Yöntem makalesi

Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

DOI:

10.3791/55035

⸱

8 Ocak 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Smart-aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 2Physiology and Experimental Medicine Program, The Hospital for Sick Children Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, serumdan türetilmiş fare embriyonik kök hücrelerin içinde (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) için bir yöntem sağlar (fetal inek serumu, FBS) - ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) bir hücrenin içermeyen koşullar -ücretsiz yaklaşım. Bu yaşlanma ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların tedavisi için uygun olabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) çeşitli hücre tipleri üretme kapasitesi, rejeneratif tıp alanında yeni yollar açmıştır. Bununla birlikte, faydalarına rağmen, ESC'lerin ve iPSC'lerin tümörjenik potansiyeli, klinik uygulamalar için uzun süredir bir engel olmuştur. İlginç bir şekilde, ESC'lerin doku yenilenmesini teşvik edebilen ve hücresel yaşlanmayı geciktirebilen birkaç çözünür faktör ürettiği gösterilmiştir, bu da ESC'lerin ve iPSC'lerin hücresiz bir müdahale yöntemi olarak da kullanılabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, fare embriyonik kök hücresi (mESC) ile şartlandırılmış ortamın (mESC-CM) serum bileşenlerinin (fetal sığır serumu, FBS) ve besleyici hücrelerin (fare embriyonik fibroblastları, MEF'ler) minimum kontaminasyonu ile hasat edilmesi yöntemi çok talep edilmiştir. Burada, bu çalışma, serum ve besleyici içermeyen koşullar altında mESC-CM'nin toplanması ve yaşlanma ile ilişkili çoklu okumalar kullanılarak mESC-CM'nin karakterizasyonu için optimize edilmiş bir yöntemi göstermektedir. Bu protokol, serum ve besleyici kontaminasyonu olmadan saf mESC'ye özgü salgı faktörlerini toplamak için bir yöntem sağlayacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, serum- ve besleyici içermeyen kültür koşullarından fareye embriyonik kök hücre (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) toplamak ve biyolojik fonksiyonları karakterize etmektir.

Genel olarak, embriyonik kök hücreler (EKH) nedeniyle kendini yenileme 1-3 onların pluripotensin ve kapasite rejeneratif tıp ve hücre tedavisinde büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak, kök hücrelerin doğrudan nakli gibi bağışıklık reddi ve tümör oluşumu 4,5 gibi çeşitli sınırlamalar vardır. Bu nedenle, bir hücre barındırmayan bir yaklaşım rejeneratif tıpta ve yaşlanma müdahaleler 6,7 için alternatif bir tedavi stratejisini sağlayabilir.

Yaşlılık büyüme durması, değişmiş hücre fizyolojisi ve davranışları sürekli devlet tarafından karakterize doku ve organların yaşlanması, bir hücresel meslektaşı olarak görülüyor. kanser dahil yaygın hastalıklar, kardiyovasküler hastalık, t ana risk faktörüdür Yaşlanma2 diyabet ype ve nörodejenerasyon 8. Yaşlanmanın bariz özelliklerinden biri kök hücre yaşlanması ve bitkinlik 9 kaynaklanan dokuların rejeneratif potansiyelinin, düşüş olduğunu. Birçok önemli çalışmalar, sürekli yaşlanmayı geciktirmek ve ömrünü uzatmak için yeteneği var rapamisin 9, resveratrol 10, ve metformin 11 ve kan yoluyla bulaşan sistemik faktörler, yani GDF11 12 gibi farmakolojik molekülleri göstermiştir.

Bu çalışmada, Mesc-CM, serum faktörleri ve MEF'lerden salgısal faktör kontaminasyonu ortadan kaldırır serumsuz (fetal inek serumu, FBS) ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) katmanları hasat edilmiştir. dolayısıyla Mesc özgü salgı faktörlerin doğru tespit etkin bir serum- ve besleyici içermeyen CM izin Bu koşullar.

