Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

20.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55015

⸱

30 Aralık 2016

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir üretimi ve insan kaynaklı düzenleyici T hücrelerinin (iTregs) fenotipleme tarif eder. FoxP3 indüksiyonu için farklı protokoller ilgili protokolleri ile elde edilen spesifik iTreg fenotipleri çalışması için izin verir.

Özet

Düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) periferik toleransın ayrılmaz bir parçasıdır, öz yapılara karşı bağışıklık reaksiyonlarını baskılar ve böylece otoimmün hastalıkları önler. Treg'leri evlat edinerek transfer etmek veya kanserde Treg'leri tüketmek için klinik yaklaşımlar umut verici ilk sonuçlarla devam etmektedir.

Doğal olarak oluşan Treg'lerin (nTreg'ler) sayısı çok sınırlı olduğundan, in vitro indüklenmiş Treg'leri (iTreg'ler) kullanarak belirli Treg özelliklerini incelemek avantajlı olabilir. Bugüne kadar, Treg'leri tanımlamak için kesinlikle spesifik olmasa da en iyi protein belirteci, transkripsiyon faktörü FOXP3'tür. Periferik olarak indüklenen Treg'lerin yedekli olmayan rolleri de dahil olmak üzere Treg'lerin önemine rağmen, iTreg'leri üretme protokolleri, özellikle insan hücreleri için şu anda tartışmalıdır. Bu nedenle bu protokol, paralel olarak bir dizi Treg indükleyici faktör (TGF-β artı sadece IL-2 veya bunların retinoik asit, rapamisin veya bütirat ile kombinasyonları) kullanılarak insan CD4 + FOXP3 + iTreg'lerinin insan naif T hücrelerinden in vitro farklılaşmasını tanımlar. Ayrıca bu hücrelerin akış sitometrisi ve qRT-PCR ile fenotiplemesini de tanımlar.

Bu protokoller, FOXP3 ve diğer Treg imza genlerinin tekrarlanabilir ekspresyonu ile sonuçlanır ve genel FOXP3 düzenleyici mekanizmaların yanı sıra belirli faktörlerin etkisini tanımlamak için protokole özgü etkilerin incelenmesini sağlar. iTreg'ler, Treg indüksiyonunun moleküler mekanizmalarının yanı sıra çeşitli fenotipik yönleri incelemek için kullanılabilir. Ayrıntılı moleküler çalışmalar, elde edilebilecek nispeten büyük hücre sayıları ile kolaylaştırılmaktadır.

iTregs uygulaması için bir sınırlama, bu hücrelerde FOXP3 ekspresyonunun nTregs'e kıyasla göreceli kararsızlığıdır. Bu protokoller tarafından üretilen iTreg'ler, TGF-β artı retinoik asit ve rapamisin tarafından indüklenen iTreg'lerin üstün baskılayıcı aktivite gösterdiği baskılayıcı fonksiyonlarının incelenmesi gibi fonksiyonel testler için de kullanılabilir. Bununla birlikte, iTreg'lerin baskılayıcı kapasitesi nTreg'lerden farklı olabilir ve uygun kontrollerin kullanılması çok önemlidir.

Giriş

CD4 + CD25 + FoxP3 + düzenleyici T hücreleri (Tregs) diğer bağışıklık hücrelerini bastırmak ve periferik tolerans kritik arabulucular, önlenmesi otoimmünite ve aşırı enflamasyon 1 bulunmaktadır. Tregs önemi, ciddi sistemik otoimmün hastalık yol açar Tregs kaybı nedeniyle `master' Treg transkripsiyon faktör forkhead kutusu P3 mutasyonlar insan hastalık immunodysregulation poliendokrinopati enteropatisi X'e bağlı sendromu (IPEX), (FoxP3) tarafından örneklenmiştir erken yaşta ölümcül. Ancak, Treg'ler onlar da bazı ayarlarda 2 anti-tümör bağışıklığını engel gibi bağışıklık sisteminde bir iki ucu keskin kılıç olarak hareket ederler. Treg sayısı ve fonksiyonu Terapötik manipülasyon birçok klinik araştırmalarda bu nedenle tabidir. Kanserinde Tregs tükenmesi arzu edilebilir ve klinik yaklaşımlar bazı başarı daha fazla araştırma 3 teşvik eder. Pek çok dil içinde Tregs terapötik etkilerine ek olarak, otoimmün ve enflamatuar hastalıkların, bölgesindekiral fare hastalık modelleri, evlatlık Treg transferi son ilk-man denemeleri greftleme karşı -host hastalığı (GVHH) 4 önlemek için - 7 ve çok umut verici sonuçlar vermiştir tip 1 diyabet 8 tedavisinde güvenliğini değerlendirmek için.

11 - Doğal Tregs (nTregs üretme) SAĞLIK 9 korunmasında yedeksiz temel fonksiyonları ile timik türevli tTregs ve periferik kaynaklı pTregs içermektedir meydana. Bununla birlikte, nTreg numaraları naif T hücresi öncüleri 12 in vitro olarak uyarılması Tregs (iTregs) tamamlayıcı bir yaklaşım teşvik sınırlıdır. Bunun nedeni, muhtemelen FoxP3 gen lokusu 13 olarak adlandırılan regülatör özgü demetile bölge (TSDR) 'de demetilasyon eksikliği iTregs Hala stabilite, bir sorun olmaya devam etmektedir ve birçok çalışma, Tregs bağlı in vivo 14 daha kararlı olduğunu göstermektedir.

