Biz kimyasal elementler mevcut içinde in situ insan hücreleri hem de onların vitro miktar tespiti için açıklayınız. Yöntem herhangi bir hücre tipi için uygundur ve Tek Kişilik hücrelerde vitro metal oksit nano tanecikleri pozlama takip kantitatif kimyasal analizler için özellikle kullanışlıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Mikro-analitik teknikler üzerinde kimyasal element görüntüleme dayalı Yerelleştirme ve hücresel düzeyde kimyasal kompozisyon miktar etkinleştirin. Yaşayan sistemler karakterizasyonu için yeni olanaklar sunmak ve algılama, Yerelleştirme ve metal oksit nano tanecikleri hem biyolojik örnekler ve çevre varlığı miktarının için özellikle uygundur. Gerçekten de, tüm bu teknikler (i) hassasiyeti (1 en çok kuru kütlesinin 10 µg.g-1 ), (ii) ölçüm aralığı Uzaysal çözünürlük ve (iii) çoklu öğe algılama açısından ilgili gereksinimlerini karşılamak. Bu özellikleri göz önüne alındığında, microbeam kimyasal element görüntüleme güçlü rutin görüntüleme teknikleri gibi tamamlayıcı olabilir optik ve floresan mikroskopisi. Bu iletişim kuralı, kültürlü hücreleri (U2OS) için titanyum dioksit nano tanecikleri maruz üzerinde nükleer microprobe çözümlemesi açıklar. Hücreleri büyümek zorundadır ve doğrudan bir özel olarak tasarlanmış örnek tutucu üzerinde optik mikroskop ve nükleer microprobe analiz aşamalarında maruz. Dalma-donma örnekleri kriyojenik fiksasyonu hücresel organizasyon ve kimyasal element dağıtım korur. (X-ışını emisyonu tarama iletim iyon mikroskobu, Rutherford spektrometresi gelmekte ve parçacık indüklenen) eşzamanlı nükleer microprobe analiz örnek üzerinde gerçekleştirilen hücresel yoğunluk, yerel dağıtım kılavuzu kimyasal elementlerin yanı sıra nano tanecikleri hücresel içeriği. Biyoloji, özellikle bağlamında ortaya çıkan Nanotoxicology ve kendisi için bizim anlama nano tanecikleri ve biyolojik örnekler arasındaki etkileşimler derinleştirdi gerekir Nanomedicine içinde böyle analitik araçlar için büyüyen bir ihtiyaç vardır. Özellikle, nükleer microprobe analysis etiketli nano tanecikleri gerektirmez nanopartikül miktar ölçülebilir yüzey durumlarına bağımsız olarak bir hücre nüfus tek hücre düzeyine şunlardır.
Giriş
Hücresel homeostazı alımını kontrol, asimilasyon ve hücre içi yerelleştirme farklı iz elementler (iyonları, metaller, eksojen inorganik bileşikler) tarafından belirlenir. Bu bileşenleri sık sık izleri şeklinde vardır ama yine de sistem fizyolojisi önemli bir etkiye sahip. Böylece, normal ve patolojik/stresli durumlarda hücre Biyokimya hücresel metabolik mekanizmalar genel bir anlayış doğru bir anahtar adım çalışmadır. Bu nedenle, hücre içi kimyasal zenginliği, yapısal organizasyonu ve onların ilgili metabolik fonksiyonlar soruşturma etkinleştirme görüntüleme ve analitik yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde gerekli olur. Situ nicel parçası belirli bir örnek ge....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. örnek sahibi hazırlık
-
Örnek tutucu tasarımı ve hazırlık
- Bir örnek sahibi bir 5 x 5 mm kare 1 mm kalınlığında PEEK çerçevesindeki Delme tarafından üretmekteyiz.
- Etanol %70 (v/v) durulama tarafından temiz ve steril levha kullanıma hazır kadar tutun.
Dikkat edin. Hücre kültürü ve hücre işleme için uygun bir örnek sahibi gereklidir. Bu hücre kültürü çalışmalarının, vitro gözlemleri ile optik mikroskobu ve nükleer microprobe çözümleme ve görüntüleme için tasarlanmış olması gerekir. Bu tutucu bir göz çerçeve13yapılır.