Bu önerilen protokol nispeten yüksek verimli, etkin maliyet ve kolayçalıştırmak için. Bu teknik, yaşlanma ile ilişkili hastalıklar ve diğer yenileme için girişimler karşı güvenli ve potansiyel olarak avantajlı bir hücresiz terapötik bir yaklaşım geliştirilmesi için kullanılabilecek bir anti-yaşlılık etkisi aracılık edebilen Mesc türetilen çözünür faktörlerin tanımlanması, kavranmasını sağlar tedaviler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: serum- ve besleyici-CM toplama protokolün bir şeması, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1. Malzemeler (MEFS Hazırlanması, Orta, Tabaklar, ve Çözümler)

  1. Kültür MEF'ler orta 500 ml hazırlayın. % 10 FBS (ESC kalitesi), 50 birim / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) Supplement.
  2. Kurulmuş bir rutin protokolü 13 aşağıdaki embriyolar MEFS ayırmak ve MEF ortamda onları korumak.
  3. kültüre mESCs ortamının 500 ml hazırlayın. DMEM% 15 FBS ve 2 mM L-glutamin, 100 uM esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100 uM β-mersaptoetanol, 100 birim / ml, lösemi önleyici faktörü (LİF), 50 birim / ml penisilin ve 50 ile desteklenir mg / ml streptomisin.
  4. % 0.1 jelatin çözeltisinin 5 ml'si ile 10 cm hücre kültür kaplarına kaplanarak jelatinleştirilmiş plakaları (5 jelatinleştirilmiş levhalar / 1 Mesc plaka) hazırlayın. En az 10 dakika süreyle inkübe edin oda sıcaklığında.
  5. mESCs bir serumsuz durum için azaltılmış serum ortamı 500 ml hazırlayın. sodyum bikarbonat, 1.2 g (pH 7.0) serum ortamında Azaltılmış ek. 0.2 mikron şişe üstü filtre ile filtre.
  6. yaşlanmayla ilişkili β-galaktosidaz (SA β-gal) yaşlanmış hücrelerin saptanması için boyama çözeltisi hazırlayın: 1 mg / ml X-gal, 40 mM sitrik asit / sodyum fosfat tamponu (pH 6.0) (dimetilformamid, DMF içinde çözülmüş), , 5 mM potasyum ferrisiyanür, 5 mM potasyum ferrosiyanür, 150 mM NaCI ve 2 mM MgCl2 14.
    DİKKAT: (Tehlikeli) DMF toksik ve korozif bir çözümdür. Çözüm işlerken kişisel koruyucu giysiler (örneğin, nitril veya lateks eldiven, bir laboratuvar önlüğü, gözlük ve) giyin. Bir davlumbaz kullanın.
  7. Kültür insan dermal fibroblastları (HDF'ler, NHDF-Ad-Der fibroblast) orta 500 ml hazırlayın. % 10 FBS ve 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile DMEM Supplement.
Fare Embriyonik Kök Hücreler jove_title "> 2. Kültür (Şekil 1 A ve 2A)

NOT: Bir hücre kültürü biyolojik güvenlik kabini tüm adımları uygulayın.

