPi tamponu pH 6.5, 1 mM EDTA), taze proteaz inhibitör kokteyli 1x (1 tablet) ve DNasel (2.000 ünite) ile takviye edilmiştir.
  3. 20.000 psi'de bir yüksek basınç homojenizatörü kullanılarak bakteriyel hücrelerin bozulması. 3-4 geçiş gereklidir. 40 dakika için 20,000 x g'de santrifüjleyin çözünmeyen malzemenin ayrılması için.
  4. bir su banyosu kullanılarak 75 ° C 'de 15 dakika süre ile bakteriyel hücre özü ısıtın.
    NOT: beyaz bir çökelti, birkaç dakika sonra gözlemlenmiştir.
  5. 20 dakika için 15,000 x g'de santrifüjleyin ve ısıya karşı kararlı Tau protein içeren süpernatant, tutun.
  6. Aşağıdaki saflaştırma adımı kadar -20 ° C'de saklayın, gerekirse.
  7. Bir hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi (Şekil 3 A) ile 5 ml yatak kolonu gibi paketlenmiş güçlü CEX reçine üzerinde bir katyon-değişim kromatografisi gerçekleştirin.
    1. 2.5 ml / dak sabit akış hızı.
    2. Bir tampon cex sütunu dengelenmesi
    3. 60-70 ml heated- yükleyinTau Örnek pompası kullanılarak içeren özü, ya da seçenek olarak sistemine bağlı olarak, bir pompa. akış yoluyla analiz Tau proteini verimli (2.8) reçine bağlayıcı olduğunu doğrulamak için toplayın.
    4. Lütfen başlangıç ​​değerine için 280 nm'de absorbans kadar Cex ile bir tampon reçine yıkanır.
    5. CEX B tamponu kademeli bir artış ile elde edilen üç aşamalı bir NaCI gradyanı kullanılarak kolondan Elute Tau (CEX 1 M NaCI ile tampon A). Program FPLC aşağıdaki gibidir: 500 mM NaCI ulaşmak için 5 CV 250 mM NaCl,% 50 CEX tampon B'ye ikinci adımı ulaşmak için 10 kolon hacim (CV) içinde% 25 CEX tampon B'ye gradyan ilk aşaması ve üçüncü adımı 2 CV% 100 CEX B tamponu 1 M NaCl ulaşmak için. elüsyon adımları sırasında 1.5 mL fraksiyon toplanır.
  8. SDS-PAGE (% 12 SDS-akrilamid jeli) ve Coomassie boyama (Şekil 3 A), 16 tarafından elusyon basamağı sırasında toplanan fraksiyonlar 10 ul analiz edin. analy tarafından da kolon üzerinde yükleme adımı kontrolflow-through 10 ul zing.
  9. Tau içeren kesirler seçin ve bir sonraki adım için bu kesirler havuz.
  10. Tau-içeren toplanmış fraksiyonların (Şekil 3 B) bir tampon değişimi gerçekleştirin.
    1. Bir FPLC sistemi kullanılarak 50 mM amonyum bikarbonat (uçucu tamponu) 53 mi G25 reçinesi paketlenmiş yatak (26 x 10 cm) bir tuz alıcı sütun dengelenmesi.
    2. 5 ml / dk için sabit akış hızı. 5 ml'lik bir enjeksiyon döngüsü ile sütun üzerinde Tau örnek enjekte edilir. 280 nm 'de absorpsiyon tepe noktasına karşılık gelen fraksiyonlar toplanır.
    3. İlk CEX havuzun hacmine bağlı olarak, enjeksiyonu 3-4 kez tekrarlayın.
  11. 280 nm'de (Tau 1 mg 140 Mau * ml tekabül eder) de kromatogramının pik alanı kullanılarak, saflaştırılmış tau proteininin miktarını hesaplayın.
    Not: 280 nm tau proteininin sönüm katsayısı 7550 M-1 cm-1 olan. Tau bir Trp kalıntısı içermez.
  12. Havuz tüm Tau fraksiyonları.
  13. AliquoTau 1-5 mg eşdeğeri içeren tüplere örnek t. çözeltisinin hacmi borusu (50 ml tüp içinde çözelti, örneğin 5 mi) hacmi ile karşılaştırıldığında küçük olup, böylece, bu tüpler seçin.
  14. Bir iğne kullanılarak tüp kapaklar delikler. -80 ° C'de Tau örnekleri dondurun.
  15. Liyofilize edilir Tau örnekler. Liyofilize Tau proteini uzun bir süre boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.

15 N-Tau 3. İn Vitro Fosforilasyon

  1. 500 ul fosforilasyon tamponu (50 mM Hepes · KOH, pH 8.0, 12.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCI), liyofilize Tau 5 mg eritin.
  2. 0.5 M stoktan 2,5 mM ATP (100 mM'lik bir stok çözeltiden 25 ul, -20 ° C'de tutulur), 1 mM DTT (1 M stok çözeltisinin 1 ul -20 ° C 'de tutulur), 1 mM EGTA ekleyin (2 ul çözelti), 1 x proteaz inhibitör kokteyli (1 mi fosforilasyon tamponu içinde 1 tablet çözülmesiyle elde edilen bir 40x stoklar 25 | il) ve 181; M His-ERK2 aktif (koruma tampon maddesi içinde 250 ul 10 -80 ° C'de saklandı mM HEPES, pH 7.3, 1 mM DTT, 5 mM MgCI2, 100 mM NaCI ve% 10 gliserol), toplam numune hacminin 1 mi.
    NOT: Aktif His-ERK2 MEK kinaz ile fosforilasyonu ile in-house 5,8 hazırlanabilir.
  3. 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
  4. ERK kinaz inaktive etmek için 15 dakika süreyle 75 ° C de bir örnek ısıtılır.
  5. 15 dakika için 20,000 x g'de santrifüjleyin. Toplamak ve süpernatant tutun.
  6. 1 ml'lik bir örnek için uygundur 3.45 mi G25 reçinesi paketlenmiş yatak (1.3 x 2.6 cm), bir kolon kullanılarak 50 mM amonyum bikarbonat içine protein örnek desalt.
  7. Bütünlüğünü ve verimli fosforilasyon (Şekil 4) kontrol etmek için protein örnek 2.5 ul% 12 SDS-PAGE 16 çalıştırın.
  8. fosforile tau örnek liyofilize. -20 ° C'de bir toz saklayın.

NMR Spectra 4. Acquisition (Fişekil 5)

  1. Liyofilize 15 N 4 mg, 400 ul NMR tamponu içinde 13 C ERK-fosforile-tau (50 mM NaPi veya tris- D11 .Cl dötere 50 mM, pH 6.5, 30 mM NaCI, 2.5 mM EDTA, 1 mM DTT) çözünürleştirilir.
  2. İç NMR sinyali referans olarak NMR spektrometresi alan kilitleme ve 1 mM TMSP (3- (trimetilsilil) propiyonik-2,2,3,3-d4 asit sodyum tuzu))% 5 D 2 O ekleyin. tam proteaz inhibitör kokteyli 40x stok çözeltisi 10 ul ekle.
  3. uzun bir iğne ya da Pasteur pipeti ile bir elektronik şırınga kullanılarak 5 mm'lik NMR tüpü içinde örnek aktarın. pistonu kullanarak NMR tüpü kapatın. piston hareketleri ile piston ve sıvı arasında sıkışmış hava kabarcığı çıkarın.
  4. bir döndürücüye NMR tüpü yerleştirin. örnek çözeltisi çoğu NMR bobin içinde olacak şekilde, kullanılan NMR prob kafası için uygun göstergesi ile spinner kendi dikey konumunu ayarlar.
  5. Hava akışını başlatmak: asansör i tıklayınn mıknatıs kontrol sistemi penceresi. Dikkatle mıknatıs deliğin üstündeki hava akımı tüp ile spinner yerleştirin. Hava akışını durdurmak (lift tıklayın) ve tüp mıknatıs prob kafasının içinde yerine iner edelim.
  6. 25 ° C (298 K) 'ye ayarlama sıcaklığı.
  7. güç iletimini optimize etmek için yarı-otomatik ayarlamayı ve prob kafasının eşleştirme gerçekleştirin. Komut satırında atmm yazın.
  8. Döteryum kanalda kayıtlı numunenin D 2 O sinyali kullanarak spektrometre frekansını kilitleyin. Mıknatıs kontrol sistemi penceresinde kilidi tıklayın.
  9. Numunenin pozisyonda manyetik alanın homojenliğini optimize layneri prosedürü başlatın. Şim penceresini açmak için komut satırında gui topshim yazın. Şim penceresinde başlangıç tıklayın. şimleri (en az 2 Hz iyidir) optimum olduğunu doğrulamak için kalan B0 standart varyasyon değerini kontrol edin.
  10. bir protonun p1 parametresini (uzunluk kalibreProton spin 90 ° rotasyon elde etmek için gerekli olan mikro-saniye radyofrekans darbe). Su proton 1D spektrumunu (Şekil 6) kullanılarak 360 ° darbe hedefleyin.
  11. (Şekil 6) 1D spektrumunda proton su frekansa (Hz) o1 parametresini ayarlayarak ofset frekansı ayarlayın.
  12. Örnek (Şekil 7) gelen sinyalleri kontrol etmek için (örneğin zggpw5, su sinyal bastırılması watergate sırası ile atım dizisi) 1B proton spektrumunun edinimi başlar. göreceli bir protein konsantrasyonuna taramalarının sayısını uyarlayın. Edinimi başlatmak için komut satırında zg yazın.
  13. 2B alımı için ek parametrelerini ayarlamak [1 H, 15 N] HSQC spektrumu (darbe dizisi hsqcetfpf3gpsi, 8-9 Şekiller).
    1. Bir 15 N için 13 C 15 N dolaylı evrimi sırasında 13 C decouple, örnek etiketli.
    2. Noktalarının sayısını ve 1 H (F2) ve 15 N (F1) boyutlarında spektrum genişliği (ppm) ayarlayın.
      NOT: noktasının başına Hz benzer sayıda tutmak için spektrometre alanına edinme veri noktalarının sayısını uyarlayın ve saatleri ayırımı sınırlamak için: 1 H boyutta, 900 MHz ve 600 MHz hızında 2048 noktada 3072 puan kullanın.
    3. , Darbe dizilerinin ek parametrelerini optimize gecikmeler, darbe uzunlukları karşılık, frekansları, güç seviyeleri ofset. Komut satırında ased tip deney için ilgili tüm parametreleri görüntülemek için.
  14. 3D kazanılması için set parametreleri [1 H, 15 N, 13 C] HNCACB spektrumu (darbe dizisi hncacbgpwg3d, Şekil 10A) 600 MHz'de.
  15. 600 MHz hızında 3D [1 H, 15 N, 15 N] HNCANNH deneyi (darbe dizisi hncannhgpwg3d) için parametreleri ayarlayın. 1 H 2048 noktalarının sayısını ayarlayın ve 64ve iki 15 K boyutta 128 sayı. 25 milyon (ppm) başına 25 parça 4.7, 119, 1 H 119 ppm, 15 N ile 15 N boyutları üzerinde merkezlenmiş 14 olarak spektral genişlikleri tanımlar. 16 taramaları ile iktisap Süresi 1 gün ve 22 saattir.

Fosforilasyon Siteleri 5. Tanımlama

  1. toplama ve işleme NMR yazılımını kullanarak proses spektrumları.
    1. Veri (Şekil 7) bir Fourier dönüşümünü gerçekleştirir. 1D spektrumu için Tip ft, bir 2D spektrumu için Xfb veya komut satırında, 3D spektrum için ft3d.
    2. Faz ve referans tüm spektrumları (Şekil 7C) interaktif pencereleri kullanarak.
  2. 2D HSQC potansiyel fosforile Ser ve Thr artıklarının (Şekil 9, kırmızı kutu) karşılık gelen ilgi rezonans tanımlayın.
  3. Özü uçakları (yani 2D 1H 13 C spektrumları)2B ilgi rezonans 15 N kimyasal kaymalar kullanarak 3D 1 H 15 N 13 C spektrumu. Görüntülenmiştir edilecek düzlem (w1-w3) karşılık gelen 15 N frekansı (Şekil 10B) seçmek için boyut 2 (w2) imleci kullanın.
  4. Her biri için 'CA' rezonans frekanslarını ve 'i' ve 'CB' 13 C çekirdekleri ve 'i-1' tortuları, (i kalıntısının kıyasla sinyallerin zayıf kümesi) seçin [1 H, 15 N] rezonans işaretçi modu menüsünde, rezonans tıklayarak HNCACB 3D spektrumunda bir ilgi zirve listesi dosyasında kimyasal kayma değer katmak, zirve eklemek / bulabilirsiniz.
    1. Bilinen CA değerleri ve pSer ve PTHr 17 CB kimyasal değişikliklere zirve listesinde kimyasal kaymalar karşılaştırarak, ben kalıntı tipi, pSer veya PTHr tanımlayın.
    2. karakteristik Ek 2 ppm kayması o I + 1 konumunda bir Pro kalıntısını varlığının belirlenmesiCA kimyasal kayma değeri 18 f.
    3. I-1 pozisyonunda tortu doğasını belirlemek için Tau amino asit kalıntıları 19 için öngörülen kimyasal kaymalar bir tablo I-1 kalıntıya karşılık gelen, CA ve CB rezonansların kimyasal kayma değerleri, karşılaştır.
  5. HNCANNH spektrumda ilgi her [1 H 15 N] rezonans rezonans 'i' 15 N çekirdeklerinin frekansları ve "i-1 'artıkları seçin.
  6. 23 - Tau proteini 20 kimyasal kayma atama 15 N kimyasal kayma değerleri karşılaştırın.
  7. diziye özgü atama tanımlamak için Tau dizisi ile özdeşleşmiş dipeptidler karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 3A, elüsyon gradyanı gözlenen 280 nm'de büyük bir emilim pik gösterir. kromatogram üzerinde akrilamid jeli üzerinde görüldüğü gibi, bu seviye, saflaştırılmış tau proteininin karşılık gelir. Şekil 3B proteininin tuzsuzlaştırma verimli olmasını sağlamak, 280 nm ve iletkenliği zirvesinde bir iyi ayrılmış emilim pik gösterir. Şekil 4, bir protein, SDS-PAGE analizi ile çok sayıda protein fosforilasyonu 16 karakteristik gözlenen jel shift (kuşak 2 ve 3). Gösterir Şekil 6,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz enzimatik modifiye Tau örnekleri karakterize etmek NMR spektroskopisi kullandık. Rekombinant sentezleme ve tam boyunda insan tau proteinini burada tarif edilen saflaştırma Benzer mutant tau ya da tau etki üretmek için kullanılabilir. Izotopik olarak zenginleştirilmiş protein, yeniden birleştirici ifade gerektiren NMR spektroskopi için gereklidir. Fosforilasyon alanların belirlenmesi rezonans atama ve 15 N, 13 C çift etiketli protein gerektirir. izotopların