Bugüne kadar, FoxP3 en iyi protein m kalırinsan geleneksel CD4 + CD25 T hücreleri geçici aktivasyon 15,16 üzerine FOXP3 orta düzeyde ifade çünkü Tregs için arker ama kesinlikle özel değildir. önemli bir ilerleme FoxP3 ekspresyonunun düzenlenmesi açıklık yapılmış olmasına rağmen, daha özel olarak, insan hücrelerinde FOXP3 indüklenmesi, kararlılık ve işlevi ile ilgili tespit edilmesi gerekmektedir. NTregs için farklılıklara rağmen, in vitro FoxP3 neden + CD4 + T hücreleri FoxP3 indüksiyon moleküler mekanizmaları incelemek için bir model sistem olarak da kullanılabilir ve daha benzer iTregs üretilmesine izin gelecek protokolleri geliştirmek için bir başlangıç noktası olarak gelecekte adaptif transfer stratejileri için geçerli olabilir oluşturulan Tregs, vivo.

Orada insan iTregs ikna etmek için hiçbir `altın standard' protokolü ve mevcut protokoller in vivo regülatör uyaran koşulları taklit dayalı geliştirilen edilmiştir: 2 (IL-2, interlökin) Ve transforme edici büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal vivo 17 FoxP3 indüksiyonu için çok önemli olan, ve all-trans retinoik asit (ATRA) - bağırsak ile ilişkili dendritik hücreler tarafından in vivo üretilen - sıkça FoxP3 arttırılması için kullanılır 21 - 18, in vitro olarak. Bu bütirat 22 en son sıçangil regülatör indüksiyon 23,24 artırdığı gösterilmiştir bağırsak Mikrobiyota türetilen kısa zincirli yağ asit kullanılarak ek insan regülatör T indükleyici protokolleri geliştirmiştir. Ayrıca son zamanlarda bu teşvik ettiği bilinir önleyicisi ikinci rapamisin (mTOR) klinik olarak kabul memeli hedefi olarak, TGF-p, ATRA bir kombinasyonu kullanılarak ve 22 rapamisin ile, in vitro olarak, üstün bastırma fonksiyonu ile iTregs üretimi için yeni bir protokol kurulan insan Treg genişleme 25,26 sırasında FoxP3 bakım.

Bu yöntem tekrarlanabilir açıklarinsan CD4 + FoxP3 + farklı olan bir dizi şartı ile iTregs ve akış sitometrisi ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyon ile daha sonra fenotipleme nitro nesil (qRT-PCR) FOXP3 sentezlenmesi ve diğer regülatör imza molekülleri, protokole özel desenler ortaya çıkarmak için CD25, CTLA-4, EOS, hem de IFN-y ve SATB1 ifade 22 baskı olarak. oluşturulan hücre popülasyonları, genel FoxP3 düzenleyicileri ile ilgili ya da bu tür butirat veya rapamisin gibi bazı bileşiklerin özel etkilerini incelemek için, ya baskılayıcı aktivitesi ile ilgili olarak, işlevsel tayinler için veya moleküler çalışmalar için de kullanılabilir. Treg farklılaşma sürüş moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması, özellikle Treg nesil ve fonksiyonunda yer alan molekülleri hedef otoimmünite veya kanser gelecekteki terapötik yaklaşımlara için büyük önem taşımaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), taze Karolinska Üniversite Hastanesi, İsveç satın anonim sağlıklı donor buffy katlarından izole edilmiştir. deneyler için etik izin Stockholm Bölgesel Etik Değerlendirme Kurulu (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm) elde edilmiştir, İsveç (onay numarası: 2013 / 1458-1431 / 1).

