Yöntem makalesi

Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar

DOI:

10.3791/55041

⸱

3 Şubat 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), Université de Bordeaux, 2Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), CNRS, 3Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), CNRS, 4Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), Université de Bordeaux

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kimyasal elementler mevcut içinde in situ insan hücreleri hem de onların vitro miktar tespiti için açıklayınız. Yöntem herhangi bir hücre tipi için uygundur ve Tek Kişilik hücrelerde vitro metal oksit nano tanecikleri pozlama takip kantitatif kimyasal analizler için özellikle kullanışlıdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro-analitik teknikler üzerinde kimyasal element görüntüleme dayalı Yerelleştirme ve hücresel düzeyde kimyasal kompozisyon miktar etkinleştirin. Yaşayan sistemler karakterizasyonu için yeni olanaklar sunmak ve algılama, Yerelleştirme ve metal oksit nano tanecikleri hem biyolojik örnekler ve çevre varlığı miktarının için özellikle uygundur. Gerçekten de, tüm bu teknikler (i) hassasiyeti (1 en çok kuru kütlesinin 10 µg.g-1 ), (ii) ölçüm aralığı Uzaysal çözünürlük ve (iii) çoklu öğe algılama açısından ilgili gereksinimlerini karşılamak. Bu özellikleri göz önüne alındığında, microbeam kimyasal element görüntüleme güçlü rutin görüntüleme teknikleri gibi tamamlayıcı olabilir optik ve floresan mikroskopisi. Bu iletişim kuralı, kültürlü hücreleri (U2OS) için titanyum dioksit nano tanecikleri maruz üzerinde nükleer microprobe çözümlemesi açıklar. Hücreleri büyümek zorundadır ve doğrudan bir özel olarak tasarlanmış örnek tutucu üzerinde optik mikroskop ve nükleer microprobe analiz aşamalarında maruz. Dalma-donma örnekleri kriyojenik fiksasyonu hücresel organizasyon ve kimyasal element dağıtım korur. (X-ışını emisyonu tarama iletim iyon mikroskobu, Rutherford spektrometresi gelmekte ve parçacık indüklenen) eşzamanlı nükleer microprobe analiz örnek üzerinde gerçekleştirilen hücresel yoğunluk, yerel dağıtım kılavuzu kimyasal elementlerin yanı sıra nano tanecikleri hücresel içeriği. Biyoloji, özellikle bağlamında ortaya çıkan Nanotoxicology ve kendisi için bizim anlama nano tanecikleri ve biyolojik örnekler arasındaki etkileşimler derinleştirdi gerekir Nanomedicine içinde böyle analitik araçlar için büyüyen bir ihtiyaç vardır. Özellikle, nükleer microprobe analysis etiketli nano tanecikleri gerektirmez nanopartikül miktar ölçülebilir yüzey durumlarına bağımsız olarak bir hücre nüfus tek hücre düzeyine şunlardır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel homeostazı alımını kontrol, asimilasyon ve hücre içi yerelleştirme farklı iz elementler (iyonları, metaller, eksojen inorganik bileşikler) tarafından belirlenir. Bu bileşenleri sık sık izleri şeklinde vardır ama yine de sistem fizyolojisi önemli bir etkiye sahip. Böylece, normal ve patolojik/stresli durumlarda hücre Biyokimya hücresel metabolik mekanizmalar genel bir anlayış doğru bir anahtar adım çalışmadır. Bu nedenle, hücre içi kimyasal zenginliği, yapısal organizasyonu ve onların ilgili metabolik fonksiyonlar soruşturma etkinleştirme görüntüleme ve analitik yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde gerekli olur. Situ nicel parçası belirli bir örnek genel olarak kimyasal doğası ile ilgili bilgiler sağlamak mümkün çok az yöntemlerdir. Toplu form örnekleri analiz yöntemleri dışında in situ analizleri biyolojik örnekleri kendi integrality böylece (eser elementler ve iyonlarının) kurucu kimyasal koruma kitle ve yapısal bilgileri kaybetmeden düşünün ve proteinler. Nanobilimler geliştirmeye devam ederken, Ayrıca, Gelişmiş görüntüleme ve hücresel ölçekte çevre izlemek için analitik yöntem gözlemlemek ve nano-nesne davranışları ve etkileşimleri ölçmek için gerekli olacaktır. 1

Nano tanecikleri (NPs) en az bir yüz boyut aralığı 1 ile 100 nm sergilenmesi nesneler olarak tanımlandı. 2 belirli fizikokimyasal özellikleri nedeniyle, NPs, yaygın olarak sektöründe kullanılır. NPs biyo-uygulamaları ve nanomedicine istihdam edilmektedir. 3 , 4 NPs rağmen çok sayıda fizikokimyasal özellikleri ürettikleri bazı risklerin insan sağlığı ve çevre üzerinde olumsuz etkileri. Bu riskler uzun süreli ve tekrarlayan Etkilenmeler çeşitli konsantrasyon düzeylerde tarafından indüklenen ve bu değil henüz açıkça kurulmuştur. 5 , 6 , 7 , 8 özellikle, NPs kaderi hücreleri ve ilişkili hücresel yanıt içinde olan, bugüne kadar tam olarak açıklanan. Bu kısmen algılama izin yöntemleri kıtlığı ve miktar tek bir hücrede içselleştirilmiş NPS'nin kaynaklanmaktadır. 9

Nano tanecikleri hücresel doz olan microscopies, kütle spektrometresi (MS), tahmin etmek için kullanılan klasik analitik araçlar İndüktif eşleşmiş plazma MS (ICP-MS)10,11 ve sıvı Kromatografi MS (LC-MS), ama onlar sadece sağlamak yararlı bilgiler makroskobik ölçekte. Hiçbiri-in onları hücre altı NPs içerik ne de ayırma yöntemlerini kullanmaya gerek kalmadan NPs dağıtımını hassas bir değerlendirme sağlar. Doz-yanıt sistematik bir değerlendirme böylece atomik spektroskopi nükleer microprobe analiz12,13, sinkrotron x-ışını Floresans mikroskobu14 gibi temel yöntemleri aksine bu yöntemler ile imkansız ve ikincil iyon kütle spektrometresi (SIMS). 15 , 16 bu yöntemler özellikle ilginç Floresans mikroskobu kullanılarak yapılan gözlemler tamamlayıcı olarak, özellikle NPs floresan molekülleri ile Etiketlenmiş olamaz ve böylece yerel durumlarında incelenmektedir. NPs ile fluorophores, hatta aşılı bir dereceye kadar (i) miktar başına NP etiketleme düzeyi bilinmiyor ve (ii) NP yüzey kimyasal değişiklik hücresel dağılımı değiştirebilir çünkü zor kalır.

Bu makalede, morfoloji ve Majör, minör, biyolojik örneklerin elemental kompozisyon görüntüleme nişan nükleer microprobe teknikleri bir arada dayalı bir yöntem odaklanmak ve konsantrasyonları iz.

Nükleer microprobe analiz eser kimyasal elementler biyolojik dokularda ölçümü için özellikle uygun olmaktadır. Işın yanal çözünürlük (0.3-1 µm) ve kimyasal element algılama hassasiyeti (1-10 µg.g-1 kuru kitle) hücresel düzeyde çalışmalar için uygundur. Nükleer microprobe teknikleri (MeV enerjilerde genellikle çalışan) iyon demeti atomlar örnek mevcut etkileşim sonra yayılan parçacıklar algılama (fotonlar, elektronlar, iyonlar) temel alır. Hücrelerde meydana gelen etkileşimleri çoğu esas olarak: 1) uyarma/iyonlaşma atomların atom temel durumlarına geri; döndükten sonra bir foton emisyon tarafından takip ve 2) kendi enerji ve yönünü değiştirmek için önde gelen parçacıkların Difüzyon. Verilmiş parçacık enerji Main'i kimlik atomların etkileşimde yer alan ilgili ölçüm birimi. Eşleme öğelerinin gerçekleştirmek için iyon microbeam art arda örnek yüzey üzerinde kez yaklaşık 100 100 µm2 birkaç hücreyi içeren bir alanın üzerinde tarama yapılır. Verilmiş parçacıkları tespit edilir ve onların enerji her ışın pozisyon için kaydedilir. Partikül ışını konumuna göre sıralanması, böylece bu tür parçacıklar emisyon için sorumlu yapısı tanımlama veri tedavi amacı olduğunu. Burada, tam olarak Floresans mikroskobu ve nükleer microprobe analiz algılamak için yanı sıra yaşam ile NP etkileşimleri sonuçlarını araştırmak için hücresel ve alt hücresel ölçeklerde eksojen NPs ölçmek için temel alan bir yaklaşımı açıklamak sistemleri. Özellikle bu yöntem in situ miktar titanyum dioksit nano tanecikleri (TiO2 NPs) toplamları hücre altı düzeyinde açısından sunduğu fırsatlar üzerinde odaklanmak zorundadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. örnek sahibi hazırlık

  1. Örnek tutucu tasarımı ve hazırlık
    1. Bir örnek sahibi bir 5 x 5 mm kare 1 mm kalınlığında PEEK çerçevesindeki Delme tarafından üretmekteyiz.
    2. Etanol %70 (v/v) durulama tarafından temiz ve steril levha kullanıma hazır kadar tutun.
      Dikkat edin. Hücre kültürü ve hücre işleme için uygun bir örnek sahibi gereklidir. Bu hücre kültürü çalışmalarının, vitro gözlemleri ile optik mikroskobu ve nükleer microprobe çözümleme ve görüntüleme için tasarlanmış olması gerekir. Bu tutucu bir göz çerçeve13yapılır.
  2. Örnek sahibi hazırlık
    1. Formvar çözüm Formvar tozu 100 ml kloroform 1 mg çözülerek hazırlayın.
    2. Böylece hiçbir kat sunar polikarbonat folyo metalik bir karede germek.
    3. Steril bir ipucu Formvar çözüm örnek sahibi deliğin etrafında yaymak için kullanın.
    4. İnce gergin polikarbonat folyo (5 x 5 mm kare) üzerine tutkal ile örnek sahibi yere bırak.
    5. Bir örnek sahibi her çoğaltma için hazırlamak için önceki sıra yineleyin.
      Dikkat edin. Polikarbonat (PC) Biyouyumlu, yeterince kalın ve dayanıklı farklı protokolleri ve analitik kısıtlamaları filmidir.
      Dikkat- kloroform zehirlidir. Solunum, sindirim önlemek veya cilt ile temas. Her zaman düzgün işleyen bir kimyasal duman başlık ve uygun filtreler kullanın.
  3. Örnek sahibi sterilizasyon
    1. Takılı örnek sahibi konik bir şişesi 50 mL etanol %70 (v/v) gecede, ajitasyon 180 rpm ve 37 derece ° C altında ile bir kuluçka makinesi/karıştırıcı kullanarak yerleştirin.
    2. Steril distile su içinde birkaç kez sahibinin durulayın.
    3. Hava Kuru onları steril koşullarda ve ultraviyole ışık (Biyogüvenlik tezgah, sınıf II antiseptik lamba) için her iki taraftaki 30 dk için karşılaşmazlar.
    4. Steril 12-şey tabak (her şey bir örnek sahibi) örneklerinde kullanıma hazır kadar tutun.
      Not: Birden çok örnek sahipleri parafilm ile birkaç gün için kapalı kuru ve steril 12-şey tabak içinde oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.

2. uygun örnek tutucu hücrelerinin büyümesini.

Uyarı: İletişim kuralı bir biyogüvenlik laminar akış Bank (sınıf II) bulaşıcı mikro-organizmaların dışlamak için yapılmalıdır. Antibiyotikler (örneğin penisilin, streptomisin) eldiven ile başa. En iyi uygulamalar biyolojik malzemeleri (hücre hatları, genetik olarak değiştirilmiş insan hücreleri türetilmiş) saygı gösterin.

Kritik: kullanılan hücre hatları ile Mycoplasmabulaşmadığından emin olmak için kontrol edilmelidir.

  1. U2OS hücre satır üreticisi tarafından kurulan iletişim kuralına uygun olarak bir transfection yöntemini kullanarak matris-roGFP 17,18,19 taşıyan plazmid ile transfect.
  2. Transfection plazmid taşıyan ile onaylamak için Biyoalgılayıcı ve plazmid kaybını önlemek için seçin ve uygun kültür ortamdaki transfected hücreleri korumak.
  3. Transfected hücreleri floresan mikroskopi transfection oluştu, Floresans ifade ve Retiküler ve borulu mitokondrial ağ19görüntüsünü onaylamak üzere görselleştirin.
    Durma noktası: Hücreler sıvı azot içinde birkaç yıldır donmuş olabilir.
  4. Transfected hücre nüfus uygun bir ortamda hücre kültürü çalışmalarının alt Konfluent hücre popülasyonlarının elde etmek için kullanın. 37 ° c, % 5 (v/v) CO2 bir doymuş su atmosferde hücrelerin büyümesine.
  5. Fiksasyon yapıldığı gün % 80'i izdiham olduğu gibi tohum bir konsantrasyon hücreleri. Genellikle, bir konsantrasyon µL başına 500 hücre kullanılabilir. Tripsin-EDTA 400 µL % 0.25 kullanarak hücreleri (v/v) hasat ve 37 ° C'de 3 dakikadır tutmak Tripsin eylem 1 mL ile Kültür ortamının durdurun. Hücreleri tarafından Santrifüjü at 230 x g ve 4 ° C 5 min için cips, süpernatant kaldırın ve istediğiniz birimin taze kültür ortamının ekleyin.
    Not. İletişim kuralı tüm hücresel türleri için geçerlidir ve seribaşı hücreleri hücre boyutu ve zaman katlama cep bağlıdır.
    Uyarı: Tripsin, antibiyotik ve serum tekrarlanan donma-çözülme çevrimleri için tabi kaçının. Onları steril tutmak. Hisse senedi çözüm aliquots bölmek ve onları dondurma −20 ° C. Aliquots sona erme tarihine kadar saklayın. Dikkatle tripsin tamamen kaldırmak için hücre Pelet durulayın. Artık tripsin izleri gecikme ve kaplama verimliliği azaltır.
  6. Hücreleri saymak ve taze tam kültür orta bir hücre süspansiyon µL başına 500 hücreleri ile elde etmek için 37 ° C'de muhafaza ile bir seyreltme gerçekleştirin.
    Not: Hücre süspansiyon konsantrasyon hücre tipi, bir fonksiyonu olarak bir 40 µL damla plaka için adapte zorunda.
  7. Bir 40 µL damla polikarbonat folyo Merkezi üzerine plaka. