Yöntem makalesi

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

19.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55039

⸱

2 Ocak 2017

 , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services

Bu makalede

Özet

Monosit tek tabakalı test (MMA), Fcγ reseptörü (FcγR) aracılı fagositozu değerlendirmek için memeli periferik tam kanından elde edilen izole primer monositleri kullanan bir in vitro testtir.

Özet

Başlangıçta serolojik olarak uyumsuz kanın transfüzyon sonuçlarını tahmin etmek için geliştirilmiş olsa da, monosit tek tabakalı test (MMA), hem araştırma hem de klinik ortamlarda antikor ve Fcγ reseptörü (FcγR) aracılı fagositozun farklı yönlerini incelemek için modifiye edilebilen çok yönlü bir in vitro testtir. Test, memeli tam kanından izole edilen periferik kan mononükleer hücrelerinden yapışık monositleri kullanır. MMA, hem insan hem de fare araştırmalarında kullanılmak üzere tanımlanmıştır. Bu monositler, bağışıklık tepkilerinde yer alan FcyR'leri (örneğin, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB ve FcγRIIIA) eksprese eder. MMA, özellikle antikora duyarlı kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) FcyR'lere yapıştığı ve / veya aktive ettiği ve daha sonra monositler tarafından fagositoza uğradığı FcyR aracılı etkileşimlerin, özellikle fagositoz mekanizmasını kullanır. İn vivo, esas olarak dalak ve karaciğerde bulunan doku makrofajları, antikor opsonize RBC'lerin FcyR aracılı fagositozunu gerçekleştirerek ekstravasküler hemolize neden olur. MMA kullanılarak fagositoz seviyesini değerlendirerek, in vivo FcγR aracılı sürecin farklı yönleri araştırılabilir. MMA'nın bazı uygulamaları, bir transfüzyon ortamında allo- veya otoantikorların klinik önemini tahmin etmeyi, fagositozu teşvik eden veya inhibe eden aday ilaçların değerlendirilmesini ve FcyR ile etkileşime giren ilaçların veya antikorların aşağı akış sinyalleme etkilerini araştırmak için tahlili floresan mikroskobu veya geleneksel Western immünoblotlama ile birleştirmeyi içerir. Baştan sona tam bir gün süren bu tekniğin zahmetli olması ve memeli kanı ile çalışabilmek için araştırma etiği onayı gerekliliği bazı sınırlılıklar içermektedir. Bununla birlikte, titizlik ve yeterli eğitim ile MMA sonuçları 24 saatlik bir devir süresi içinde elde edilebilir.

Giriş

Monosit tek tabakalı test (MMA), başlangıçta kırmızı kan hücrelerine (RBC'ler) karşı oto- veya alloantikorları olan hastalarda kan transfüzyonu sonuçlarını daha iyi tahmin etmek için geliştirilmiş bir in vitro testtir.1-5. Bu in vitro testi kullanarak Fcγ reseptörü (FcγR) aracılı fagositoza aracılık etmede anti-RBC antikorlarının etkisini değerlendirerek, klinik sonucu in vivo olarak tahmin etmek mümkündür. Gerçekten de, MMA, serolojik olarak uyumsuz kan transfüzyonuna rağmen, antikora bağlı RBC'lerin immün yıkımını önlemek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır5. Çapraz eşleştirme olarak da adlandırılan uyumluluk testi için tipik transfüzyon öncesi prosedür, hastanın kanının ABO ve Rh antijenleri için yazılmasını ve hastada anti-RBC antikorlarının varlığının taranmasını içeren serolojik yöntemleri içerir6. ABO / Rh için eşleşen kan seçilir ve antikorlar varsa, bu antijenlerden kaçınmak için transfüzyon için kanın daha fazla seçilebilmesi için bunları tanımlamak için bir girişimde bulunulur. İdeal bir çapraz eşleşme sonucu, tüm donör kanı serolojik olarak hastanın kanıyla uyumlu olduğunda ortaya çıkar ve bu da transfüzyon sonrası hemoliz riskini azaltır7. Bununla birlikte, bu sistem, tekrarlanan transfüzyon veya hamilelik üzerine alloimmünize olan küçük hasta grubu için yetersiz kalmaktadır. Bu hastalar spesifik RBC antijenlerine karşı alloantikorlar üretirler. Bazıları genel popülasyonda çok yüksek frekanslı antijenlere karşı antikorlar üretir ve bu nedenle8,9'u çapraz eşleştirmek giderek daha zor hale gelir. Karmaşıklığa ek olarak, tüm alloantikorlar klinik olarak anlamlı değildir; başka bir deyişle, bir alloantikorun bir seroloji testi ile tespit edilen eritrositlere bağlanması, antijen pozitif, uyumsuz kan transfüzyonu yapıldığında mutlaka hemoliz ile sonuçlanmaz. MMA başlangıçta bir transfüzyon ortamı1-5'te serolojik olarak uyumsuz kanın potansiyel klinik önemini değerlendirmek için geliştirilmiştir.

