Yöntem makalesi

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

DOI:

10.3791/55038

⸱

6 Şubat 2017

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Division of Infectious Diseases, Miller School of Medicine, University of Miami

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, intraepitelyal gama delta T hücrelerinin analizi için insan endoservikal intraepitelyal lenfositlerini elde etmek için bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, endoservikal gama delta T hücrelerinin manyetik boncuklar veya hücre sınıflandırması ile saflaştırılması için genişletilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kadın üreme yolları (FRT) mukozal bağışıklık sistemi ilk savunma hattı olarak hizmet vermektedir. Genital mukozanın daha iyi bilgi HIV dahil olmak üzere farklı patojenlerin patojenitesini anlamak için elzemdir. Gama ö (GD) T hücreleri 'alışılmamış' T hücrelerinin prototipi ve gamma ve delta zincirlerinden oluşan heterodimerik T hücre reseptörleri (TCR'ler) kendi ekspresyonu ile tanımlanan T hücrelerinin görece küçük alt grubunu temsil eder. Bu alfa-beta TCR ile tanımlanır klasik ve daha iyi bilinen CD4 + yardımcı T hücreleri ve CD8 + sitotoksik T hücreleri ayıran. GD T hücreleri genellikle dokuya özel dağılımını gösteren ve epitelde zenginleştirilmiştir. GD T hücreleri iltihap, tümör gözetimi, enfeksiyon hastalıkları ve otoimmünite immün yanıtları düzenlemişlerdir.

Burada, tekrarlanabilir izole ve insan endoservikal intraepitelyal GD T lenfositleri analiz etmek için bir yöntem mevcut. Biz haKadın Kurumlararası HIV enfeksiyonu Çalışması (WIHS) katılan kadınlardan kullanılan endoservikal cytobrush örnekleri ettik. vajinal mukoza hakaret var olduğu koşulları sırasında GD T hücreleri etkileşimleri hakkında bilgi vajinal microbicides.In ek geliştirilmesi dahil olmak üzere, mukozal açığı ele aldığı herhangi bir klinik çalışmada uygulanan olabilir, mukozal GD T hücre yanıtları hakkında bilgi vardır enfeksiyonlu hastalıkların tedavi edilmesi GD T hücre tabanlı immün terapinin uygulanması için potansiyeli.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz intraepitelyal GD T hücrelerini değerlendirmek için endoservikal fırça örneklerini kullanarak metodolojisini geliştirdi. endoservikal kanal kolumnar epitel tek bir tabaka ile kaplı olduğu. İntraepitelyal lenfositler patojen mikropların 7, 8 karşılaşmak üzerine immün yanıtları hızla başlatabilir epitel tabakası içinde ikamet cephe lenfositler temsil etmektedir. endoservikal intraepitelyal bölmenin immünolojik olayların anlaşılması HIV de dahil olmak üzere hastalıklardan korunmak için etkili stratejiler tasarımı için önemlidir.

Önerilen yöntem, bundan başka, HIV enfeksiyonu ya da HIV enfeksiyonu riski taşıyan kadınlarda intraepitelyal GD T hücrelerinin rolünün anlaşılması için çalışmalar yeni toplanmış insan endoservikal örneklerinde hem de dondurulmuş endoservikal hücreler için uygulanabilir. Bu protokolün ana amacı endoservikal intraepitelyal bölmede yeni immünolojik olayları keşfetmek ve değerlendirme, içinHIV enfeksiyonu olan kadınlarda mukozal açığına bir göstergesi olarak e GD T hücresi tepkileri.

