Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Transforme İnsan Fibroblastlar gelen Proliferatif Tetraploid Hücreleri kurulması

6.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55028

⸱

8 Ocak 2017

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

Bu makalede

Özet

Poliploid hücrelerin kromozomal kararsızlığını analiz etmek için proliferatif poliploid hücreler gerekli olsa da, transforme olmamış insan hücrelerinden bu tür hücreler oluşturmak kolay değildir. Bu rapor, normal insan fibroblastlarından diploid popülasyondan arınmış proliferatif tetraploid hücreler oluşturmak için nispeten basit prosedürleri tanımlamaktadır.

Özet

Poliploid (çoğunlukla tetraploid) hücreler sıklıkla insan dokularının preneoplastik lezyonlarında görülür ve kromozomal instabilitelerinin bu tür dokularda karsinogenezden sorumlu olduğu düşünülmektedir. Proliferatif poliploid hücreler, poliploid hücrelerin kromozomal instabilitesini analiz etmek için gerekli olsa da, transforme olmamış insan hücrelerinden bu tür hücreler oluşturmak oldukça zordur. Tetraploidinin kimyasal ajanlar tarafından indüklenmesi genellikle diploid ve tetraploid popülasyonlarının bir karışımı ile sonuçlanır ve çoğu çalışma, tetraploidi diploid hücrelerden ayırmak için seyreltmeyi sınırlayarak floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya klonlaması kullanmıştır. Ancak bu işlemler zaman alıcı ve zahmetlidir. Bu rapor, diploid hücreler tarafından minimum kontaminasyon ile normal insan fibroblastlarından proliferatif tetraploid hücreleri indüklemek için nispeten basit bir protokolü açıklamaktadır. Kısaca protokol şu adımlardan oluşur: mitozda hücrelerin demecolcine (DC) ile durdurulması, mitotik hücrelerin silkelendikten sonra toplanması, toplanan hücrelerin DC ile 3 gün daha inkübe edilmesi ve hücrelerin ilaçsız ortamda inkübe edilmesi (Birkaç gün içinde tetraploid hücreler olarak çoğalmaya devam ederler). Hücre tipine bağlı olarak, mitotik hücrelerin çalkalanarak toplanması ihmal edilebilir. Bu protokol, normal insan fibroblastlarından proliferatif tetraploid hücreler oluşturmak için basit ve uygulanabilir bir yöntem sağlar. Bu yöntemle kurulan tetraploid hücreler, kromozom kararsızlığını ve poliploid insan hücrelerinin onkojenik potansiyelini incelemek için yararlı bir model olabilir.

Giriş

Poliploid memeli türlerinin özel dokularda değil, aynı zamanda kanser ve dejeneratif hastalıklar gibi patolojik durumlar, çeşitli sadece gözlenmiştir. Polyploid (çoğunlukla tetraploid) hücreleri genellikle serviks 3,4 Barrett özofagus 1,2 veya skuamöz intraepitelyal lezyonlar gibi insan dokularının preneoplastik lezyonlar gözlenir ve bu dokularda 5 malign anöploidi hücrelerin kaynağı olarak kabul edilmiştir 6. o Anöploid hücrelere tetraploid dönüşüm tümörigenezinin erken evrelerinde çok önemli bir olay olabileceğini öne olmasına rağmen, bu süreçte yer alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu dönüştürülmemiş polyploid insan hücreleri yaymak nerede hiçbir in vitro model mevcut olmuştur kısmen çünkü.

Bazı araştırmacılar inh ile binükleer hücrelerin üretilmesi dönüştürülmemiş insan epitel hücrelerinde tetraploidi indüklenensitokinezi 7-9 ibiting. Bu yöntemde, bununla birlikte gereksiz diploit hücreleri 7,8 floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) ile elimine edilmelidir veya seyreltme 9 sınırlandırılmasıyla klonlama. Bu işlemler gerçekleştirmek için kolay zahmetli ve olmadığından, basit yöntemler dönüştürülmemiş tetraploid hücreler bu alanda araştırma için istenen kurmak.