Antikora bağlı eritrositlerin ekstravasküler hemolizine mononükleer fagosit sisteminin aracılık ettiği bilindiğinden, tanısal testlerin geliştirilmesinde primer monositler/makrofajlar kullanılmaktadır. Monositlerin, eritrositlerin ve antikorların etkileşimini inceleyen ilk test 1975'te yayınlandı, ancak kullanılan optimal olmayan koşullar sadece rozet oluşumuna (eritrositlerin monositin çevresine bağlanması) yol açtı ve fagositoz gözlenmedi10. Testte önemli modifikasyonlar birkaç grup tarafından yapıldı ve bu da alloantikora bağlı RBC'lerin fagositoz seviyesinin hemoliz1-5'in klinik sonucu ile ilişkilendirilebileceği bir teste yol açtı. Son zamanlarda, otolog hasta numuneleri kullanılarak klinik bir MMA çapraz eşleşmesinin faydasını artırmak için klinik numunelerin optimal saklama koşulları ve tahlil koşullarının daha fazla optimizasyonu incelenmiştir11.

Transfüzyon sonuçlarını tahmin etmede MMA'ya ek olarak üç tanı tekniği daha kullanılmıştır: 51Cr salım testi, rozet testi ve kemilüminesans testi (CLT). 51Cr salınım testinde, hastaya 51Cr etiketli donör RBC enjekte edilir ve etiketli RBC'lerin yarılanma ömrü izlenir ve transfüzyon sonrası sağkalım veya klerens12,13 için öngörücüdür. Bu yöntemde radyoaktif maddeler kullanıldığı için artık nadiren uygulanmaktadır. Rozet testi, monositlerin RBC'lerle karıştırılmasını ve inkübe edilmesini ve rozet oluşum seviyesinin ölçülmesini (fagositoz olmadan) içerir14. İn vivo antikorların klinik önemi, dalak ve / veya karaciğerde bulunan makrofajlar tarafından aktif fagositozu içerir; Bu nedenle, bu yöntem ilgili bir fagositoz okuması sağlamaz. CLT, RBC'nin monosit fagositozu sırasında oksidatif patlamayı izlemek için luminol kullanır, çünkü luminol fagozom15'te oksitlendiğinde mavi floresan verir. Bu yöntem iyidir, ancak nötrofiller tarafından kontaminasyon okumayı karıştırabilir. Mevcut dört yöntemin duyarlılığını, pratikliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için paralel karşılaştırmalar yapılmış ve hem CLT hem de MMA üstün16 olarak derecelendirilmiştir. Bununla birlikte, CLT esas olarak fetüsün ve yenidoğanın (HDFN) hemolitik hastalığının değerlendirilmesinde kullanılmıştır ve testin optimal pH'ı 8.0, fagositozseviyesini tehlikeye atabilir 11.

Tanısal ve klinik faydasına ek olarak, MMA diğer araştırma amaçları için de değiştirilmiştir. Gerçekten de, MMA sadece seroloji ve biyoloji arasındaki tutarsızlıkları ele almak için fonksiyonel bir test olarak hizmet etmekle kalmaz, aynı zamanda intravenöz immünoglobulin (IVIG) tedavisinden sonra hemolizin nedenini retrospektif olarak araştırmak için de kullanılmıştır17. Ayrıca, FcyR aracılı fagositoz18-20'nin kimyasal inhibitörlerinin yapısını-fonksiyonunu incelemek ve FcyR aracılı fagositoz21'in aşağı akış sinyalini incelemek için de kullanılmıştır. Laboratuvarımızda, bir insan MMA'sına ek olarak, birincil fare periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) ve otolog RBC'ler kullanarak bir murin MMA'sı geliştiriyoruz. Gerekçe, in vivo otoimmün hemolitik anemi (AIHA) fare modeli (yayınlanmamış veriler) geliştirmek için bir ara madde olarak FcyR aracılı fagositozu indükleyebilen antikorları taramaktır. Çeşitli modifikasyonlar, fagositozu indükleyen IgG antikorunun ve FcyR etkileşiminin farklı yönlerine odaklanır.

Protokol

araştırma etik kurulu / kurumsal inceleme kurulu tarafından insan örneklerin kullanımı için onay almak ve tüm insan donörlerden imzalı onayını alın. MMA, aynı zamanda hayvan kullanımı etik onaylandıktan sonra, insan deneyinde benzer şekilde fare PBMC'ler kullanılarak gerçekleştirilebilir. MMA aseptik doku kültürü teknikleri uygulanmaktadır.

NOT: Şekil 1'e bakınız.

NOT: Biz yöntem yalnızca bir "kısa vadeli" kültür yöntemi olarak, aseptik teknik korumak için tahlil sırasında bir seviye 2 biyosınırlılık kabine kullanımını tavsiye rağmen, bakteri tahlili kirletmesine için gerçekten yeterli zaman yoktur. Bir seviye 2 biyosınırlılık kabine var, yerine sadece bu deney için bir tane satın almaz, bu nedenle, tahlil açık bankta, bir biyosınırlılık kabine dışında gerçekleştirilebilir. % 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi kullanımı, bununla birlikte, bir seçenek değildir ve kullanılmalıdıren iyi sonuçlar.

1. Periferik Kan Mononükleer Hücre İzolasyon

  1. sağlıklı bir donörün ya da asit sitrat dekstroz (ACD) antikoagülan (sarı-kapaklı) ihtiva eden Vacutainers kullanılarak venipunktür yoluyla bir hastanın insan tam kan alınmasıdır.
    Not: Tam kan bir sonraki aşamada 11 geçmeden önce 36 saat boyunca oda sıcaklığında (18-22 ° C), ACD saklanabilir. Normal olarak, tam kan Ekim 1-2 mL'lik boşaylı tüpler deneyi için yeterlidir.
  2. Tam Kan 1 seyreltilir: 1 h / (% 10 fetal bovin serumu, 20 mM HEPES, ve 0.01 mg / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI-1640), sıcak tam RPMI ortamında h.
  3. Üretici tarafından tavsiye edilen şekilde yoğunluk gradyan santrifüj ile seyreltildi tam kandan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), izole (Malzeme listesine bakınız). yoğunluk gradyanı üzerinde çok yavaş seyreltilmiş kan tabakanın (oda sıcaklığı, 18-22 ° C sıcaklığa getirilmiştir).
    NOT: Mixi miktarını en aza indirindikkatli bir şekilde damla damla kan karışımı katman veya bir pipet kullanarak kan uygun ayrılması için arayüzde ng.
    1. Kan karışımı yavaş yavaş yoğunluk gradyanı yakın pipet ucu yerleştirerek ve çok yavaş tüp tarafı aşağı çalıştırmak için kan karışımı sağlayarak yoğunluk gradyanı üst üzerinde katman izin verin.
    2. 50 mL deney ölçekli tabaka kan (15 ml tüp içinde) yoğunluk gradyanı 3 mL üstünde karışımı ya da katmanın yoğunluğu gradyanı (15 mL üstünde kan karışımı 35 mL ve 10 mL bağlı olarak tüp). Tipik olarak, tam kan, 10 ml bir verici-to-verici varyasyon ile 10.000.000 PBMC'ler verir.
      NOT: Bu yoğunluk gradyanı ile kan karışımının karıştırma olduğu çok önemlidir. Kan karışımı yoğunluk gradiyenti üzerinde katman ve tüm kan yoğunluğu degrade üstünde olana kadar yavaş yavaş artacaktır.
    3. Frensiz 30 dakika boyunca 700 xg'de katmanlı karışımı santrifüj. centrPlazma, ince beyaz tabaka (PBMC ihtiva eden), yoğunluk gradyanlı malzemesi, granülositler ve eritrosit: ifuged karışımı (üstten alta doğru) 5 katmanlara ayrılması gerekir.
    4. Çıkarın ve plazma çoğunluğu atmak ve dikkatli bir Pasteur pipeti ve bir emme ampul kullanarak yeni bir 15-ml tüp içine buffy coat (hücre) içerik alın.
      Not: ince beyaz tabaka tabakasının kaldırılması etkili tabakasının dış çevresinde dairesel bir hareketle gerçekleştirirken tüpün karşısında pipet ucu ile, Pasteur pipeti ile emme uygulanması ile yapılır.
  4. yıkama arasında (tam fren ile), 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj izole edilen PBMC, pH 7.3 fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde üç kez yıkanır. tam RPMI ortamı içinde PBMC topağı sulandırın. pelet boyutuna bağlı olarak, orta 3-7 ml yeterlidir.
  5. tripan mavisi ve hemasitometre kullanarak PBMC güvenin. Sadece tripan mavisi ile boyanan edilmeyen hücreleri saymak. Reconstituttam RPMI ortamı içinde 1.750.000 hücre / ml e PBMC'ler.
  6. 8 bölmeli sürgünün her oyuğuna Tohum 400 uL (700,000 hücre). 37 ° C, tamamen nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe slayt monosit / makrofajlar yapışmasının sağlanması için 1 saat süre ile (% 5 CO2 ile takviye edilmiş).

Yapıştırılır Monositler 2. Ön arıtma

NOT: fagositozu inhibe veya geliştirmek için yollar arıyor Bu adım gereklidir.

  1. Ön muamele çıkar ilaç (lar) ya da bileşim (ler) ile birlikte monosit yapıştırılır. tam RPMI ortamı kullanılarak istenen konsantrasyona ilaç (lar) veya diğer test malzemesi sulandırın.
    Not: Örneğin, IVIG, 200 ug / mL, genellikle insan monositlerini kullanıldığında fagositoz bir% 95-100 inhibisyonunu elde etmek için kullanılır.
  2. Aspire (adım 1.6) sonra 1 saatlik inkübasyondan sonra, 8 bölmeli slayt herhangi yıkanarak yapışmayan hücreler ihtiva eden üst sıvıyı atmak ve. 400 ile değiştirinBir ilaç veya başka bir tedavi uL 37 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe edilir.
    1. aspirasyon ve 8 bölmeli slayt çözümler değiştirirken, zayıf yapışmış hücreler kaldırın yok ki sıvıların akışını kontrol etmek emin olun. Ayrıca, bir seferde sadece 2-3 boş kuyular ile çalışmak ve kuyu kurumasını önlemek.
      Not: Genellikle, her bir tedavi, teknik üç kez gerçekleştirilir.

R 3. Opsonizasyon 2 R 2 Kırmızı Kan Hücreleri

Not: Burada kullanılan R2 R2 kan toplama merkezinde (Kanada Kan Hizmetleri) elde edilmiştir, ancak aynı zamanda ticari olarak temin edilebilir. Opsonize R2 R2 eritrosit FcyR aracılı fagositozu için bir pozitif kontrol olarak kullanılır. Naif R2 R2 1 aya kadar 4 ° C 'de Alsever çözeltisi (uzatmak için, raf ömrü) saklanmalıdır. Alsever çözeltisi içinde yapılan ve 0.8 oluşmaktadırAğ / hac% trisodyum sitrat (dihidrat), ağ% 1.9 / hac dekstroz, ağ% 0.42 / hac sodyum klorür ve% 0.05 w / h sitrik asit (monohidrat) w. R2 eşittir R ise 2 hücreleri, R1 R2, 1 R1, R1 R, ya da R 2R, kullanılabilir diğer Rh fenotiplenir hücreleri, mevcut değildir.