Periferal kandan, 1'dir, T Hücre İzolasyonu

  1. PBMC İzolasyon
    1. 15 ml yoğunluğu santrifüj ortamı 50 ml tüpler (buffy coat başına 5 tüpler) (örneğin Ficoll gibi) çözümünü ön yatıyordu. Oda sıcaklığına Pre-sıcak.
    2. 180 ml fosfat tamponlu salin (PBS) (oda sıcaklığı) ile buffy coat doldurun. Taze kan kullanılırsa, PBS eşit hacimde kan seyreltin.
    3. yan ve yavaş yavaş bindirme yoğunluk santrifüj ortamı ~ tüp başına kan seyreltilmiş 35 ml Tilt tüp. med yoğunluk santrifüj herhangi bir karıştırma olmadan, çok dikkatli kan ekleyum faz ve kan tabakası.
    4. Frensiz oda sıcaklığında 1150 xg'de Santrifüj 20 dk. Frensiz santrifüj işletmek ve orta ivme düşük mümkünse tabakaların karışmasını önlemek için.
    5. yoğunluk santrifüj orta ve plazma fazı arasında PBMC'ler içeren beyaz halka çıkartın. (2 ml plastik Pasteur pipeti ile 1 kez 5 ml pipet ve 2 kez), yeni bir 50 ml tüp aktarın. Mümkün plazma ve yoğunluk santrifüj ortamı olduğunca az alın. Kırmızı eritrosit pelet dokunmayın.
    6. Yıkama PBMC'ler. 50 ml tüpler (buffy coat başına 4 tüp) içine PBMC bölün. PBS ile 50 ml her doldurun.
    7. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüj 450 x g.
    8. Çıkarın ve supernatant atmak 10 1 tüpüne ml RPMI /% 10 cenin dana serumu (FCS) orta hücreleri havuz ve de yeniden süspanse edin. hücre kümeleri 40 mikron hücre süzgecinden mevcut, gerilme hücreleri ise.
    9. reklam için T175 hücre kültürü şişesi hücreleri aktarınHerent hücreleri. (50 ml toplam) 40 ml ortam ile tüpler durulayın ve hücreler ile birleştirir. Gerekirse, (1.4 adım bakınız) akış sitometri analizi için bir numuneyi çıkarın. Genellikle, CD4 + T hücreleri lemfosit kapısı hücrelerin yaklaşık% 30-40 ihtiva eder ve naif T hücreleri donöre bağlı olarak, CD4 + T hücreleri, yaklaşık 30 ila 60% 'si arasında.
    10. 37 ° C /% 5 CO2 seviyesinde 45 ila 90 dakika için balon döşeme hücreleri inkübe edin. Bu adım plastik bağlılık ile monositler tüketmek olacaktır. Bu zorunlu değildir, fakat, aşağıdaki adımları PBMC'ler miktarı yüzde oranı, T hücre verimi artar.
    11. Süspanse hücreleri (50 ml ortam şişe içinde yer alan) ve de şişenin altındaki hücre tabakasını yıkayın. eşit iki adet 50 ml tüpler içine hücreleri dağıtmak (önceki tüpler aynı donörden yeniden kullanılabilir). 50 mi taze RPMI /% 10 FCS ortamı ile balon durulayın ve aynı 2 tüplere eşit aktarın.
      Not: PBMC borular döşeme 4 ° C'de gece boyunca saklanabilirYan ya da ideal olarak, doğrudan T hücresi izolasyonu için kullanılan.
  2. Manyetik aktive hücre sıralama tarafından nTreg İzolasyon
    1. yalıtım tamponu hazırlayın:% 0.5 (w / v) insan serumu albümini ile PBS içinde 2 mM EDTA. Her zaman 4 ° C'de tampon tutun. Alternatif insan albümine, sığır albümin kullanın.
    2. Süspanse ve tripan mavisi varlığında bir otomatik veya manuel hücre sayacı ile PBMC'ler saymak (küçük trombositler sayılmaz). hücre kümeleri gözlenmesi halinde, 40 mikron hücre süzgecinden gerilme hücreleri.
    3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüje PBMC.
    4. Hücreleri tekrar 10 7 PBMC başına 90 ul yalıtım tamponu (1 mi pipetiyle) tek bir hücre süspansiyonu elde edildi. Orijinal 50 ml tüpler (buffy coat başına 2 tüp) hücreleri tutun.
    5. 10 7 hücre başına 2 ul CD25 boncukları ekleme karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
    6. 30 ml PBS ile doldurun. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj6 ° C.
    7. 3 ml izolasyon tamponu ile dengelenmesi ve akmasına atmak: LS sütunları (buffy coat başına 2) hazırlayın. Tüpler daha sütunları durulama için yeniden kullanılabilir.
    8. tüp başına 3 ml izolasyon tamponunda yeniden süspanse hücreleri (1 ml pipet ile). Aktarım hücreleri sütunu LS ve taze 15 ml tüpler aracılığıyla akışını toplamak için.
    9. 2 ml İzolasyon ile 50 ml'lik tüpler her tampon durulayın. sütunlara tampon durulama transfer.
    10. 3 ml İzolasyon ile yıkayın kolon 2x her tampon. Sütun herhangi bir yeni sıvı eklemeden önce, damlama durdurulana kadar hep bekleyin. Mağaza sonraki adımlar 4 ° C'de akışı.
    11. mıknatıstan sütun çıkarın. 15 ml tüp içine kolon başına 3 mi yalıtım tamponu ile elüte 2x.
      Not: donör başına 2 sütun gelen elüat birleştirilebilir. sıvı içine sütun daldırma yok.
    12. Hazırlayın ve yeni LS sütun (buffy coat başına 1 sütun) dengelenmesi. sütun 1.2.11 gelen elüat aktarın. atılabilir akışı. Eluat passe sahip sonrasütun aracılığıyla d tüp durulayın ve 3 ml izolasyon tamponu ile kolon 3x yıkayın.
      Not: İkinci sütun önemlisi saflığını arttırmak için gereklidir.
    13. mıknatıstan sütun çıkarın. 3 mi İzolasyon tamponu ile elüte CD25 ++ "nTregs üretme" 2x.
    14. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüjleyin. tamamen süpernatantı.
    15. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de 15 mi T hücresi kültür ortamı, santrifüj ile hücreler yıkanır. tamamen süpernatantı.
