Yöntem makalesi

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

DOI:

10.3791/55004

⸱

5 Mart 2017

 ,  , 
1Plant Biology Section, School of Integrative Plant Science, Cornell University, 2Department of Developmental Genetics, University of Wyoming

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişimsel olarak önemli birçok genin hücre veya dokuya özgü ekspresyon paternleri vardır. Bu makale, mısır yaprağı bıçak-kılıf sınırında ve lg1-R mutantlarında vahşi tipe kıyasla farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlamak için LM RNA-seq deneylerini açıklamaktadır. Burada tartışılan deneysel düşünceler, diğer gelişimsel fenomenlerin transkriptomik analizleri için geçerlidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

gelişmesinde önemli rolleri olan genler sıklıkla mekansal ve / veya zamansal sınırlı ifade desenleri var. Genellikle bu gen transkript tespit edilmemiştir ya da farklı olarak tüm bitki organlarının transkriptomik analizlerinde (DE) ifade edildiği gibi tanımlanmamıştır. Lazer Diseksiyon RNA Seq (LM RNA Seq) özel gelişimsel alanlarda DE olan genleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, hücresel alanlarının seçimi microdissect ve karşılaştırmak ve microdissections doğruluğu deneylerin başarısı için çok önemlidir için. Burada, iki örnek transkriptomik deneyler için tasarım konuları göstermektedir; RNA DİZİ analizi, mısır yaprağı yakın-uzak eksen boyunca de genleri belirlemek için bir LM ve ikinci bir deney, DE liguleless1-R (LG1-R) olan genleri tanımlamak için mutantlar vahşi tip ile karşılaştırıldığında. Bu deneylerin başarısına katkıda kilit unsurları histolojik ve si ayrıntılı edilditu melezleme analiz edilecek bölgenin analizleri, eşdeğer gelişim aşamalarında yaprak primordiasında seçimi, morfolojik yerlerinden kullanımı mikrodiseksiyon bölgeleri seçin ve hassas ölçümler etki mikrodisseksiyon için. Bu makale LM RNA Sek tarafından gelişimsel etki analizi için ayrıntılı bir protokol sağlar. Burada sunulan veriler mikrodiseksiyon seçilen bölge elde edilen sonuçları nasıl etkileyeceğini göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetik diseksiyon (Şekil 1A) için uygun olan bıçak ve kılıf arasında belirgin bir sınır olduğu gibi mısır yaprağı, morfolojilerinden sırasında gelişimsel alanların oluşumunu incelemek için ideal bir model. yaprak gelişimi, küçük hücrelerden oluşan bir lineer grubun ilk aşamalarında, preligule bandı (PLB), pre-bıçak ve ön kılıf etki alanlarına yaprak primordium'u subdivides. Bir saçak gibi ligule ve üçgen kulakcık PLB (Şekil 1A, C, D) gelişir. Genetik ekranlar bıçak kılıf sınırını bozan mutasyonlar saptanmıştır. Örneğin, resesif liguleless1 (LG1) mutasyonları ligule kulakçıkların, 1, 2, 3, 4 (Şekil 1B) silin. İn situ hibridizasyon LG1 transkript P birikir ortayaLB ve ligule gelişme 5, 6 (Şekil 1E) için o mükemmel bir işaretleyici yaparak, ligule ortaya çıkıyor.

figure-introduction-1
Şekil 1: vahşi tip ve liguleless1-R mısır yaprakları. Ligule ve kulak kepçesi yapıları gösteren, olgun, vahşi tip yaprak (A) Bıçak kaplama sınır bölgesi. (B) ligule ve kulak kepçesi yapıların olgun liguleless1-R yaprak gösteren yokluğunda Bıçak kılıf sınır bölgesi. A ve B Yapraklar yaprak orta damarı boyunca yarıya edilmiştir. Vahşi tip yaprak primordiumunun yoluyla (C) Boyuna kesit. Örnek işleme ve histolojik analiz için boyanmıştır edilmiştir. başlatılması ligule yaprak (ok başı) düzleminden dışarı çıkıntı yapan bir tümsek belirgindir. (D) Boyuna mezhepvahşi tip yaprak primordiumunun yoluyla iyon. metinde tarif edildiği gibi Örnek LM için işlenmiştir. Ok başı ligule başlatılması gösterir. Sürgün ucuna uzunlamasına yanal bölümün in situ hibridizasyon (E) LG1. Yıldız P6 yaprak primordiumunun PLB de LG1 transkript birikimi gösterir. Oklar P6 primordium'un tabanını gösterir. Bar PLB için primordium'un tabanından ölçümünü gösterir. A ve B Ölçek çubukları 20 mm =. CE Ölçek çubukları = 100 mikron. Bu rakam referans 6 (Bitki Biyologlar Telif Amerikan Derneği) modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu çalışmada, LM RNA Seq yaprak primordiumunun ve ide diğer bölgelerine bıçak-kılıf sınır nispetle farklı ifade edilen genlerin bir paketi (DE) tanımlamak için kullanılmıştır vahşi tip kardeşleri göre LG1-R mutantlar DE vardır ntify genler. LM RNA Seq özel hücreler ya da hücre alan 7 transkript birikimi ölçülmesi için bir yöntem olup. LM sistemleri lazer ve bir dijital kamera ile bir mikroskop birleştirir. Kesitli doku slaytlar üzerine monte edilir ve mikroskop aracılığıyla görüntülenebilir. LM yazılım genellikle kullanıcı mikrodiseksiyon seçilen herhangi bir bölgeyi anahat izin çizim araçları içerir. hat boyunca lazer kesim ve seçilen doku slayt kapalı mancınık ve slayt üzerinde asılı bir tüp içine almaktadır. LM kullanıcıya özel hücre katmanları ve hatta tek hücreler 8, 9 da dahil olmak üzere hassas etki, microdissect sağlar. RNA daha sonra microdissected dokusundan elde edilebilir. Daha sonra, RNA-Seq bileşen çıkarılan RNA 10 üretilen cDNA kütüphaneleri sıralamak için yeni nesil dizileme kullanır,= "xref"> 11.

LM RNA seq Anahtar avantajları kesin olarak tanımlanmış alanlarda transkript birikimi ölçmek yeteneği ve tüm transkriptom aynı anda 7 profile kapasite vardır. teknik faiz bölge genellikle mikroskobik erken gelişim olayları sondalama için uygundur. Daha önceki çalışmalar, LM bitkiler 9, 12, 13, gelişim süreçleri incelemek için mikrodizi teknolojisi ile birlikte kullanmıştır. RNA Seq düşük ifade edilen genler de dahil olmak üzere, geniş bir dinamik aralık, arasında transkript miktarının avantajı vardır ve önceki dizi bilgisi, 11 10 gerekli değildir. Ayrıca, LM RNA Seq nedeniyle-of-zarara genetik fazlalık veya öldürücülüğü için mutagenez ekranlarında gözden kaçabilir gelişimsel olarak önemli genlerin vurgulamak için potansiyele sahiptirfonksiyon mutant.

Bu tür dar bir sheath1 (NS1) ve kupa şekilli cotyledon2 (CUC2) halinde gelişimsel olarak önemli genler, genellikle sadece bir spesifik ekspresyon modelleri ya da birkaç hücre 17, 18, 19, 20 sahiptir. Çoğu sadece erken gelişim evrelerinde ve olgun bir organ olarak ifade edilir. Bütün organlar ya da büyük etki incelendiğinde, bu hücreye spesifik transkriptler seyreltilmiş ve daha geleneksel analizlerde tespit edilemez. kesin olarak tanımlanmış etki analiz edilmesine izin vererek, LM RNA Seq bu dokuya özgü genler belirlendi ve miktarları tayin edilmesini sağlar.

Burada tarif edilen deneylerde başarısında önemli faktörlerdir bir analiz için uygun gelişim aşamasında ve etki alanının seçimi güdümlü tam histolojik analiz ve hassas measureme vardıLM hücre dokusunu etki nt. Eş etki her kopya için örneklendi emin olmak için, doku, aynı gelişim aşamasında, yaprak primordia toplandı ve microdissected etki, ortaya çıkan ligule (Şekil 2) gibi morfolojik noktalara göre ölçülmüştür. Bazı genler, yaprak tabanına ucundan gradyanı olarak ifade edilmiştir bilinmektedir. Nedeniyle yaprak proksimal-distal ekseni boyunca farklı yerlerden numune hassas etki, varyasyon ölçerek en az (Şekil 3A) tutuldu. Aynı boyutta etki microdissecting ile nedeniyle değişkenlik hücreye özel transkriptlerin seyreltme (Şekil 3B) indirgenerek diferansiyel. Atış apeksinin yan uzunlamasına kesitleri, tüm microdissections kullanılmıştır. Bunlar (Şekil 4) yaprak orta damarı-margin eksenine dik bölümler vardır. SAM içeren tek bölümleri kullanarak o eşdeğer yanal bölgeleri sağlaryaprak taslakları analiz edilir.

İşlenmiş ve LM için kesitli numunelerde, ligule akıbet ilk morfolojik işareti nedeniyle adaxial epidermis (Şekil 1D, Şekil 2) periclinal hücre bölünmeleri adaxial tarafında bir darbedir. Gelişmekte olan ligule güvenilir plastochron 7 aşamalı yaprak primordiasında tespit edilebilir o belirlenmiştir. Biz gelişmekte olan ligule ve kulak kepçesi oluşturacaktır hemen uzak hücreleri dahil olmak üzere tüm ligule bölgede ifade genler, ilgilenmişlerdir. Eşdeğer doku seçimi yapılırken sağlamak amacıyla, ligule yumru morfolojik işareti olarak kullanıldı ve ligule yumru merkezli 100 um dikdörtgen LM (Şekil 2A, 2B) için seçildi. Ön bıçak ve ön kılıfın aynı büyüklükte dikdörtgenler aynı yaprak primordia seçilmiştir.

liguleless mutant bitkilerin analizi Farklı challe sunulmaktadırnge; LG1-R mutantlar bu nedenle bu morfolojik özellik LM için bölgeyi seçmek için kullanılan olamazdı bir ligule, oluşturmazlar. Bunun yerine, vahşi tip yaprak primordia olarak LG1 transkript birikimi alanı tespit edildi ve bu da kapsamak olan bir bölge tanımlanmıştır. son tahlilde için kullanılan önceki çalışma PLB yeri büyüme koşullarına bağlı olarak değişir göstermiştir beri bu ön analizler, aynı dikimden itibaren fidelerin üzerinde gerçekleştirilmiştir. In situ hibridizasyon LG1 transkript PLB P6 yaprak primordia (Şekil 1 E) birikir olduğunu göstermiştir. Biz LG1 ifadesinin alanını (mor dikdörtgenler, Şekil 2A) kapsıyor ve yabani tip ve LG1-R bitkilerden bu eşdeğer bölgeleri ele yaprak primordiasında tabanından bir alanı 400-900 mikron seçilmiş. transkripsiyonu karşılaştırırken genetik altyapı ve büyüme şartlarına varyasyonu en aza indirmek içinLG1-R ve vahşi tip bitkiler, mutant ve vahşi tipli kardeşlerinden ailelerini ayırma t birikimi kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Doku LM için sabit olduğunu, aynı zamanda histolojik analiz için doku sabitleyin. Daha sonra LM rehberlik edecek morfolojik özellikler için lekeli bölümleri inceleyin. Vahşi tip mutant karşılaştırıldığında, (bu durumda LG1) ilgili gen ifade alan tanımlamak için bir yerinde hibridizasyon veya bağışık gerçekleştirmek.

1. Doku Sabitleme ve İşleme

  1. Standart koşullar 6 altında eski iki hafta mısır fidelerinin daire büyür.
  2. Yanal bölümler (Şekil 4) için ateş apices teşrih.
    1. sadece toprak sınırının altında Tüketim fide.
    2. Bir jilet kullanarak, bir ya da iki olgun yapraklar çevrelediği culm oval görünür (Şekil 4B) kadar kök (kesikler 1, Şekil 4A) tabanından ince dilim çıkarın.
    3. Başka bir kesim tabanı üzerinde yaklaşık 10 mm (Şekil 4A 2 kesme) olun.Bu 10 mm segmenti SAM ve genç yaprak primordiasında içerecektir.
    4. Baz yukarı bakacak şekilde 10 mm segmenti çevirin. Kalın bir doku 2-3 mm'lik bir kesit elde edilir, böylece iki kesim yanal eksene paralel hale (kesikler 3 ve 4, Şekil 4B). Dış iki porsiyon atın ve sabitleme ve benimsenmesi için merkezi dilim saklayın.
      NOT: Dış yaprakları kesilmiş ve atılabilir.
  3. gömmek için doku ve süreci sabitleyin.
    1. RNaz ücretsiz olan tüm malzemelerin daha sonraki kademelerde kullanım için emin olun. (. Çözeltinin litresi başına 1 mi DEPC, arada bir sallanarak ve otoklav ile bir gece boyunca inkübe) dietil pirokarbonat (DEPC) ile çözümleri tedavi edin. Fırında 200 ° C de bir fırında cam veya en az 6 saat boyunca daha yüksek ve RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile plastik eşya tedavi.
    2. Gün 1: buz üzerinde bir cam şişe içinde (asetik asit: 1 Etanol 3) ~ çiftçi düzeltmenin 10 ml doku dilimleri bırakın. Tüm numuneler kesilerek sonra, Vacuu geçerlidirm hava kabarcıkları ve fiksatif yardım penetrasyonunu kaldırmak için. 10 dk sonra yavaşça vakumu boşaltmak için vakum altında tutun. Fiksatif değiştirin ve hafifçe çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    3. 2. Gün:, çözeltiler, aşağıdaki seri inkübe ~ her biri 10 mL, 1 saat, her biri hafifçe çalkalanarak Tüm; 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C 'de% 100 etanol% 100 etanol% 100 etanol% 95 etanol, 1 ile% 85 etanol: 1 etanol: Oda sıcaklığında ksilenler, Oda sıcaklığında% 100 ksilenler, oda sıcaklığında% 100 ksilenler.
      NOT: ksilen temas ve solunum yoluyla zehirlidir. Davlumbaz çalışmak ve uygun eldiven kullanın.
    4. ksilen, yaklaşık yarım hacme orta peletler gömme parafın doku eklenir ve yavaşça çalkalanarak, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir.
    5. 3. Gün: peletler eriyene kadar 60 ° C fırında, şişe aktarın. çözüm dökün ve taze erimiş doku gömme ortamı ile değiştirin. Orta iki kez daha değiştirmegün boyunca.
    6. 4. Gün: Sabah bir kez gömme orta Değişim doku. Öğleden sonraya kadar 60 ° C fırında dönün.
  4. Oyuncular blokları
    1. Doku gömme istasyonunun sıcak plaka üzerinde gömme kalıpları yerleştirin. kesim yüzeyi aşağı bakacak şekilde gömme kalıplara doku örnekleri aktarmak için forseps kullanabilir. Erimiş parafin ile kalıp kontör ve kalıp üstüne gömme halkasını yerleştirin. parafin katılaşmış kadar soğuk plaka aktarın. silika jel ile hava geçirmez bir kap içinde, 4 ° C'de, parafin blokları saklayın.

2. Kesit ve Hazırlama Slayt

  1. Bir mikrotom 25 10 mikron bölümleri kesin.
  2. şeritler incelemek ve medyan bölümleri seçin. Medyan bölümler yaprak primordia çevrili hücrelerin bir kubbe olarak görünür SAM dahil olanlardır.
  3. slaytlar Mount bölümleri.
    1. LM için uygun yer slaytlar (ya RNaz ücretsiz ya dapişmiş) 42 ° üzerinde sıcak slayt ve slayt kapsayacak şekilde% 50 etanol çözeltisi birkaç damla uygulamak C.
    2. bölümler genişlettik kadar etanol çözeltisi ile ilgili bölümleri yüzer.
      NOT: etanol çözeltisi yerine su bölümleri Yüzer RNA bozulmasını azaltan bir çöktürülmüş halde RNA tutar.
    3. slayt eğin ve tek kullanımlık transfer pipet yardımıyla aspirasyon ile aşırı etanol çözüm kaldırmak. herhangi bir ek etanol solüsyonu uzak fitil havsız mendil kullanın.
    4. 42 ° C'de kuru slaytlar birkaç saat veya bir gece. Mağaza silika jel ile hava geçirmez bir kap içinde, 4 ° C 'de kayar.
  4. Deparaffinize kullanım gününde kayar.
    1. içeren üç cam Coplin kavanoz hazırlayın; % 100 ksilenler (ksilenler I) 'in,% 100 ksilenler (ksilenler II) ve% 100 etanol (~ Her çözeltinin 50 mi).
    2. temiz forseps kullanarak 2 dakika ve 1 dakika süreyle% 100 etanol için, slaytlar aktarmak Ben 2 dakika süreyle ksilol slaytları batırmayın, ksilen II.
    3. Tahliye kaydırdıOda sıcaklığında havsız mendil ve kuru hava ile ilgili es.

Plastochron 7 Yaprak Primordia Blade, ligule ve Kılıf Örneklerinin 3. Mikrodisseksiyon

  1. LM mikroskop sahnede slaytlar sabitleyin. slayt başına beş bölümden kullanan her tekrar için beş ya da altı slaytlar kullanın.
    NOT: Tek deney için havuzu doku Şekil 5'de görüntülenmiştir.
  2. slaytlar incelemek ve merkezi referans noktası olarak SAM apeks kullanarak, her slaytta beş en medyan bölümleri belirlemek.
    Not: Bu, düşük büyütme yapılabilir genellikle 5X amacı yeterlidir.
  3. 10X veya 20X objektif kullanılarak, her bir bölümün plastochron 7 yaprak primordiumunun üzerinde ligule konumunu belirlemek. ligule yaprak primordiumunun adaxial yüzeyinden çıkıntı bir yumru olarak görünür olacaktır. LM yazılım çizim aracını kullanarak bu konumu işaretleyin; Kalem simgesini seçin, uygun positi imlecive üzerine tıklayın ve çizmek için fareyi sürükleyin.
    NOT: 10X veya 20X amacı, bu ve sonraki adımlar için uygun değildir. Yanal bölümleri kullanırken, her yaprak primordiumunun iki tarafın her bölüm (Şekil 2A) mevcut olacaktır.
  4. Cetvel aracı ve dikdörtgen çizim aracını kullanarak, 100 mikron her bölümün ligule merkezli yüksek dikdörtgenler (kırmızı dikdörtgenler, Şekil 2A, 2B) ölçün. Bu "ligule" örnek olacaktır.
    1. cetvel aracını kullanmak için; , Cetvel simgesini seçin ölçülecek nesnenin bir ucuna imleci, nesneyi ölçmek için tıklayın ve sürükleyin. Cetvelin uzunluğu ekranda gösterilir.
    2. Bir dikdörtgen çizmek için; , Dikdörtgen simgesini seçin, dikdörtgenin bir köşesi olacak tıklayın ve uygun büyüklükte bir dikdörtgen çizmek için sürükleyin bir noktaya imleci. Alternatif olarak, düz bir çizgi çizim aracını seçin ve dört düz çizgiler çizmek.
    3. tedbir 100 mikron dikdörtgenler 50 mikron "ligule" dikdörtgen üstünde ve altında konumlandırılmış.
      NOT: Bu "Blade" ve "Kılıf" örnekleri, sırasıyla (yeşil ve mavi dikdörtgenler, Şekil 2A, 2B) olacaktır. Bizim histolojik verilere dayanarak, 100 mikron dikdörtgen tüm ligule bölgesini kapsar. bıçak ve kılıfın eşdeğer porsiyon büyüklüğünde doku içindeki miktarları her biri için elde edilmiştir sağlamak için seçilmiştir. 50 um'lik Spacer'ler ligule bölgesi doku yanlışlıkla uç veya kılıf microdissections dahil olmasını sağlamak için kullanılmıştır.
  5. Ayrı tüplerde ligule, Blade ve Kılıf örneklerin toplanması 7, 8, 9, - Microdissect ölçülen dikdörtgenler (2F Şekil 2B). Seçilen etki anahat boyunca doku bölümünde kesmek için lazer kesim işlevini kullanın. Cata kullanınpult işlevi slayt kapalı ve tüp (- 2F Şekil 2B) kapağının içine doku dikdörtgen itmek için.