  1. 15 cm'lik bir hücre kültür kabı mitomisin C, 10 ug / ml ihtiva eden MEF ortam 20 ml MEFS tedavi edin. 37 ° C de 2 saat ve% 5 CO2 inkübe edin.
  2. MEF'lerden orta aspire. PBS ile üç kez hücreleri yıkayın. Tripsin-EDTA (TE, 1 x) 3 ml ilave edilir ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edilir. 3 dakika sonra, 300 x g, 3 dakika boyunca MEF orta ve santrifüj 6 ml TE nötralize.
  3. MEF ortam 5 ml içinde süspanse. tripan mavisi boyama ve hemasitometre kullanarak elde edilen hücre süspansiyonu hücre sayısını belirlemek. MEF ortam içinde 10 cm'lik bir hücre kültür kabı başına 2 x 10 6 hücre yoğunluğunda Plaka etkisizleştirilmiş MEF'ler (besleyici). 37 ° C'de 24 saat% 5 CO2 inkübe edin.
  4. üzerinde (besleyici kaplama sonrası Mesc orta MEF ORTA 24 saat değiştirinErtesi gün).
  5. Mesc ortamı ile besleyici 2 x 10 6 hücre yoğunluğunda levhaya mESCs (G4 F1 hibrit ES hücre). 37 ° C'de 48 saat% 5 CO2 inkübe edin.
    NOT: Mesc-CM anti-aging etkisi alt geçit sayısı mESCs 15-17 kullanıldığında olasılıkla güçlüdür. Biz Lunenfeld-Tanenbaum Araştırma Enstitüsü, Mount Sinai Hastanesi, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Kanada Dr. Andras Nagy bir G4 Mesc hattı satın aldı.
  6. Bir% 70-80 alt konfluent durumda nispeten daha yüksek bir yoğunluğa ve geçiş hücreleri tutun. günlük taze Mesc orta orta değiştirin.

3. Serum- ve toplama besleyici içermeyen, koşullu ortam (Şekil 1B ve 2B)

NOT: Bir hücre kültürü biyolojik güvenlik kabini tüm adımları uygulayın.

  1. 5 ml PBS ile Mesc plaka durulayın. TE (2.5 x) 1 ml ilave edilir ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edilir. 3 dakika sonra, Mesc Mediu'nun 2 ml TE nötralizem ve 300 x g 'de 3 dakika süre ile santrifüj.
  2. Mesc ortamı her jelatin kaplı kültür kabı (5 jelatinleştirilmiş levhalar / 1 Mesc plaka) içine Mesc orta ve plakanın 1 mi, 5 ml içinde süspanse. 37 ° C 'de kültür ve% 5 CO2 80-85 kadar,% konflüansa ulaşılır.
  3. Üç yıkama, toplam yıkama başına 10 dakika için hücreler (10 cm plaka başına 8 mi) karşılamak için yeterli PBS ile mESCs yıkayın. 37 ° C'de 24 saat% 5 CO2 için azaltılmış serum Ortamda inkübe edin.
    NOT: yıkama aşaması FBS bulaşmasını önlemek için önemlidir. Kuluçka süresi 18,19 takip etmek önemlidir.
  4. 2,500 x g'de 20 dakika boyunca 50 ml'lik konik bir tüp ve santrifüj içine Mesc-CM toplayın. santrifüj sonra süpernatant solüsyonu (CM) toplayın. 0.2 mikron şişe üstü filtre ile filtre.

Fare Embriyonik 4. Etkileri Kök Hücre klimalı Orta (Mesc-CM)

Not: Mesc-CM etkileri gibi çeşitli yöntemler ile doğrulanmıştırSA β-gal tahlil, hücre döngüsü analizi ve QRT-PCR.

  1. SA β-gal testi (Şekil 3A)
    1. HDF ortamında 6 kuyulu levhalarda kuyu başına 2 x 10 4 hücre yoğunluğunda tohum HDF'ler. 37 ° C'de gece boyunca inkübe ve% 5 CO2.
    2. bir gecede inkübasyonu takiben, ıskarta HDF orta yarısı ve Mesc-CM ve kontrol ortamı ekleyin. 37 ° C'de 72 saat% 5 CO2 inkübe edin. Kontrol ortamı mESCs yokluğunda bir jelatin kaplı tabak (serum ortamında azalır), serumsuz ortamda elde edilir.
    3. İki yıkama, toplam yıkama başına 30 saniye için hücreler (6-çukurlu plaka başına 2 mi) karşılamak için yeterli hücrelerin PBS ile yıkayın. fiksasyonu için% 3.7 paraformaldehid (PFA) ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
      DİKKAT: (Tehlikeli) Paraformaldehyde toksik ve korozif bir çözümdür. Çözüm işlerken kişisel koruyucu giysiler (örneğin, nitril veya lateks eldiven, bir laboratuvar önlüğü, gözlük ve) giyin.Bir davlumbaz kullanın.
    4. sabitleme çözüm aspire. Aşama 4.1.3 de tarif edildiği gibi, iki kez PBS ile sabitlenmiş hücreler yıkanır.
    5. (1-2 mi göz başına 6 çukurlu bir tablanın bir çukuru) SA β-gal ile boyama solüsyonu ekleyin. 37 ° C'de 17.5 saat süreyle inkübe edin.
      NOT: Bu bir CO2 inkübatörde inkübe edilmesi değildir.
    6. SA β-gal ile boyama çözeltisi aspire ve aşama 4.1.3 de tarif edildiği gibi, iki kez PBS ile yıkayın hücreleri.
    7. Karşı boyama Eosin solüsyonu eklenir. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. Aşama 4.1.3 de tarif edildiği gibi, iki kez PBS ile yıkayın hücreleri.
    8. sonraki analiz için bağlı bir dijital kamerayı kullanarak ışık mikroskobu ile yakalama görüntüleri kullanarak 100X büyütmede görüntü hücreleri.
      NOT: hücrelerin toplam sayısı kör bir şekilde sayılabilir ve SA β-gal pozitif mavi hücrelerin yüzdesi hesaplanabilir.
  2. Hücre Döngüsü Analizi (Şekil 3B)
    1. bir yoğunlukta tohum HDF'lerHDF ortamında 6 cm hücre kültür kaplarına oyuk başına 8 x 10 4 hücre. 37 ° C'de gece boyunca inkübe ve% 5 CO2.
    2. bir gecede inkübasyonu takiben, ıskarta HDF orta yarısı ve Mesc-CM ve kontrol ortamı ekleyin. 37 ° C'de 24 saat% 5 CO2 inkübe edin.
    3. 300 x g, 5 dakika için tarif 3.1 adım ve santrifüj gibi, hücreler tripsinize. Gibi soğuk PBS çözeltisi ile yıkanır hücreler 2500 x g'de 3 dakika boyunca iki kez ve santrifüj (PBS, 0.5 mM CaCl2 ve% 2 FBS, 1.5 mi tüp başına 1 mi) ile. gibi soğuk PBS çözeltisi 100 ul süspanse edin.
    4. vorteks ederken soğuk etanol 200 ul bırakarak hücreleri sabitleyin. en az 1 saat boyunca 4 ° C'de depolayın.
    5. Aşama 4.2.3 de tarif edildiği gibi, iki kez soğuk PBS çözeltisi ile hücreleri yıkayın.
    6. 50 ug / ml RNase içeren sodyum sitrat tamponunda 250 ul (1.12%, pH 8.5) 'de tekrar süspansiyon hücreleri. 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
    7. sodyum sitrat 250 ul ekleyinTampon 50 ug / ml propidyum iyodür içeren. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
    8. 20 akış sitometrisi kullanılarak her numune 10.000 hücre ölçün.
  3. QRT-PCR (Şekil 3C)
    1. adımlar 4.1.1 ve 4.1.2 de açıklandığı gibi tohum HDF'ler ve Mesc-CM ekleyin.
    2. üreticinin protokolüne uygun olarak bir RNA özütleme kiti kullanılarak HDF'ler toplam RNA izole edin. Bir spektrofotometre 21 kullanılarak çıkarılan toplam RNA sayısal olarak.
    3. Üreticinin protokolüne 20 göre oligo (dT) primerleri ve M-MLV ters transkriptaz ihtiva eden reaksiyon karışımı, 20 ul toplam RNA'nın 1 ug ekleyerek cDNA sentez.
    4. Yeşil PCR ana karışımı ve özel gen primerler (Ek Tablo 1) kullanarak, gerçek zamanlı PCR makinesi ile cDNA amplifikasyon ölçün. GAPDH ifade ile veri normalleştirmek. Aşağıdaki PCR protokolü kullanın: İlk de95 ° C'de 10 dakika boyunca doğma; 95 ° C'de 15 saniye boyunca 45 devir, 55 ° C'de 20 saniye ve 72 ° C'de 35 saniye; ve 95 ° C, 60 ° C de 1 dakika, 95 ° C'de 30 saniye ve 60 ° C'de 15 C'de 5 saniye, 15 saniye için erime eğrisi aşaması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başlangıçta, mESCs FBS ve diğer ek (Şekil 1 A ve 2A) ile Mesc ortam içinde bir MEF besleyici tutulur. CM besleyici tabaka FBS ya da diğer ek (Şekil 1B ve 2B) olmadan düşük serum ortamında mESCs toplanmıştır. Bu kültür durum bize besleyici, FBS veya diğer takviyeleri faktörler tarafından potansiyel kirlenme olmadan klimalı ortam Mesc-özgü toplamak için izin verir. Kontrol ortamı mESCs olmadan aynı kültür koşullarında topl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

serum- ve besleyici içermeyen Mesc-CM başarıyla toplanması için aşağıdaki öneriler dikkate alınmalıdır. En önemli faktör Mesc-CM toplanması için erken geçiş mESCs kullanıyor. Daha önce, bu erken geçiş Mesc-CM geç geçişli mESCs göre daha iyi bir anti-yaşlanma etkileri olduğu gösterilmiştir. MESCs geçiş sayısı gelişim potansiyeli 16 ve pluripotensini 17 etkilediği bildirilmiştir.

Ek araştırmalar, anti-yaşlılık etkilere neden Mesc secretome, belirli faktörleri incelemek iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Temel Bilimler Araştırma Programı (2013R1A1A2060930) ve Tıbbi Araştırma Merkezi Programı (2015R1A5A2009124) Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla (UÇK), Bilim, BİT Bakanlığı tarafından finanse edilen ve Gelecek Planlama tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma aynı zamanda Hastanesi Çocuk Hastalıkları (HK Sung) bir Başlangıç ​​İşletim Grant tarafından desteklenmektedir. Biz G4 Mesc hattını sağlamak için bu el yazması ve Dr. Andras Nagy düzenleme onların mükemmel yardım için Laura Barwell ve Sarah JS Kim teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMInvitrogen# 11960-044
FBSInvitrogen#30044333% 20, ES hücre kalitesi
Penisilin ve streptomisinInvitrogen# 1514050 birim / ml penisilin ve 50  mg / ml streptomisin
L-glutaminInvitrogen# 250302  mM
Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)İnvitrojen#11140100  &mikro; M
β-merkaptoetanol Sigma#M3148100  &mikro; M
Lösemi inhibitör faktör Millipore#ESG1107100 birim/ml
OPTI-MEMInvitrogen#22600
X-gal Sigma#B42521 mg / ml
Paraformaldehit (PFA)SigmaP6148%3.70
Dimetilformamid (DMF)Sigma#D4551
Potasyum ferrisiyanürAldrich#4559465 mM
potasyum ferrosiyanürAldrich#4559895 mM
NaClSigma#S7653150 mM
MgCl2< / sub>Sigma#M23932 mM
Mitomisin CSigma#M428710  &mikro; g/ml
Propidyum iyodür Sigma#P417050  &mikro; g/ml
TRIzolAmbion#15596018
M-MLV ters transkript-tazePromega#M170B
Güç SYBR Yeşil PCR ana karışımı Uygulamalı Biyosistemler# 4367659
HDF'ler, NHDF-Ad-Der-Fibroblast LONZA#CC-2511
Şişe üstü filtreCorning# 4305130.2 & mu; m

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608(2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192(2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Embriyonik K k H creleriSerumsuz K lt rBesleyici H cresiz Ko ulland r lm BesiyeriSenesansla li kili Beta Galaktosidaz AnaliziAk Sitometrisi AnaliziKantitatif Ters Transkriptaz PCRnsan Dermal FibroblastlarH cre D ng s AnaliziRNA Ekstraksiyon KitiReal time PCR Cihaz

İlgili makaleler