Bu raporda, biz nispeten basit prosedürlerle normal insan fibroblast veya telomeraz-ölümsüzleştirilmiş insan fibroblastlar gelen proliferatif tetraploid hücreler kurmak için bir protokol açıklar. prosedürler ayrıca DC ile tedavi edilir kapalı sallayarak tarafından toplanan mitoz diploid hücreleri ve mitotik hücrelerin tutuklama mili zehir demekolsin (DC) kullanın. uzun süreli DC ile tedavi diploid mitotik hücreler tetraploid G1 hücrelere dönüştürmek ve bu hücreler ilaç çıkarılmasını takiben birkaç gün süreyle büyüme tutuklanmasının ardından da tetraploid hücreler çoğalırlar. Bu protokol sağlarkromozom istikrarsızlık ve poliploid insan hücrelerinin onkojenik potansiyeli arasındaki ilişkiyi incelemek için yararlı bir model oluşturmak için etkili bir yöntem.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre Kültürü

  1. Tetraploidi ikna etmek için hücre elde. Bugüne kadar tekniğin insan fibroblast hücre hatları TIG 1, BJ, IMR-90 ve telomeraz-ölümsüzleştirdi TIG-1 (TIG-HT) uygulanabilir olduğu teyit edilmiştir.
  2. α değiştirme veya% 10 (h / h)% 5, inkübasyon yolu ile ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) (V / ile takviye incelenecek hücre tipi için uygun herhangi bir başka hücre kültür ortamı ile minimum temel ortam içinde hücreler büyümek h) CO, 37 ° C'de 2 atmosfer. Passage hücreleri SUBCONFLUENT yoğunluğunu aşmak için her 3 ya da 4 gün değil.
    NOT: Nüfus katlama seviyesi (PDL) hücre büyümesini ve hücre yaşı değerlendirmek için Pasajlanması her zaman hesaplanmalıdır. PDL bir tabak (N1) ve aşağıdaki formül (X Başlangıç ​​PDL olan) kullanılarak aşağıdaki pasaj (N2) hasat hücre sayısı tohumlanmış hücre sayısı hesaplanabilir. PDL = X + (N1 log - N2 log) / 2 log

2. İndüksiyon ve EstaDiploid fibroblastlardan Tetraploid Hücrelerin blishment

  1. shake-off olmadan tetraploidi neden olur.
    NOT: Bazı hücre suşları (örn TIG 1) aşağıdaki gibi demekolsin (DC) ile neredeyse tamamen tetraploid sürekli tedavi ile olabilir.
    1. İşlemden önceki gün, bir ya da iki 100 mm çanağı içine Geçiş hücreleri tetraploidi uyarılması için. Genellikle, tetraploid hücrelerin uyarılması için tabak başına 5 x 10 5 6 10 x 1 hücreleri hazırlamak.
    2. 4 gün boyunca 0.1 mg / ml DC ihtiva eden ortam ile üslü olarak büyüyen hücre tedavi edin.
    3. Ilaç barındırmayan ortam ile orta DC ihtiva takın ve 37 ° C'de (h / h) CO2 atmosferinde% 5 hücreleri inkübe edin. Hücreler genellikle 1 hafta içinde çoğalmasını devam.
  2. shake-off ile tetraploidi neden olur.
    Not: çoğu hücre DC ile işlenerek bir sonucu olarak, diploid ve tetraploid popülasyonlarının bir karışımı, yukarıda (2.1) 'de tarif olur. p Bu nedenle, bazı modifikasyonlarrocedure (Şekil 1) şu şekilde diploid popülasyon gerekli ortadan kaldırmak için.
    1. Birkaç T75 içine Passage hücreleri Tetraploidi ikna etmek için tedaviden önce bir gün şişeleri. Genellikle, tetraploid hücrelerin uyarılması için en az 5 x 10 6 hücre (kap başına 1 x 10 6 hücre) hazırlar.
    2. mitoz hücreleri yakalama 18 saat - 16 0.1 ug / mL DC ihtiva eden ortam ile üslü olarak büyüyen hücre tedavi edin. mitozda hücre durdurmak için gerekli zaman hedef hücreler üzerinde bağlı olabilir ve mümkün olduğu kadar çok mitotik hücreleri elde etmek için ön deneyler ile tespit edilmelidir. Örneğin, daha yavaş büyüyen hücreler daha hızlı büyüyen hücreler daha uzun bir süre için DC ile muamele edilmelidir.
      NOT: Hücreler çok uzun bu adımda tedavisi, bunlar mitotik kaymayı tabi olabilir ve imkansız bir sonraki adımda shake-off mitotik hücreleri toplamak için yapım, çanak yüzeyine yapışır.
    3. wh, titreme-off yöntemi ile DC-tutuklandı mitotik hücreler toplayınIch gevşek yapışmış mitotik hücre ardından santrifüj şişeleri ve ortam ile yıkama hafifçe çalkalanarak (300 xg 5 dakika) ile toplanır. Bu adımda, uygun bir yöntem ile, hücre sayısı.
    4. 60 mm kültür çanakları içine alınır mitotik hücre kalkarlar ve bir 3 gün daha 0.1 ug / ml DC hücreleri tedavi. Hücrelerin en az% 10 bu tedavi hayatta için, çanak başına en fazla 1 x 10 6 mitotik hücre tohumu.
    5. ilaçsız ortamla orta içeren-DC değiştirin ve hücreler genellikle 1 hafta içinde meydana çoğalmasını, devam etmek için bekleyin.
  3. Benzer orijinal diploid hücrelere geçmesine hücreleri.