Plastochron 7 Yaprak Primordia Blade, ligule ve Kılıf adaxial Epidermal Örneklerinin 4. Mikrodisseksiyon

  1. bölümleri seçin ve bölüm 3 (yukarıda) de tarif edildiği gibi, plastochron 7 ligule merkezli 100 mikron yüksek kesimleri ölçmek için cetvel aracını kullanın.
    1. Çizim aracı ile özetleyen her 100 mikron yüksek "Blade" ve "Kılıf" segmenti (yeşil ve mavi seçimleri, Şekil 2C) sadece adaxial epidermal hücreleri seçin. Epidermis, dış hücre tabakasıdır; aks tarafı SAM yakın biridir.
    2. Bölüm 3.3 (kırmızı seçimi, Şekil 2C) de tarif edildiği gibi "ligule" örneği için, gelişmekte olan ligule yumru sadece hücreleri seçin.
  2. Bıçak, ligule ve Shea toplama Microdissect seçilen bölgeler,bölüm 3.5 anlatıldığı gibi inci, ayrı tüplerde örnekleri epidermis.

LG1-R ve vahşi tip kardeşlerinden Plastochron 6 Yaprak Primordia 5. mikrodiseksiyonu

  1. Mutant (LG1-R) ve vahşi tipli bitkiler ailelerini segregasyon büyütün.
  2. bölümlerde 1.2-1.4 açıklandığı gibi, LM için apices saptamak ve süreç ateş. Ayrı onları tutmak için vahşi tip ve ayrı şişelerde mutant ateş apices sabitleyin. Aynı dikim numuneler sabit ve in situ melezleme için işleme tabi tutulmalıdır.
  3. LG1 in situ hibridizasyon 6, 26, 27 LG1 gerçekleştirerek, vahşi tipli kardeşlerinden transkribe burada belirler. Birden çok numune (Şekil 1 E) yaprak primordiumunun tabanından LG1 transkript birikimi konumunu ölçün.
  4. Doğal olarak melezleşme verileri göre, yaprak primo kısmını tercihrdium bu LG1 transkribe bölgeyi kapsar. Bu durumda, plastochron 6 yaprak primordia (mor dikdörtgenler, Şekil 2A) tabanında 400-900 um.
  5. Bölüm 3.5 de tarif edildiği gibi, ayrı Microdissect tüplerde LG1-R ve vahşi tip numune toplama, yaprak primordia kısmı seçildi.

6. RNA Ekstraksiyon Buffer uygula

  1. microdissected dokuya 50 ul RNA ekstraksiyon tamponu uygulayın ve RNA ekstraksiyonu devam edin. Referans 6'da açıklandığı gibi RNA ekstraksiyonu, RNA amplifikasyonu, kütüphane oluşturma, sekanslama ve biyoinformatik analizi ile devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaklaşık 1,000,000-1,500,000 um 2 doku her biri için elde edilmiştir, Şekil 2'de belirtilen LM şeması kullanarak, tüm hücre tabakaları LM (Şekil 5) çoğaltmak ve 200,000 mikron 2 başına adaxial epidermisin LM çoğaltma. Her LG1-R ve vahşi tip yaprak primordia LM replike yaklaşık doku 2,500,000 mikron 2 toplanmıştır. Doğrusal, RNA amplifikasyonuna ait iki tur her tekrar için RNA, mikrogram düzeylerindeki miktarlarda...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deney tasarımı RNA DİZ deneylerinde önemli bir faktördür. Anahtar hususlar kesin etki (ler) ve gelişimsel aşaması (ler) analiz edilecek ve ne karşılaştırmalar yapılacaktır vardır. çıkış iki veya daha fazla durum arasında de genlerin bir liste genellikle, çünkü karşılaştırmalar açısından düşünmek için çok önemlidir. Tüm deneylerde olduğu gibi, aynı anda yalnızca tek bir değişken değiştirmek için önemlidir. Farklı yaprak etki karşılaştırırken Örneğin, aynı koşullar altında yetiştirilen aynı yaş ve gelişim aşaması, karşıla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar işbirliği, devam eden ve ligule gelişimi ile ilgili tartışmalar uyarıcı S. Hake teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB 1052051 ve IOS-1848478 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dietil pirokarbonatSigma-Aldrich159220Çözeltilerin RNaz tedavisi için kullanılır
Jiletli bıçaklar Elektron Mikroskobu Bilimleri72000
RNase ZapSigma-AldrichR2020-250MLRNase dekontaminasyon çözeltisi
Etanol mutlak 200 kanıtFisher ScientificBP28184
Asetik asit, buzulSigma-AldrichA6283
Cam şişeler - 22 mlVWR470206-384
Ksilenler, histolojik dereceSigma-Aldrich534056-4L
Paraplast plusSigma-AldrichP3683-1KG
Tek kullanımlık taban kalıpları, 15 mm x 15 mm x 5 mmVWR15154-072
Gömme halkalarıVWR15154-303
Silika jel paketleriElektron Mikroskobu Bilimleri71206-01Parafin bloklarının depolanması için kurutucu
FırınFisher Scientific15-103-0503Fırın 60 ° C'lik sıcaklığı korumalıdır; C
Parafin gömme istasyonuLeica EG1160
MikrotomLeica RM2235
Slayt ısıtıcı ElektronMikroskobu Bilimleri71317-10
Coplin kavanozlarıElektron Mikroskobu Bilimleri70316-02
Lazer mikrodissektörZeiss
KIMWIPES & trade; Hassas Görev SilecekleriKimberly-Clark Professional34120Mikroskop slaytlarındaki fazla solüsyonları emmek için tüy bırakmayan mendiller
Membran Slayt 1.0 PENZeiss415190-9041-000Lazer mikrodiseksiyon için slaytlar
Yapışkan Kapak 200 opakZeiss415190-9181-000Lazer mikrodiseksiyon için tüpler
PicoPure RNA İzolasyon KitiThermoFisher ScientificKIT0204

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
  2. Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
  3. Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
  4. Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
  5. Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
  6. Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  7. Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685(2012).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
  10. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
  11. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  12. Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476(2009).
  13. Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
  14. Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
  15. Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
  16. Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
  17. Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
  18. Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
  19. Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
  20. Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
  21. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  22. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  23. Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
  24. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  25. Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
  26. Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
  27. Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328(2011).
  28. Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028(2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA DizilemeDoku Kesit almaParafin G mmeMorfolojik Mark rlerLigula Tan mlamaRNA EkstraksiyonuDiferansiyel Ekspresyon AnaliziIn Situ Hibridizasyon

İlgili makaleler