    16. 100 lU / ml IL-2, her biri takviye 0.5 mi T hücre kültür ortamı içinde yeniden süspanse hücreleri. 24 plaka hücreleri aktarın. 0.5 ml ortam ile durulayın boru (+ 100 lU / ml IL-2) ve 24-iyi plaka içine birleştirir.
    17. (Adım 1.2.2 gibi) nTregs sayın. Verim genellikle buffy coat başına yaklaşık 1-4 x 10 6 Treg'ler olduğunu. T hücre kültürü ortamı + 100 lU / IL-2 mi 1-2 x 10 6 hücre / ml Tregs yoğunluğunu ayarlar.
    18. 37 ° C /% 5 CO 2 kullanılıncaya kadar az Tregs inkübe edin.
  3. Manyetik aktive edilen hücre sınıflandırma ile naif CD4 + T hücre Isolation
    NOT: hücre izolasyonu ile devam etmek adım 1.2.8-1.2.10 den akmasına atın. Hiçbir nTregs üretme izole edilmiştir Alternatif olarak, eğer PBMC'ler doğrudan devam edin.
    1. 50 ml tüp regülatör-tükenmiş PBMC'lerin donör başına 2 tüpleri birleştirin. Oda sıcaklığında, 50 ml PBS ile doldurun.
    2. Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca 200 xg'de Santrifüj PBMC'ler. Süpernatantı çıkarın ve atın. 50 ml PBS içinde süspanse edin hücreleri.
    3. Adımı yineleyin 1.3.2 kez.
      NOT: PBS yıkar aşağıdaki negatif izolasyon kiti ile kaldırılır olmayacak trombositlerin, çıkarılması için çok önemlidir. Trombositler, bu düşük hızda santrifüjleme de yüzer kalır. Trombosit tükenmesi mikroskobik slayt adım adım izlenebilir. aşamalar oda sıcaklığında PBS ve santrifüj ile yapılması gerekir.
    4. 50 ml PBS içinde süspanse PBMC'ler. Adım 1.2.2 olarak hücreleri saymak.
    5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüje PBMC. 10 7 hücre başına 40 ul İzolasyon tamponu (4 ° C) yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri atın.
    6. 10 7 hücre başına Naif CD4 + T hücresi Biotin-antikor kokteylinin II 10 ul ekle.
    7. Karıştır ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
    8. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'de 40 ml PBS (4 ° C) eklenmesi ve santrifüj ile hücreler yıkanır. 10 7 hücre başına 80 ul izolasyon tampon supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak.
    9. 10 7 hücre başına anti-biyotin mikro-20 ul ekle. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
    10. soğuk PBS ile 50 ml'ye doldurun ve santrifüj 450 xg, 4 ° C'de 10 dakika karıştırıldı.
    11. LS sütunları (3 ml izolasyon tamponu ile dengelenmeye) hazırlayın. Sütun aşırı yüklenmeyi önlemek PBMC'ler çok sayıda kırmızı kan hücreleri içeriyorsa maksimum 250 x 10 6 PBMC'ler, veya daha az bir sütun kullanın.
    12. supernatant ve tekrar süspansiyon c kaldır3 mi yalıtım tamponu arşın. LS sütun hücreleri aktarın. 15 ml tüpler naif CD4 + T hücreleri içeren akışı, toplayın.
    13. 2 mi yalıtım tamponu ile tüp durulayın. sütun aktarın.
    14. 3 mi yalıtım tamponu ile yıkayın kolon 3x. Sütun herhangi bir yeni sıvı eklemeden önce, damlama durana kadar hep bekleyin.
    15. 4 ° C'de (naif CD4 + T hücreleri) akışı ve santrifüj 450 xg 10 dakika sürer. Sütunlar iptal edilebilir.
    16. tamamen süpernatantı. Oda sıcaklığında 15 ml ortam santrifüj 450 xg, 10 dakika hücreleri yıkayın tamamen supernatant çıkarın.
      NOT: İzolasyon tampon kalsiyum iyonlarını şelatlayarak EDTA içerir ve bu nedenle T hücresi aktivasyonunu bozar. Herhangi bir stimülasyon deneylerinden önce tamamen yalıtım tamponunu çıkarın ve 15 ml ortam ile iki kere yıkama hücreleri.
    17. Ml başına 2-3 x 10 6 hücre T hücre kültür ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Uygun bir şişeye o Rest in hücrelerr de inkübatör gece boyunca. Hücreler Simülasyon deneyleri için doğrudan kullanılan, bunları ortam ile bir kez daha yıkanır.
  4. Saflığı Kontrolü Boyama
    1. 20 ul, her bir yaklaşık 50,000 hücre (PBMC,; nTreg Tnaïve) atın.
      NOT: Tnaïve ve nTreg paneli hem lekeli isteniyorsa, 2 numune her alacak.
    2. örneğin, cihaz için uygun olarak 2 kere konsantre antikor ön-karışımı (PBS içinde) hazırlayın: Tnaïve paneli: CD4-PerCP 1: 5'tir; CD45RA-FITC ile 1:10 CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8 arasındadır. Treg paneli için, CD25-PE, 1:10 ile CD45RO-PE değiştirin.
      Not: CD25-mikro farklı epitopları tanıyan Yalnızca belirli CD25 antikorları, CD25 mikro boncuklar izole nTregs leke kullanılabilir.
    3. 20 ul hücre 20 ul antikor ön karışımı ekleyin. Ayrıca Batan akış sitometrisi için, her bir florokrom (örneğin, pozitif hücreler içeren PBMC'ler bir örnek kullanarak) ve boyanmamış örnek için, tek lekelenmelerinin hazırlanmasıgs ve tazminat.
    4. karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
    5. 200 ul PBS ile her bir örnek doldurun ve 5-10 dakika santrifüj 450 xg.
    6. flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması (FACS) tamponu (= yalıtım tamponu EDTA olmadan) hücreleri alın ve akış sitometrisi ile analiz edin. Naif CD4 + T hücrelerinin saflığı genellikle>% 95 (bakınız Şekil 2).