  1. Yıkama R2 R2 (CDE / CDE) PBS içinde kırmızı kan hücreleri, her biri 5 dakika 350 x g'de santrifüj ile üç kez olmak üzere toplam.
    NOT: Gerekli eritrosit miktarı deneysel büyüklüğüne bağlıdır ve arka hesaplanmış olabilir. Eritrositler bağlı liziz veya yüzer çıkarılması sırasında, her yıkama sırasında kaybolur yana zaman, eritrosit aşırı miktarda yıkayın. Örneğin, teknik üç kez yapılan 5 tedavileri ve 2 kontrolleri, tüm bir deneyde, 21 kuyu toplam vardır. 400 uL / ​​oyuk, 1.25% eritrosit karışımı ile 21 kuyu paketlenmiş 105 uL, RBC gerekli opsonize gösterir. 200 RBC ul başlangıçta yıkanmalıdır ve 150 & #181 L fagositoz adım için eritrosit yeterli bir miktarda olduğundan emin olmak için opsonize edilmelidir.
  2. 1 ile yıkandı, R2 R2 pelet opsonize: insan serumundan 1 h / h poliklonal anti-D antikorları ve aralıklı karıştırma ile, 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir.
    Not: poliklonal anti-D antikorları mevcut değilse, ticari olarak temin edilebilir monoklonal anti-D antikoru, ya da kan bankaları ve nakli yoluyla elde edilebilir, normal olarak Rh bağışıklık profilaksisi için kullanılan anti-D, kullanmak mümkündür Hizmetler. tahlil kurarken, ve un-titre poliklonal antikorların çok geçiş ne zaman ya da bir monoklonal antikor geçiş Optimizasyon test, başında yapılmalıdır. Bu bir antiglobulin testi 3+ ile 4 + ve sayılan 100 monositler başına 70-90 arasında fagosite RBCs bir fagositoz sonucu (IAT) sonuç için gerekli optimal konsantrasyonunu veya anti-D hacmini tespit etmektir.
  3. opsonize yıkayınD R2 R2 her biri 5 dakika 350 x g'de santrifüj kullanılarak PBS içinde üç kez olmak üzere toplam.
    Not: R 2 R2 başarılı opsonizasyon dolaylı IAT'yi gerçekleştirerek kontrol edilebilir. Kısaca, sekonder poliklonal anti-insan antikorları, RBC yüzeylerde primer opsonizasyon antikorların bağlandığı ilave edilir ve yükseltilmiş sinyal hemaglütinasyon şeklinde gözlenebilir. Ayrıntılı bir üretici protokolü ek malzemeler dosyasında bulunabilir.
  4. % 1.25 hacim / hacim tam RPMI ortamı kullanılarak yıkanarak R2 R2 pelet sulandırın.
    Not: Aşırı opsonize edilmiş R2 R2, bir haftaya kadar 4 ° C 'de Alsever çözeltisi içindeki saklanabilir.

4. Fc reseptör aracılı fagositoz

  1. 8 bölmeli slayt ilaç veya orta süpernatan aspire ve% 1.25 hacim / hacim R2 R2 kanşımı 400 uL ekleyin. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. kıçtaer inkübasyon 2 saat, üreticinin adaptörler kullanarak odaları kaldırın. Bir kağıt havlu üzerine aşırı R2 R 2 kapalı hafifçe sürün. slayt kurumasına olmadığından emin olun.
  3. PBS ile 100 ml beher doldurun. Batmak ve yavaş yavaş un-fagosite R2 R2 çoğunluğu kaldırmak için ileri ve geri (30-40 vuruş civarında) slayt hareket ettirerek slayt yıkayın.
  4. PBS slaytı çıkarın. Bir kağıt havlu ya da doku ve kullanarak aşırı PBS kapalı ıslatın slayt hava-kurutun.
  5. 45 sn için% 100 metanol hava ile kurutulmuş slayt düzeltildi. Ardından, sabit slayt hava kurutun.
    NOT: Slaytlar gibi Grünwald-Giemsa 21 veya Wright-Giemsa 22 olarak, aşağı boyanması için daha uyumlu başka bir yöntemi kullanarak tespit edilebilir.
  6. Bir Elvanol montaj orta (veya başka bir piyasada mevcut montaj orta) ev yapımı-ve eklemek lamelleri kullanarak slayt monte edin.
    NOT: Elvanol montaj orta / h po ağırlık% 15 oluşurPBS lyvinyl alkol reçinesi ve% 30 hac / hac gliserin. Bütün reçine eridikten kadar karışım ısıtıldı ve gliserin berrak bir karışım. Bu, diğer ticari olarak temin edilebilen montaj ortamı ile ikame edilmiş olabilir.
  7. montaj ölçümü gecede önce kurumasını bekleyin.