DNA ploidisi 3. incelenmesi

NOT: Bu iyi kurulmuş bir prosedürdür ve bir teknik el kitabı ayrıntılı prosedürler ve teknik ipuçları için sevk edilmelidir.

  1. Hasat hücreleri (5 x 05-01 Ekim x 10 6) bir çözeltisi con inkübe hücrelerin37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA taining ve% 10 FBS içeren ortamda tripsin nötralize eder.
  2. ortam içinde Santrifüj hücreleri ve santrifüj (300 xg 5 dakika), ardından fosfat tamponlu tuz 5 mL (PBS) içinde yeniden süspanse edilerek yıkayın.
  3. Aşağıdaki iki yöntemden biri ile DNA analizi için hücreleri hazırlamak
    1. Sabitlenmemiş hücreleri 10 analiz etmek için bir yöntem olup
      Not: Bu yöntem, hücre döngüsü analizi için ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak gerçekleştirilebilir. Hücreler prosedüründe sabit ve çekirdekler zamanla hasar olacak lekeli değildir çünkü bu yöntemle hazırlanan numuneler, derhal analiz edilmelidir.
      1. 250 mM sukroz ihtiva eden 40 mM sitrat tampon maddesi ile hücreleri yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 mM sukroz ihtiva eden 200 uL 40 mM sitrat tamponu içerisinde% 0.1 (h / h) Nonidet P40 ve 30 ug / ml tripsin 250 uL hücre tedavisi.
      2. 0.5 ug / ml tripsin inh 200 mcLOda sıcaklığında 10 dakika boyunca ibitor 250 mM sukroz ihtiva eden 40 mM sitrat tampon maddesi içinde 0.1 ug / ml RNase A ve inkübe hücreleri.
      3. 0.4 mg, 200 uL ekleyin / 250 mM sukroz ihtiva eden 40 mM sitrat tamponu içerisinde ml propidium iodide (PI) ve hücre çekirdekleri leke, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücreler inkübe edin.
    2. Sabit hücreleri analiz etmek için bir yöntem olup
      1. hücre süspansiyonu karıştırarak 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakılarak% 100 EtOH damla damla 4 mL ekleme 1 mL PBS içinde süspansiyona% 80 etanol ile hücreleri saptamak. Bu sabitleyici hücreler birkaç hafta -20 ° C'de saklanabilir.
      2. 5 ml PBS bunları yeniden süspanse hücreleri yıkanır, santrifüj (300 xg 5 dakika) eklenir. 0.5 mg / ml RNase A hücreleri tedavi ve 50 ug / ml propidyum iyodid (PI) (0.5 mg / ml RNase A 475 uL ve 1 mg 25 ul / ml PI), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ile boyanır.
  4. t DNA içeriğini analizo bir 488 nm lazer ve kırmızı kanal emisyon filtresi ile debi sitometresinde hücreleri (uzun> 610 nm pass). hedef hücrelerin ploidisi değerlendirmek için, aynı zamanda, gerçek diploid hücrelerinden hazırlanan referans bir örnek analiz edin.
    1. Seçenek olarak ise, diploid hücrelerin genel boncuk floresans yoğunluğu oranını değerlendirmek için floresan standart boncuk ekleyin. Sitometresi tek tetraploid hücreler ve diploid hücrelerin 11 kümeleri arasında ayrım yapmak akış seçeneği 'darbe genişliği vs darbe yüksekliği' kullanın.

Kromozom sayar ve Karyotip Analizi 4. Sınav

NOT: Bunlar köklü prosedürler ve teknik manuel veya üreticinin protokolleri ayrıntılı prosedürler ve teknik ipuçları için sevk edilmelidir.