2. Treg İndüksiyon Kültür

  1. Uyarım Medya ve Plates hazırlanması
    1. Hazırlanması ve ön-sıcak T hücre kültürü ortamı: serumsuz hematopoietik ortamı, 2 mM L-alanil-L-glutamin ile takviye edilmiştir.
    2. sitokin, stimülasyon antikor ve bileşik stok konsantrasyonları hazırlayın.
      1. IL-2, bir stok çözelti hazırlayın: 400.000 lU / ml steril süzme gerçekleştirilmiştir (aside dayanıklı filtre ile), 100 mM asetik asit (167 ug / ml kullanılan çok aktivitesi 1 ug 2,400 IU ise, sağlayıcı ile teyit). 0.5 ml tüpler bağlayıcı sterilize düşük protein Kısım, Parafilm ile mühür uzun süreli depolama için -80 ° C'de kuru buz ve mağaza dondurmak veya -20 kadar 3 ay süreyle ° C.
      2. (10 ug şişeye, taşıyıcı serbest), TGF-β1 stok çözelti hazırlayın: Santrifüj TGF-β1 tozu (1000 xg'de 3 dakika), 4 mM HCl'nin 100 ul stok solüsyonu hazırlamak için (ve aside dayanıklı filtre ile steril filtre edildi) 100 ug / ml, tamamen çözünmesine izin verirler; girdap. 0.5 ml tüpler bağlayıcı sterilize düşük protein her Kısım 5 ul, Parafilm ile mühür 6 aya kadar -80 ° C'de kuru buz ve mağaza dondurmak.
      3. ATRA stok çözelti hazırlayın: DMSO içinde 20 mg / ml (66.6 mM) bir toz içinde çözülür. 1 yıla kadar -80 ° C 'de, ışıktan koruyarak DMSO ve mağaza alikotları dilüsyondan, 10 mM'lik stok çözelti hazırlayın. ATRA ışık, ısı ve havaya duyarlıdır.
      4. rapamisin stok çözelti hazırlayın: alikotları 1 mg / ml (1.11 mM), DMSO, deposu için -80 ° C1 yıla kadar.
      5. Sodyum butirat stok çözelti hazırlayın: 0.908 M (0.1 mg / ml) stok, steril ultra saf H2O ve steril filtre. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
    3. Tablo 1 'de T hücre kültür ortamı içinde 4x konsantre ön-kanşımlar (oyuk başına 50 ul) hazırlayın.
    4. önceki gün, anti-CD3 antikoru ile kaplayın plakalar. Film arzu PBS / ml anti-CD3 antikoru 5 ug, 65 ul 96 U-bölmeli plaka kuyu sayısı / oyuk. folyo ile plaka sarın ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe.
      NOT: 96 kuyu plakaların kenar kuyuları kullanmayın. Daha büyük kuyu kullanılabilir, ancak U şeklinde kuyuları deneyde alan başına, aynı hücre sayıları kullanımını kolaylaştırır. daha fazla hücre gerekirse, kültürden sonra kuyuların gerekli miktarda havuz. Genellikle, genişleme 4-6 gün sonra, 2 havuzların her örnek bir akış sitometri analizi ve RNA analizi için yeterlidir.
      1. kaplama gününde, kısa bir süre kaplama önce, anti-kaldırmakkuyu -CD3 çözeltisi. , 200 ul / PBS ile doldurun. PBS çıkarın. 200 ul / göz PBS ile yıkama tekrarlayın. tamamen PBS kaldırmak ve hemen tabak kullanın.
    5. plakaları (marj kuyuları kullanmayın) hazırlayın:
      1. Her iyi 4x anti-CD28 / IL-2 ön karışım 50 ul ekleyin (tüm iTregs için), 50 ul 4x TGF-β1 premix veya 50 ul T hücre kültürü ( "uyarılmamış" hücreleri hariç, T hücre kültür ortamı ekleyin) "stimülasyon sadece" yalancı kontrol için orta, 50 ul ATRA, ATRA / rapamisin veya bütirat premix (varsa) veya orta 4x
      2. 200 ul PBS ile, marj kuyular da dahil olmak üzere, tüm boş kuyu doldurun. 37 ° C /% 5 CO 2 öncesi sıcak plakaları.
  2. Kaplama için naif T Hücreleri hazırlayın
    1. Hücreleri dinlendikten sonra, 15 ml tüp transfer tüp önceden ısıtılmış T hücre kültür ortamı ve havuzlu şişesi / kuyu durulayın. T hücre kültür ortamı ile, 15 ml tüp doldurun.
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüje hücreleri.
    3. Ortamı çıkarın ve 2.2-2.6 x 10 6 / ml'lik bir yoğunluğa, taze, önceden ısıtılmış T hücre kültür ortamı içinde hücrelerini alır. Adım 1.2.2 olarak hücre sayımı ve gerekirse yoğunluğunu ayarlayın.
    4. (2.1), 50 ul hücre / oyuk (110,000-130,000 hücre / çukur) hazırlanmış stimülasyon plakaları hücreleri ekleyin. Her iyi hemen 200 ul toplam hacim içermelidir.
    5. ışıktan ATRA korumak için alüminyum folyo ile plakalar paketleme; istenen zaman dönemleri için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edilir.
  3. Treg İndüksiyon Kültür Monitör
    1. ışık mikroskobu (40X büyütme) tarafından Treg kültürleri izleyin. günde 2 ila yaklaşık 3'e kadar, çoğalan hücrelerin küçük kümeler daha sonraki zaman noktalarında daha büyük kümeler halinde birleştirmek olan görülebilir olacaktır. rapamisin ile üreyen kültürler, genellikle daha az büyür. Ayrıca bakınız Şekil 3.
    2. İstenilen zaman noktalarında, RNA e numune almakxtraction ya fenotipleme akış sitometrisi (aşağıya bakınız). Iyi hücre proliferasyonu, 1 sonraki zaman noktalarında için, her yeterlidir, başka şekilde akış sitometrisi için 1 x 10 5 -1 x 10 6 RNA hücreler her 3 x 10 5 -1 x 10 6 hücre sunar.
  4. FoxP3 İstikrarı Değerlendirilmesi
    1. Daha önce tarif edildiği gibi 22,27 iTreg fenotipinin stabilitesini değerlendirmek için, T hücre kültür ortamı ile iki kez iTregs yıkayın ve T hücre kültür ortamında kültive iTregs ya olmayan veya 2.1 ve 2.2 de tarif edildiği gibi, anti-CD3 ve anti-CD28 yeniden güdüleme ile . sitokinler ekle gibi 50 IU / ml IL-2, FoxP3 istikrar üzerindeki etkilerini incelemek için.
    2. İstenen zaman noktalarında, 22,28 tarif edildiği gibi (aşağıya bakınız) feno akış sitometrisi ve TSDR metilasyon analizi, RNA ekstraksiyonu için örnek alabilir.