Fagositoz 5. Niceleme

  1. Bir faz-kontrast mikroskop ve 40X objektif lens kullanarak el ile en az 200 monositler ve bu monositler içinde fagosite R2 R2 sayısının sayılmasıyla fagositik etkinlik miktarını ölçmek. Aynı anda monosit sayısını ve fagosite R2 R2 sayısını ölçmek için her el bir sayaç var.
  2. Monositler sayısına göre fagosite R2 R2 sayısına bölünmesiyle ve 100 Express ortalama (SEM) ortalama ± standart sapma olarak veri (ortalama fagositik indeks) ile çarparak ortalama fagositik indeksi edinin.

Sonuçlar

Şekil 1, yukarıda belirtilen prosedür çok önemli adımı takip ederek, MMA tekrarlanabilir gerçekleştirilebilir. IVIG, Şekil 2'de fagositoz engellenmesi için bir örnek olarak kullanılmıştır. IVIG, böylece fagositoz alt sonucu inhibe bağlanan ve Fc reseptörleri bloke bilinmektedir. Kullanılan IVIG miktarının titre edilmesiyle, doza bağlı bir inhibisyon hangi / ml Tüm (Şekil 2A) olarak inhibe etmedi / mL 0.5 ug altında% 100 inhibisyon yakındır ve konsantrasyonlarına yol 200 ug üzerindeki konsantrasyonlarda, görülmektedir. Fagositik endeksler dönüştürülmüş ve% 0 inhibisyon / ml belirlenebilir 3 ug bir IC50 (Şekil 2B) olan bir inhibisyon eğrisi olarak R2 R2 pozitif kontrol normalize edildiğinde.

Sürekli tahlili gerçekleştirmek ek olarak quantificaDeneyin tion bazen zor olabilir. Şekil 3, çeşitli MMA slaytların faz-kontrast mikroskobu görüntüleri topluluğudur. Mikroskopi tecrübesi ile, biri kirletici RBC (Şekil 3B), ya da bir fagosite RBC (Şekil 3B) bir vakuol bir monosit ayırt edebilirsiniz. Hücreler ve / veya kalıntı yoğun kümeleri miktar (Şekil 3E ve F) sırasında kaçınılmalıdır. Ayrıca, bir kaçının aşırı opsonizasyon monosit iç overcrowds ve doğru miktarının (Şekil 3C) müdahale artan fagositoz yol açacak R2 R 2 RBC.