  1. metafaz hücreleri yakalama 4 saat 0.1 ug / mL DC büyüyen hücreler tedavi edin.
  2. kromozom slaytlar hazırlayın.
    1. tripsinizasyon ile Hasat hücreleri (en az 5 x 10 5 hücre) ve FBS içeren ortamda askıya.
    2. ortam içinde Santrifüj hücreleri (300 xg 5 dakika) ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de hipotonik bir solüsyon (0.075 M KCI 5 mL) ile muamele.
    3. Düzeltmek ve Carnoy sabitleştirici hücrelerin süspansiyonu (metanol: asetik asit = 3: 1).
    4. Hücre süspansiyonu - (35 uL 25), küçük bir hacim bırakarak bir cam slayt üzerine hücreleri yayıldı. Böyle sıcak buhara maruz kalma gibi ek adımlar yayılan kromozom iyileştirmek için gerekli olabilir.
  3. In situ hibridizasyon kromozom sayıları veya karyotip analizi ya da çok renkli floresan leke hücreleri (mFISH).
    1. Kromozom sayıları.
      1. 20 dakika -% 5 Giemsa çözeltisi (veya floresan mikroskopi için 0.5 mg / ml RNase A ihtiva eden 5 ug / ml PI) 15 ile leke hücreleri.
      2. Dijital en az 50 metafaz hücrelerinin fotoğraf.
      3. Bir görüntü analizi softwa kullanarak hücre başına kromozom sayısını sayındokunup bir fotoğraf düzenleme yazılımı kullanarak kromozom örtüşen manuel ayrılmasından sonra yeniden. kromozom sayısı el atılır de, bilgisayar puanlama önerilir.
    2. karyotip analizi
      NOT: Bu analiz eğitimli bir teknisyen ya da profesyonel bir şirket tarafından yapılmalıdır.
      1. Standart G-bantlama tekniği 12'ye göre Leke hücreleri.
      2. Standart karyograms 12 yapmak için kromozom analiz edin.
    3. mFISH
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve gerekirse yapılmalıdır.
      1. Üreticinin protokolüne 13'e göre insan kromozomları için çok renkli FISH probları kullanılarak leke hücreleri.
      2. Uygun filtreler ile bir floresan mikroskobu ve mFISH analizi 13 için bir yazılım kullanılarak kromozom analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deneyimlerimize göre, TIG-1 hücreleri, 4 gün boyunca 0.1 mg / ml DC (Şekil 2A) ile birlikte basit sürekli işlenerek hemen hemen tamamen tetraploid yapılabilir. Buna karşılık, BJ ve IMR-90 ve TIG-HT hücreleri gibi diğer fibroblast suşlar, çalkalama kapatma yöntemiyle diploid aynı tedavi sonrası tetraploid popülasyonları ve mitotik hücrelerin izolasyonu bir karışımı olmuştur sırasında gerekli olan (- tedavinin başlamasından sonra 18 saat, genellikle 16) (Şekil 2B, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

kimyasal ajanlarla diploid hücrelerinden tetraploidi indüklenmesinde önemli bir sorun, her iki sitokinez önleyicileri ya da aks önleyicileri, hücreler çoğu zaman, diploid ve tetraploid popülasyonlarının karışımı haline ve tetraploit hücreler diploid hücrelerinden ayrılmalıdır. diploid hücrelerin ücretsiz tetraploid nüfusun izolasyonu için en yaygın yaklaşım, sınırlayıcı seyrelti yoluyla FACS ya klonlamadır. Ancak, bu işlemler zahmetli ve gerçekleştirmek kolay değildir. Bu yazıda, normal insan fibroblastlar gelen diploid...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi var olduğunu beyan ederiz.

Teşekkürler

Teknik yardım için Bayan Matsumoto'ya teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MEM-&alfa;Sigma-AldrichM8042-500ML
Tripsin-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
Demecolcine çözeltisi (10 & mu; HBSS'de g/mL)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD DöngüsüTES Plus DNA Reaktif KitleriBD Biosciences#340242DNA ploidisinin akış sitometrisi ile incelenmesi için
İnsan kromozomu çok renkli FISH probu 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DImFISH analizi için özel filtre seti ve yazılım gereklidir
mFISH ile Isis görüntüleme sistemi  yazılımı MetaSystemsÖzel prob kiti gereklidir

Kaynaklar

  1. Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
  2. Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67(2007).
  3. Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
  4. Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
  7. Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
  8. Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
  9. Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
  10. Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
  11. Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).
  12. Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
  13. Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
  14. Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
  15. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198(2013).
  16. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
  17. Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
  18. Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
  19. Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
  20. Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
  21. Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
  22. Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
  23. Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Demekolsin UygulamasSallama ay rma Y ntemiMitotik DurdurmaAk Sitometrisi AnaliziKromozom Say mDNA Ploidi AnaliziH cre K lt r ProtokolKarsinogenez Ara t rmas
Transforme İnsan Fibroblastlar gelen Proliferatif Tetraploid Hücreleri kurulması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.