Mah-PCR ile iTregs 3. Fenotipik Analizi

  1. HazırlanmasıÖrnekler
    1. İstenen zaman noktalarında, RNA ekstraksiyonu için örnek başına 1 x 10 5 6 10 x 1 hücreleri alır. 5 dakika boyunca 500 xg'de bir RNaz içermeyen 1.5 ml tüp, ve santrifüj hücreleri aktarın.
    2. Gerekirse, yüzer bir kısmını çıkarmak ve enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ya da benzer bir analiz için dondurma. hücrelerin tamamen süpernatant geri kalan çıkarın. RNA ekstraksiyon doğrudan devam veya en fazla 2 hafta boyunca -80 ° -20 ° C'de kuru buz ve mağaza hücre pelet dondurmak.
    3. Standart protokollere göre RNA ekstrakte edin ve FOXP3 (örneğin, RPL13A gibi) bir ev bakıcısı geni QRT-PCR işlemi gerçekleştirmek. Buna ek olarak, diğer regülatör imza genlerin ekspresyonunu ölçer (örneğin 'regülatör up' genler IL2RA CTLA4, IKZF4 ve' regülatör down' genler IFNg, SATB1).

Akış Sitometrisi ile 4. Fenotipik Analizi

NOT: Bu protokol leke için optimize edilmiştir3 x 10 5 -1 x 10 6 hücre ile 96U kuyucuklu bir plaka biçiminde ing. oyuk başına daha az hücre varsa, aşağıda tarif edildiği gibi, çok sayıda kuyu ve havuz ile başlar.