figure-results-1
MMA 1. şematik diyagramı Şekil. MMA önemli adımlardan bir adım adım tasviri: tam kandan PBMC izole yapıştırılmış monocyt beslemeopsonize R2 R2, ve oda slaytlar yıkama ile es. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. İntravenöz IgG (IVIG) MMA kullanılarak in vitro fagositozu inhibe eder. IVIG fagositosisi bastırmak bilinmektedir ve insan MMA bir inhibisyon kontrolü olarak kullanılmıştır. Muamele edilmemiş R2 R2 kontrolle kıyaslandığında IVIG (A) titrasyon fagositoz doza bağlı olarak önlenmesi ile sonuçlandı. Sonuçlar ortalama n = 3 deney (SEM) ortalama ± standart sapma göstermektedir. Istatistiksel analiz Student t-testi kullanılarak yapılmıştır: ** p≤0.01 ve *** p≤0.001. (B) bir IC50 O ile IVIG önleme eğrisiF 3 ug / ml (kesikli çizgi). Sonuçlar işlenmemiş R2 R2 (% 0 inhibisyon) normalize verileri gösterir; n = 3 deney ortalama ± SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
40X büyütme altında örnek slaytlar Şekil 3. Faz-kontrast mikroskobu görüntüleri. (A) monositler arka plan (beyaz oklar) çok az kirletici, un-fagosite R2 R2 ile, ortalama (ayırt edici bir hale ışıltı ile siyah oklar) 1-2 R 2 R 2 fagosite ettiği mükemmel slayt. Fagosite R2 R2 için yanlış olabilir bu slaytta gösterildiği gibi (B), monositler bazen genişlemiş olması vakuoller (beyaz oklar). (C </ strong>) fazla 4-5 R 2 monosit başına R2 (siyah oklar fagosite, opsonize aşırı R2 R2 olmuştur zaman) R2 2 monosit ve farklı hücre içinde kalabalık beri doğru, zor sayma hale sınırları ayırt edilemez. (D) slayt yetersiz yıkama yapıştırılır eritrosit için yanlış olabilir bol R2 R2 kontaminasyon (beyaz oklar) yol açar. (E) Bazen, monositler ve kirletici eritrositler kümeleri oluşturabilir. Kümeler de kaçınılmalıdır bakteri kontaminasyonu, gösterir. (F) monositler miktarının esnasında önüne geçilmesi gerekmektedir daha büyük agregalar oluşturabilirler. görüntülemek için alanları rasgele seçim kullanarak, panel A MMA düzgün yapılmış ise genellikle gözlenmektedir budur. Ölçek çubuğu 20 mm. Lütfen buraya tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Tartışma

MMA doku kültürü ve mikroskopi hem de uzmanlık gerektiren zahmetli bir tekniktir. başarı sağlamak için birkaç kritik adımlar vardır: monosit tek tabaka 1) nesil; RBCs 2) opsonizasyon, ve 3) manuel miktar. Monosit tek tabakalı odası slayt çok güçlü bir şekilde bağlı değildir, bu yüzden, fizyolojik pH tahlilinde 11 boyunca muhafaza edilmesi ve PBMC yeterli sayıda tohumlanır edilmelidir. yapıştırılır hücreleri bozacağı Dinç pipetleme, kaçınılmalıdır. Bir yaklaşım her zaman kaldırmak ve odanın aynı köşesinden çözümler ekleyebilir ve hareket yavaş ve istikrarlı olmasını sağlamak için olmaktır. Benzer şekilde, fazla RBC çıkarmak için son yıkama aşaması sırasında, hareket yavaş ve sabit olmalıdır. hala un-fagosite eritrosit çoğunluğunu kaldırılırken Bu tek tabaka minimal rahatsızlık sağlar. Yetersiz yıkama manuel nereye yapar kirlenmesine eritrosit yüksek arka plan yol açacaktırntification zor. İkinci olarak, R2 R2 eritrosit yeterli fagositoz kontrolü için 80-120 arasında bir ortalama fagositik endeksi elde etmek için opsonize gerekmektedir. Bu istenen fagositik aralığı sayma kolaylığı arasında bir denge ve istatistiksel analiz için fagositoz yeterli miktarda muhafaza (örneğin, 5'ten fazla olan monositler eritrositler doğru ölçmek zordur fagosite). opsonızasyonu derecesi bir IAT tarafından teyit edilebilir ve 4+ için 3+ arasında bir okuma gereklidir. 2 eritrosit var yüzer koyu kırmızı olduğunda, yıkama sırasında aşırı liziz, ya da atılmalıdır R 2R fagositoz önemli bir azalma nedeniyle depolama hücrelerinin yaşlanmaya deneylerde zaman. laboratuar personeli arasındaki ve deneyler arasındaki sayıları karşılaştırarak özellikle Son olarak, mikroskop kullanarak manuel miktar yanıltıcı olabilir. her bir aynı alan inceleyerek, ya da sadece daha fazla hücre sayılarak, Daha tutarlı bir sayısı elde edilebilir. deneyimli bir teknisyen ve eğitim slaytları belirli bir dizi kullanımı ile yan-yana eğitim tavsiye edilir.