- Örnek sahibi hazırlık
- Formvar çözüm For....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hücre kültürü ve fluorescently etiketli TiO Floresans görüntüleme 2 NPs
Hücre kültürü, hücre işleme gibi multimodal analiz için uyarlanmış bir örnek sahibi dizayn ettik. Özellikle, sahibi de nükleer microprobe çözümleme ve görüntüleme rutin optik mikroskobu izin önemliydi. Bu örnek sahibi bir göz karede yatırılır 2-µm kalınlığında polikarbonat folyo temel alır. Hücrel.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz ne hücre altı düzeyinde özellikle diğer görüntüleme teknikleri ile mümkündür ötesinde yararlı bilgiler sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Görüntüleme yeteneğini yanı sıra, nükleer microprobe analiz de miktar biyolojik örnek kompozisyon girerek kimyasal elementlerin olanakları sunuyor. Mevcut çalışmada, biz insan hücre popülasyonlarının okudu ve aşağı seçilen bölge TiO2 için NPs maruz tek bir hücre temel ilgi analiz odaklı. Diğer teknikleri ile onun birlikte morfolojik hücresel görüntüleme ve hassas Nicel.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Serge Borderes yönetmenlik ve video düzenleme için teşekkür ederiz. Fransız Ulusal araştırma ajansı araştırma programı TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01) destekler. CNRS ve entegrasyon etkinlik olarak Avrupa Topluluğu "destek genel ve endüstriyel araştırma kullanarak iyon ışın teknolojisi (ruhu)" EC sözleşme n ° 227012 altında sağlanan. Bu eser EC Sözleşme No 317169 altında Marie Curie eylemleri - bir "entegre etkinlik destekleyen yüksek lisans araştırma ile staj in sanayi ve eğitim Excellence" (SPRITE, D1.3) olarak ilk eğitim ağları (ITN) tarafından desteklenmiştir. C'NANO Grand Sud Ouest ve bölge Aquitaine araştırma programı zehir-NANO (n ° 20111201003) ve ar....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücre kültürü< / güçlü > | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARTLARI | ATCC HTB-96 | |
| Orta MCCOY 5A, L-Glutamin | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penisilin / Streptomisin ve nbsp; | ThermoFisher Bilimsel | 11548876 | |
| L-Glutamin 200 mM, 100 mL | İnvitrojen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Tripsin-EDTA %0.25 (h/h) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Kırmızı | Lipokaliks | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plazmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Dikkatli |
| NPs hazırlama ile tutun | |||
| TiO2 P25 AEROKSIT | Degussa/Evonik | ||
| Tetrametilrodamin izotiyosiyanat (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | NP'lerin yüzey modifikasyonu |
| Numune hazırlama | |||
| Polikarbonat folyo | Goodfellow | CT301020 | |
| Polieter Eter Keton desteği (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Etanol, ACS mutlak | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Klorform, Susuz, %99 | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Dikkat: toksik |
| Formvar 100 g | Ağar Bilimsel | AGR1201 | Zararlıdır. 10 & mikro konsantrasyonda kullanın; mL başına g kloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Numune fiksasyonu | |||
| Toz, %95 Paraformaldehit | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Dikkat toksik. PBS PBS'de %4'lük bir çözelti olarak kullanın |
| PBS (pH 7.4, Ca2+ ve Mg2+ olmadan) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reaktifi | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Zararlı |
| Numune kriyofiksasyonu | |||
| Sıvı nitrojenli | hava sıvıları sante | Zararlı | |
| Metilbütan > =% 99 | SIGMA-ALDRICH | & nbsp; M32631-1L | Dikkat toksik |
| Alüminyum transfer plakası | Ev yapımı | ||
| Damıtılmış ve deiyonize su | Ev yapımı | Barnstead Smart2Pure sistemi kullanılarak laboratuvarda üretilmiştir | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Bilimsel | 50129870 | |
| Biyogüvenlik tezgahı, sınıf II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 otomatik hücre sayacı | Biorad | 145-0102SP | |
| Sayma slaytları 2 kuyu | Biorad | 1450016 | |
| PIPS dedektörü, 25 mm2, 12 keV enerji çözünürlüğü @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| Yüksek çözünürlüklü Si (Li) katı hal dedektörü, 145-eVenergy çözünürlüğü, @Mn-K ve alfa; | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley tipi ikincil elektron dedektörü (SED) | Orsay Fizik | 1-SED | |
| XRF Kalibrasyon Standardı NaCl olarak sodyum veya Klor | Mikromadde | 34381 | |
| XRF Kalibrasyon Standardı MgF2 olarak Magnezyum | Mikromadde 34382 | ||
| XRF Kalibrasyon Standardı Al metal olarak Alüminyum | Mikromadde | 34383 | |
| XRF Kalibrasyon Standardı SiO | Mikromadde | 34384 | |
| XRF Kalibrasyon Standardı CuSx Micromatter olarak | Kükürt 34385 | ||
| XRF Kalibrasyon Standardı CaF2 Mikromadde | olarak Kalsiyum 34387 | ||
| XRF Kalibrasyon Standardı Ti metal olarak Titanyum | Micromatter | 34388 | |
| XRF Kalibrasyon Standardı Fe metal olarak | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Malzemeler | 11743619 | |
| 3MM mikroprob | Biyoblok bilimsel | 220-05 | |
| Vakumlu | Liyofilizatör Elexience | EK3147 | |
| Optik mikroskop Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorlu sahne xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 amaç | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objektif | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filtre seti 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filtre seti 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filtre seti 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Kimyasal çeker ocak | Erlab | Captair SD321 | |
| Parçacık hızlandırıcı | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ yazılımı | Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA yazılımı | Max-Planck-Institut fü r Plasmaphysik, Almanya | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix yazılımı | Guelph üniversitesi, Kanada | GUPIXWIN 2.2.4 |
Kaynaklar
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