  1. Hücre yeniden güdüleme (İsteğe bağlı)
    1. Hücre içi sitokin boyaması için isteniyorsa, Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ile darbe hücre / protein taşınma inhibitörünün mevcudiyetinde İyonomisin.
      NOT: Bu prosedür yukarıda tarif iTreg kültürlerinde FoxP3 ekspresyonunu etkilememektedir, ancak diğer belirteçler değişebilir - örneğin, CD4 aşağı regüle edilir.
    2. Bir stok çözeltisi Brefeldin 1: T hücre kültür ortamı içinde 10 x Brefeldin A / PMA / İyonomisin ön-karışımı (oyuk başına 20 ul) hazırlayın 100, İyonomisin (stok 5 mg / ml) 1: 1300, PMA (stok 12.35 mg / ml, önceden -dilute 1: 1235) 1: önceden seyreltilmiş hisse 100.
    3. 1.000 Brefeldin A, 0.5 μ: 4 saat boyamadan önce, 1 uç konsantrasyonlarını elde etmek için kuyu başına 20 ul Brefeldin A / PMA / Genişleme 10x karışımı ekleyinM (375 ng / ml) İyonomisin, 10 ng / ml PMA.
    4. 37 ° C /% 5 CO2 de 4 saat inkübe
  2. yüzey Boyama
    NOT: Burada önerilen panel öneri; diğer paneller ilgi ve enstrüman kurulum antijenler bağlı kullanılabilir.
    1. Buz üzerinde PBS soğutun. ve buz üzerinde soğuk (% 0.5 insan serum albümini, HSA ile PBS) FACS tamponu hazırlayın. BSA veya HSA FBS alternatif olarak kullanılabilir.
    2. boyama plaka Re-plaka hücreleri: süspanse bir pipet ile hücreleri ve iyi (daha sonra boyama işlemi taşkınlığın önlemek için) her biri yaklaşık iyi bir özgür bırakarak, yeni bir 96U plaka içine hücreleri aktarın. İstenilen hücre sayıları daha az orijinal kuyuda varsa, iyi bir boyanma içine birkaç kuyu tabanda önce süpernatant kısmını çıkarın ve havuz.
    3. Santrifüj plaka, oda sıcaklığında, 10 dakika boyunca 400 x g.
    4. süpernatantı. Atık kutusu içine süpernatant dökmek baş plaka bırakınaşağı ve hemen (plaka geri dönüş olmadan) emici kağıt üzerinde bir kez plaka dokunun. Sonra hemen plaka geri çevirmek. Vortex plaka Kalan sıvıyı hücreleri tekrar süspansiyon.
    5. ve tekrar süspansiyon: 25 ul yüzey boyama premix (FACS tampon 5 CD25-PE 01:20, CD4-PerCP 1) ekleyin.
      Not: Ayrıca, ilgili antijen pozitif hücreler içeren örnekleri ile kullanılan fluorochromes her biri için tek lekelenmelerinin şunlardır; ve lekesiz bir örnek bulunur. Bu cihaz tazminat kurulum için gerekli olacaktır. Alternatif olarak, tazminat boncuk kullanmayın.
    6. Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika kuluçkalayın.
    7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 ul PBS, santrifüj plakası 400 xg ekleyin ve adım 4.2.4 tarif edildiği gibi supernatant çıkarın. Girdap plakası.
    8. Adımı yineleyin 4.2.7 kez.
  3. geçerlilik boyaması
    NOT: sabitleme / permeabilization sonra ölü hücreler yeterince tarafından göz ardı edilemez çünkü Canlılık boyama, vazgeçilmezdirfsc / ssc ve belirsiz sinyallere yol açabilir. Bir tamir edilebilir canlılığı boya kullanılması gerekir.
    1. Süspanse 130 ul canlılığı leke ön karışım hücreler (sabitlenebilir canlılık boya eFlour780 PBS içerisinde 1: 1400) ve çok kanallı pipet ile hemen tekrar süspansiyon hücreleri.
      Not: Ayrıca birkaç gün süre ile kültüre örneğin ölü hücreleri, stimüle edilmemiş T hücreleri ihtiva eden ve üreticinin talimatlarına ile olduğu gibi ısı uygulanarak hücrelerini öldürmek canlılık boya için tek bir boyama bulunmaktadır. Bu dengelemesi için gerekli olan olacaktır.
    2. Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika kuluçkalayın.
    3. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje plaka. Adım 4.2.4 olarak süpernatantı. Girdap plakası.
    4. 200 ul FACS tamponu ile doldurun. Adımı tekrarlayın 4.3.3.
    5. 200 ul PBS ile doldurun. Adımı tekrarlayın 4.3.3.
  4. FoxP3 Boyama Tampon Seti ile Hücre içi boyama
    1. Her bir kuyu için hazırlamak: 150 ul Fix / Perm tampon (sulandırmak Fix / Perm konsentrate 1: seyreltici ile 4); 850 ul 1x permeabilizasyon tamponu (ultra saf H2O ile 10x permeabilizasyon tamponu 1:10 seyreltilir).
    2. vorteks sonra tekrar süspansiyon hücreleri 150 ul Fix / Perm tamponunda ve hemen pipet ile tekrar süspansiyon. Hemen hücre topaklarının tespit önlemek için tekrar süspansiyon önemlidir.
      Dikkat: Sabitleme tamponu paraformaldehid içerir ve ele ve uygun atılmalıdır.
    3. Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika kuluçkalayın.
    4. 100 ul soğuk PBS ilave edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 850 x g'de santrifüjleyin.
      NOT: Bu adımda itibaren santrifüj hızı hücrelerinin kaybını önlemek için artar. Tespit edildikten sonra, hücreler görünmez hale gelir ve adım 4.2.4 de açıklandığı gibi ve santrifüj hücre kaybını en aza indirmek için bittikten hemen sonra bakım süpernatantlar kaldırmak için önlemler alınmalıdır.
    5. Adım 4.2.4 de açıklandığı gibi süpernatantı. Girdap plakası.
      NOT: boyama bu aşamada durdurulmuş olabilir; içindeBu durumda, 200 ul PBS ile iki kez hücreleri yıkayın; Daha sonra, 250 ul PBS içinde yukarı ve ışıktan korunan, 4 ° C'de depolayın. Hücreler birkaç gün saklanabilir, ardından permeabilization devam edin. doğrudan Permeabilization devam Ancak, en iyi sonuçlar elde edilir.
    6. Vortekslemeden sonra, 200 ul permeabilizasyon tamponu ilave edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 850 x g'de santrifüjleyin. Adım 4.2.4 de açıklandığı gibi süpernatantı. Girdap plakası.
    7. tekrar süspansiyon 200 ul permeabilizasyon tamponu ekleyin.
      NOT: Burada, numuneler hücre içi boyama ve izotip kontrol numunesi bölünebilir (her numunenin uzakta yarısını almak). hücre sayıları sınırlayıcı ise, bir havuza izotip örneği (uzak her bir örnek ve havuz 10-20 ul almak) hazırlanabilir. Ayrıca, numuneler Floresan-Eksi-Bir (FMO) kontrolleri için alınabilir.
    8. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 850 x g'de santrifüjleyin. Adım 4.2.4 de açıklandığı gibi süpernatantı. Girdap plakası.
    9. içinde süspanse pelet(Önceden karıştırılmış) 44 ul permeabilizasyon tamponu artı 1 ul normal fare serumu Spesifik olmayan bağlanma bloke etme.
      Not: Bir sonraki adımda kullanılan antikorlar murin izotipi vardır, bu geçerlidir. Bu, sıçandan türetilmiş diğer antikorlar, kullanıldığı takdirde, (örneğin, sıçan serumu) bloke edilmesi için uygun bir serum içerir.
    10. Karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    11. antikorlar ekleyin:
      NOT: Belirli Lotların antikor konsantrasyonları bilgi. İlgili fluorochromes yüzey antijenlerine karşı antikorlar (örneğin, CD4) ile adım 4.2 yapılan değilse, ayrıca tazminat pozitif hücreler içeren örnekleri ile kullanılan fluorochromes her biri için tek lekelenmelerinin içerir.
      1. (Tek boyamalar, boyanmamış numunelerin, izotip kontrol örnekleri ve FMO kontroller hariç) örnekleri 15 ul antikor premix ekleyin: numune başına karışımlar: 0.7 ul (0.35 ug), anti-interferon gamma (IFN-γ) -FITC (yeniden uyarıldıktan sonra eğer uygulanabilir )2.3 ul (0.115 ug) CTLA-4 Mor 421, 2 ul (0.05 ug) Anti FoxP3-APC, 10 ul PBS Parlak.
      2. 4.4.11.1 kullanılan antikorlar gibi antikorun, aynı miktarları kullanılarak, kontrol numuneleri izotip 15 ul izotip antikor ön-karışımı ekleyin: numune başına karışımlar: 0.7 ul (0.35 ug) fare IgG1 K izotip kontrol FITC (eğer varsa), 0.58 ul (0.115 ug) fare IgG2a-BV421 izotipi, 0.5 ul (0.05 ug) fare IgG1 K izotip kontrol APC, 13.2 ul PBS ile yıkandı.
      3. FMO kontroller için, PBS ile bir antikor, her yerine 4.4.11.1 gibi antikor ekleyin.
    12. Karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    13. 200 ul permeabilizasyon tamponu ekleyin. Santrifüj, adım 4.4.8 deki gibi süpernatant ve vorteks çıkarın. kez tekrarlayın.
    14. (Hacim kullanılan enstrümana göre) ve akış sitometresinde, ideal olarak hemen elde soğuk FACS tamponu yeniden süspanse hücreleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 deney düzeneği bir şemasını göstermektedir. Şekil 2, manyetik izole saf CD4 + T hücreleri ve nTregs için temsili bir saflıkta kontrol boyamasını göstermektedir.