MMA önemli bir eleştiri manuel miktar adım öznellik olduğunu. Ancak, yeterli eğitim, tutarlılık farklı sayaçlar üzerinden elde edilebilir. Başka bir sınırlama insan örnekleri ile ilgili veri varyasyon kaynağıdır 2 R 2 yüzey antijeni ifade seviyeleri, monosit fagositik yeteneklerine ve Ar içsel donör için-donör farklılıklarıdır.

Diğer alternatif teknikler FcyR aracılı fagositozu incelenmesi için kullanılabilir. Ticari kitler çoğunluğu fagositoz izlemek için flüoresan çıkış kullanır (örneğin, bioparticles, pH'a duyarlı floresan proteini veya IgG-etiketli floresan lateks boncuk). Floresan çıkış kullanımı daha objektif ölçümü teklif yok, ama bir de con gerekiyorbir flüoresan mikroskop ya da bir akış sitometresinde yanı sıra ticari olarak temin edilebilen kitler üzerine takip eden bağımlı kullanımı ile ortaya çıkan durumu, maliyet ve eğitim sider.

Son olarak, bu deney, bir araştırma söz bağlı olarak değiştirilebilir. Fagositoz ilaç engellenmesini test ederken, örneğin, monositler ön tedavi edilebilir ya da ilaç ve opsonize edilmiş RBCs (yani, bir rekabet deneyi) her ikisi ile ko-inkübe edilmiştir. farklı alt kimerik antikorlar veya yeniden birleştirici yapıları antikorların aşağı doğru sinyal de test edilebilir. Evrensel bir antijen boş kanın 24 gelişiminde son buluşlarla, MMA fagositoz tetikleyen bir alçaltılmış etkinliği gerçekten var olup olmadığını değerlendirmek için çeşitli antikorlar ile bu antijen boş RBCs ilk ekranlarında yararlanılabilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Kanada Kan Hizmetleri'ne T.N.T.'ye Lisansüstü Burs Programı Ödülü için teşekkür eder. Bu araştırma, federal hükümet (Health Canada) ve eyalet ve bölge sağlık bakanlıkları tarafından finanse edilen Kanada Kan Hizmetleri İnovasyon Merkezi'nden mali destek aldı. Buradaki görüşler Kanada'daki federal, eyalet veya bölgesel hükümetlerin görüşlerini yansıtmamaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asit sitrat dekstroz (ACD) vakutainerleriBDREF364606
RPMI 1640SigmaR8758
HEPESBioshopHEP003.100
Fetal sığır serumuMulticell 080150
GentamicinGibco15710-64
Ficoll-Paque PLUS GE17-1440-03https://www.gelifesciences.com/
Fosfat tamponlu salinSigmaD8537
8 odacıklı slaytlarLab-Tek-ll154534
R2< / sub>R2< / sub> (cDE / cDE) kırmızı kan hücreleriKanada Kan HizmetleriTicari olarak temin edilebilir (örn.< / em>, http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
İnsan serumundan poliklonal anti-DGamma BiologicsDIN 02247724Ticari olarak temin edilebilen monoklonal anti-D veya Rh immün globulin ile ikame edilebilir
%100 metanolCaledon6700-1-42
Polivinil alkol reçinesiSigmaP8136Piyasada bulunan UltraPure
gliserinInvitrogen15514-011
Kapak fişleriVWR48366 067
Novaclone anti-IgGImmucorgamma5461023IAT için isteğe bağlı (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)
ile ikame edilebilir

Kaynaklar

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , Epub ahead of print (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A. Jr, et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fc Reseptörü FagositozuAntikor Aracılı FagositozPeriferik Kan Mononükleer HücreleriEritrosit OpsonizasyonuFaz Kontrast MikroskopisiFloresan MikroskopisiWestern İmmunoblotingİntravenöz İmmünoglobulin İnhibisyonuTransfüzyon Tıbbı Analizi
Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.