maliyeti göz önüne alındığında, iyi bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMR tesisleri, Région Nord, CNRS, Lille Pasteur Enstitüsü, Avrupa Topluluğu (FEDER), Fransız Araştırma Bakanlığı ve Lille Bilim ve Teknoloji Üniversitesi tarafından finanse edildi. TGE RMN THC (FR-3050, Fransa), FRABio (FR 3688, Fransa) ve Lille NMR ve RPE Sağlık ve Biyoloji çekirdek tesisinden gelen desteği kabul ediyoruz. Araştırmamız LabEx (Mükemmeliyet Laboratuvarı), DISTALZ (Alzheimer hastalığına Transdisipliner Bir Yaklaşım için Yenilikçi Stratejilerin Geliştirilmesi), EU ITN TASPPI ve ANR BinAlz'dan alınan hibelerle desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pET15B rekombinant T7 ekspresyon plazmidiNovagen69257-20 °C'de tutun; C
BL21 (DE3) dönüşümü yetkin E. coli< / em> bakteriNew England BiolabsC2527I-80 ° C'de tutun; C
Otoklavlanmış LB Et Suyu, Lennox DIFCO240210Bakteri Büyüme Ortamı
MEM vitamini 100xSigma58970CBakteri Büyüme Ortamı
Takviyesi15< / sup>N, 13< / sup>C-ISOGRO tam orta tozSigma608297Bakteriyel Büyüme Ortamı Takviyesi
15< / sup>NH4< / sub>ClSigma299251İzotopu
13< / sup>C 6< / sub>-GlukozSigma389374İzotop Proteaz
inhibitörü tabletleri & nbsp;Roche50564890014 & derece'de tutun; C
1 ml'de 1 tablet, -20 ° C'de tutulabilen 40x çözeltidir; C
DNaseIEUROMEDEX1307-20 ° C'de tutun & C
Homojenizatör (EmulsiFlex-C3)AVESTINLizisi 4 ° C'de gerçekleştirilir; C
Pierce ve ticaret; Boyanmamış Protein MW İşaretleyiciPierce266109
Aktif insan MEK1 kinaz, GST EtiketliSigmaM8822-80 °C'de tutun; C
AKT & AUML; Saf kromatografi sistemiGE HealthcareFPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml kolon)GE Healthcare17-5156-01Katyon değişim kromatografisi kolonları
HiPrep 26/10 Tuzdan arındırmaGE Healthcare17-5087-01Protein Tuzdan Arındırma kolonu
PD MidiTrap G-25GE Healthcare28-9180-08Protein Tuz Giderme kolonu
Tris D11, %97 DCortecnetCD4035P5Döteryumlu NMR tamponu
5 mm Simetrik Mikrotüp SHIGEMI D2O (5 iç ve dış boru seti)& nbsp;Euriso-topBMS-005BNMR Shigemi Tüpleri
eVol kiti-elektronik şırınga başlangıç kitiCortecnet2910000
Pipetleme Bruker 900 MHz AvanceIII, üçlü rezonans kriyojenik prob kafalıBrukerNMR spektrometresi Veri toplama için
Bruker 600 MHz Avance, üçlü rezonans kriyojenik prob kafalıBrukerNMR spektrometresi
TopSpin 3.1NMR deneyleri içinBruker
Sparky 3.114UCSF (T. D. Goddard ve D. G. Kneller)NMR veri Analiz yazılımı
Bruker NMR spektrometresi Edinme ve İşleme yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482(2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34(2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679(2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521(2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tau Proteini FosforilasyonuRekombinant Protein retimizotopik Zenginle tirmeKatyon De i im KromatografisiIs Kararl l Safla t rmasIn Vitro FosforilasyonNMR Veri Kazan mFosforilasyon B lgesi Tan mlama

İlgili makaleler