F ŞEKIL 3A yolluk stratejisi sitometri akışını gösterir ve Şekil 3B temsilcisi FoxP3 ve CD25 belirtilen iTreg veya kontrol koşulları altında kültür 6. günde boyamalar flow sitometri ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Açıklanan protokol, insan CD4 + FoxP3 + insan naif CD4 + T hücrelerinden iTregs sağlam indüksiyon sağlar. Biz üstün in vitro baskılayıcı fonksiyonu 22 iTregs uyarılması için, TGF-p, ATRA ve rapamisin bir arada kullanarak, son zamanlarda açıklanan yeni bir protokol içerir. Diğer yayınlanmış protokollere göre, bir başka avantajı, tek başına IL-2 varlığında, aktive edilmiş olan kontrol hücreleri ile birlikte, belirli bir iTreg uyaran faktörlerin etkileri doğrudan karşılaştırma sağlar farklı p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Nina Nagel, video çekimi ve deney hazırlığı sırasındaki teknik yardımı için minnetle teşekkür eder. Hücre içi FOXP3 boyama protokolüne yardımcı oldukları için Eva-Maria Weiss'e ve nTreg izolasyon protokolünü oluşturdukları için Elisabeth Suri-Payer ve Nina Oberle'ye teşekkür ederiz. Matilda Eriksson ve Peri Noori laboratuvar yönetimi için kabul edilmektedir.

Finansman: A.S., 7. Avrupa Topluluğu Çerçeve Programı, Dr. Åke Olsson Vakfı ve KI araştırma vakıfları kapsamında Marie Curie Intra European Bursu tarafından desteklenmiştir; A.S. ve J.T., CERIC (Enflamasyon ve Kardiyovasküler Hastalık Araştırmaları Mükemmeliyet Merkezi) hibesi ile desteklenmiştir, JT, Vetenskapsrådet Tıp ve Sağlık (Dnr 2011-3264) tarafından desteklenmiştir, Torsten Söderberg Vakfı, FP7 STATegra, AFA Sigorta ve Stockholm İl Meclisi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
All-trans retinoik asitSigma AldrichR2625-50MG & nbsp;  
anit-insan Foxp3-APC klonu 236A/E7eBioscience17-4777-42
anti-insan CD25 mikro boncuklarMiltenyi Biotec130-092-983
anti-insan CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
anti-insan CD28 antikoru, LEAF Saflaştırılmış Biolegend302914
anti-insan CD3 Antikoru, LEAF Saflaştırılmış Biolegend317315
anti-insan CD45RA, FITCMiltenyi Biotec130-092-247
anti-insan CD45RO PE klonu UCHL1BD Biosciences555493
anti-insan CD4-PerCP klonu SK3; mIgG1BD Biosciences345770
anti-insan CD8-eFluor 450 (klon OKT8), mIgG2aeBioscience48-0086-42 
anti-insan CTLA-4 (CD152), klon BNI3, mIgG2ak, Parlak menekşe 421BD Biosciences562743
anti-insan IFN-g FITC klonu 4S. B3; mIgG1k eBioscience11-7319-81 
Brefeldin A içeren çözelti: GolgiPlugBD Biosciences555029
cDNA sentez kiti: SuperScript VILO(Ters transkriptaz) cDNA Sentez KitiInvitrogen11754-250
Yoğunluk santrifüj ortamı: Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO %99,7Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS, ısıyla etkisiz hale getirilmişInvitrogen10082-147
Sabitlenebilir Canlılık Boyası, eFluor 780   eBioscience65-0865-14 veya 65-0865-18 
Foxp3 Boyama Tampon SetieBioscience00-5523-00Dikkat: paraformaldehit içerir. Antikor ile kombine kit halinde de satın alınabilir; 77-5774-40 İnsan Karşıtı Foxp3 Boyama Seti APC Klonu: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamin)Invitrogen35050-061
insan saf CD4 T hücre izolasyon kiti IIMiltenyi Biotec130-094-131
İnsan serum albümini 50 g / LBaxter1501057
Streptomyces conglobatus'tan İyonomisin >98%Sigma AldrichI9657-1MG
MACS LS-sütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401
fare IgG1 K İzotip Kontrolü APC Klonu: P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
fare IgG1 K İzotip Kontrolü FITC 50 &# 956; geBioscience11-4714-81 
fare IgG2a izotip kontrolü, Parlak menekşe 421, klon MOPC-173BD Biosciences563464
Pasteur pipet plastik, ayrı ayrı paketlenmişSarstedt86.1172.001   
PMA Phorbol 12-miristat 13-asetatSigma AldrichP1585-1MG & nbsp;
RapamisinEMD (Merck)553210-100UG
Rekombinant İnsan IL-2, CFR & D202-IL-050 / CF
Rekombinant İnsan TGF-beta 1, CFRnD240-B-010 / CF
RNA izolasyon kiti: RNAqueous-Micro KitAmbionAM1931 ve nbsp;  
RPMI 1640 Orta Canlandırıcı72400-054 & nbsp;
Sodyum bütiratSigma AldrichB5887-250MG  
T hücre kültürü ortamı: X-Vivo 15 ortamı, gentamisin + fenolredLonza04-418Q
TaqMan Gen Ekspresyon Testi, FOXP3 (En İyi Kapsama)  Uygulamalı Biyosistemler4331182 tahlil kimliği: Hs01085834_m1Dikkat: paraformaldehit
içerir TaqMan Gen Ekspresyon Testi, RPL13A (En İyi Kapsam)Uygulamalı Biyosistemler4351370; tahlil kimliği: Hs04194366_g1   Dikkat: paraformaldehit içerir
TaqMan Gen Ekspresyonu Master karışımıUygulamalı Biyosistemler4369514

Kaynaklar

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189(2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152(2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474(2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41(2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90(2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Naif CD4 T H creleriTGF beta ProtokolAk Sitometrisi AnaliziqRT PCR AnaliziPeriferik Kan Monon kleer H creleriManyetik Boncuk zolasyonuFOXP3 EkspresyonuTreg DiferansiyasyonuH cre K lt r nk basyonu
Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.