FGT bağışıklık etrafında bilgide önemli boşluklar başarıyla toplanması ve mukozal örnekleri işleme zorluk kısmen kaynaklanmaktadır. Ayrıca, karmaşık mukozal bağışıklık hücrelerinin heterojen ve birbirleri ile birbirine bağlılığı, bağışıklık sisteminin durumunu ve yeteneği yansıtan klinik olarak önemli ölçümler belirlenmesi için önemli zorluklar vardır. Biz daha olacak FRT dokunulmazlık yatan mekanizmaları belirlemek için kritik olabilir son derece mültipleksli, tek hücreli teknolojileri kullanılarak analiz edebilir yüksek derecede saflaştırılmış intraepitelyal GD T hücrelerini elde etmek için bir yöntem geliştirdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma faaliyetleri Miami Kadın HIV Kurumlararası Çalışması (WIHS) ve AIDS Araştırma Miami Merkezi (SYAO) .Institutional İnceleme Kurulu (Üniversitesi Tıp Miami Miller Okulu) onayı öncesinde elde edilmiştir işbirliği ile Miami HIV Araştırma Birimi Üniversitesi'nde gerçekleşti işe alma ve herhangi bir değerlendirme veya çalışma ile ilgili prosedürlere.

1. Endoservikal Fırça Örnek Toplama

NOT: Katılımcılar eğitim MD ya da jinekolog ve cytobrush takarak spekulum muayenesinde altında yapıldı intraepitelyal lenfositler toplanması tarafından gerçekleştirilen bir vajinal muayene yapıldı.

  1. katılımcı özellikleri
    1. cinsel olarak aktif hamile değil ve kontraseptif ilaçlar veya rahim içi cihaz ile yaş, 18 ila 45 yaş arası kadınlar katılımcıları askere.
    2. Vajinal muayenede önce, sahip katılımcıların yeşil bir 10 ml kan beraberlik geçmesiperiferik kan mononükleer hücre (hücre) izolasyonu için üst heparin vacutainers. endoservikal intraepitelyal analiz 9 için bir kontrol olarak hizmet vermektedir.
  2. Endoservikal örneklerinin toplanması
    1. yağlama olmadan vajina içine uygun büyüklükte bir steril spekulum yerleştirin. spekulum ve mukus temizlemek için steril gazlı bez sokulmasını kolaylaştırmak için ılık su kullanın. spekulum pozisyonu os ve ektoservikste tam görünüm için izin verir.
    2. Ancak yakın sadece kıllar görünür olana kadar endoservikal kanala endoservikal fırça yerleştirin. 360 ° fırça saat yönünde çevirin. IMDM ortamı 5 ml ihtiva eden 15 mL'lik bir tüp içerisine fırça aktarın.
    3. Toplandıktan hemen sonra, buz üzerinde cytobrush içeren tüp yerleştirin. Toplanan intraepitelyal hücrelerinin yüksek canlılığını elde edilmesi için, 1 saat içinde ve laboratuar işleme cytobrush sağlar.

2. Endoservikal Cytobrush Örnek İşleme

  1. 4 kısa (10 saniye) vuruş uygulayarak endoservikal cytobrush içeren vorteks tüp.
  2. X 250 g 10 dakika süre ile, cytobrush içeren tüp santrifüjleyin.
  3. Dikkatle tüpten cytobrush çıkarın (tüpün altındaki pelet rahatsız etmeyin) ve IMDM medya 1 ml ekleyin ve buz üzerinde tüp yerleştirin.
  4. 50 ml tüp üstünde 100 mm hücre süzgecinden üzerinde cytobrush yerleştirin.
  5. 20 ml IMDM ile cytobrush yıkayın.
  6. 250 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj tüpü.
  7. Süpernatantı Durusu ve pelet hücreler 1 ml IMDM tekrar süspansiyon ve 2.3 tarif zaten yeniden askıya pelet ile birleştirir.
  8. Otomatik bir hücre sayacı 10 ile hücre sayımı veya tripan mavi boya, 10 uL hücre süspansiyonu 10 uL birleştirerek hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Yavaşça pipetlemeyin yukarı ve on kat aşağı hücreleri karıştırmak ve boya. Yük 10 uLİki hemositometre odaları birinin açıklığı içine karışımı. Beş ızgara alanlarında tüm hücreleri saymak. canlı ve cansız hücreler ayrı sayımı tutun. aşağıdaki formül kullanılarak hücre canlılığı belirlemek:% Canlı hücreler = cansız hücreler x 100 / toplam hücre sayısı hücreleri.
    Aşağıdaki hesaplamalar kullanarak ml başına müteakip hücre konsantrasyonu (ve hücrelerin toplam sayısı) belirler. ml başına toplam Hücreler = toplam hücre sayılan x (seyreltme faktörü / sayılan kare sayısı) 10.000 hücre / ml x.
  9. % 10 DMSO ve% 90 FBS ihtiva eden dondurma ortamı kullanılarak izole endoservikal hücreleri dondurun.

3. Akım Sitometri

  1. PBS% 1 sığır serum albümini içeren 100 ul FACS tampon maddesi içinde 1-3 X 10 5 endoservikal hücreler (yeniden askıya
  2. 1 uL / 10 Ekle 6 CANLI / DEAD fixable Sarı Ölü Hücre Leke kiti ve Tablo 1'de açıklanan konsantrasyonlarda yüzey belirteçleri için antikorlar.
  3. ışıktan korunan + 4 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe hücreleri.
  4. 350 xg 5 dakika için 1 ml FACS tampon ve hücreleri santrifüj tüpleri ekleme
  5. 300 uL% 1 paraformaldehid hücre pelet yeniden askıya.
  6. FACS tampon 100 ul boncuk bir damla ve örnek boyama için kullanılan antikorlara aynı konsantrasyonda eklenmesi ile boyanması için kullanılan boncuk ve antikorlar kullanılarak dengeleme kontrol hazırlayın.
  7. sitometre 405 nm, 488 nm ve 635 nm lazer ile donatılmış bir akış lekeli boncuk ve örnekleri edinin.

4. endoservikal Gamma Delta T Hücre İzolasyonu

  1. Manyetik boncuk ayırma
    1. Yeniden askıya Malzemeler ve Reaktifler Tablo başvurulan TCR gama delta microbead kitine dahil tampon 40 uL, 2.6 anlatılan endoservikal hücre pelet (≤10 7 toplam hücreleri).
    2. iki adımlı boyama protokolü için kit talimatları uygulayın: Birincisi, zekâanti-hapten mikroboncuklar-FITC H, anti-TCR y ö hapten antikoru ve ikinci
    3. 4-8 ° C'de 15 dakika inkübe edildikten sonra, 10 dakika boyunca 300 x g'de tampon ve santrifüj 1 mL eklenerek hücrelerin yıkayın. Tersine tüp süpernatant süzün ve bir kağıt parçası yardımı ile kuru dokunun.
    4. Resim tampon 500 uL hücre pelet yeniden askıya ve satıcının protokolüne göre, uygun manyetik ayırıcı yerleştirerek manyetik kolon hazırlanmıştır.
    5. kolona hücre süspansiyonu uygulayın ve geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak ve tampon uygun miktarda (500 uL) ile kolon 3x yıkayın. bir tampon üç kez, kolon rezervuar boş bir kez her zaman ekleyerek yıkama adımları uygulayın. toplam atık toplamak. Bu durum işaretlenmemiş, negatif hücre fraksiyonudur
    6. Sütun sütun üzerine tampon 1 ml manyetik ayırıcı ve pipet oluşturmak ve hemen manyetik etiket ile fraksiyonu floş kaldırsıkıca kolonu ile birlikte piston uygulayarak hücreleri ed.
      NOT: manyetik olarak etiketlenmiş anti-hapten mikroboncuklar floresan boya FITC ile konjuge beri İzole gama delta T hücresi zaten floresan akış sitometri analizi için boyandı.
  2. hücre sıralama
    1. canlılığı kalıbı ve antikor paneli ile hücre sıralama, etiket endoservikal hücreler için bölüm 3'de tarif edildiği gibi.
    2. Canlı, CD45 +, CD3 + ve gama delta pozitif hücreler üzerinde elektronik kapıları kurmak ve hücre sıralama gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son zamanlarda, endoservikal intraepitelyal GD T hücrelerini analiz ve HIV bulaşmış kadınların 9, 11 yılında endoservikal gama delta T hücrelerinin kaybı bildiren ilk sendin. Burada, biz izole etmek ve endoservikal gama delta T hücrelerinin alt kümesini analiz protokol açıklar. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, GD T hücreleri hali hazırda insan endoservikal hücre örneklerinde tespit edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kadın alt genital sistem mukoza açığına değerlendirilmesi, HIV edinimi ve bulaşma riskini ele klinik çalışmaların önemli bir bileşenidir. Tipik haliyle, HIV enfeksiyonuna FGT güvenlik genital salgıları (sitokinler, kemokinler ve antimikrobiyal peptitler) 12, 13 içinde çözünür immün modülatörler ölçerek değerlendirilir. Ancak, bu biyobelirteçler, vajinal iltihap sadece göstergesidir fizyolojik ve patolojik olaylardan etkilenir ve her zaman doğrudan mukozal hasarı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bir çıkar çatışması doğurabilecek ticari veya başka ilişki yoktur (örneğin, ilaç hisse senedi sahipliği, danışmanlık, danışma kurulu üyeliği, ilgili patentler ya da araştırma fonu).

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bu çalışmalarına katılmak için istekli olduklarını Miami WIHS çalışma katılımcılara teşekkür ederiz. Bu yazıda veriler Miami Kadın Kurumlararası HIV Çalışması (WIHS) ile toplanmıştır. Bu yayının içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Bu çalışma İlerletme Allerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve Kadın Kurumlararası HIV enfeksiyonu Çalışması (WIHS) [hibe sayısı U01 AI103397], Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, Sağlık [hibe sayısı P30AI073961] National Institutes, Ulusal Merkezi tarafından desteklenen Sağlık translasyonel Bilimleri ve Azınlık Sağlığı ve Sağlık Farklılıkların Ulusal Enstitüsü, Sağlık [hibe sayısı UL1TR000460 ve 1KL2TR000461] Ulusal Enstitüsü, Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi, Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü [hibe sayısı K23HD074489].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cytobrush Plus GT (CareFusion, San Diego, CA, ABD
IMDM, Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Medium ThermoFisher Scientific12440061
Beckman Coulter otomatik hücre sayacı (Vi-CELL Serisi Hücre Canlılık AnalizörüBeckman Coulter496178
DMSO, Dimetil sülfoksit ve nbsp;Sigma Aldrich D2650
FBS, Fetal Sığır Serumuİnvitrojeni, Gibco26140-079
PBSInvitrogen, Gibco10010023
BSA Sigma AldrichA-9647
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Sarı Ölü Hücre Lekesi kiti YaşamTeknolojileri,L349S9
%1 paraformaldehitSigma Aldrich D6148
Fortessa akış sitometresi Becton Dickinson
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
ArC Amin Reaktif Kompanzasyon Boncukları (Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NY, ABD)Yaşam TeknolojileriA10346
anti-TCR gama/delta Mikro Boncuk KitiMilteny Miltenyi Biyotec A.Ş.130-050-701
MS sütunu103-042-201
MACS ayırıcı4124

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
  2. Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
  3. Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
  4. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
  5. Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
  6. Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687(2014).
  7. Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
  8. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
  9. Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
  10. Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
  11. Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045(2016).
  12. Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
  13. Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
  14. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
  15. McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675(2014).
  16. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Endoservikal F r a rne iManyetik Boncuk zolasyonuFloresanla Aktive Edilmi H cre Ay klamaTCR Gama DeltaCD45 Pozitif H crelerCD3 Pozitif H crelerCanl l k Boyas Ekspresyonuleriye Da l m Yan Da l m Grafi i

İlgili makaleler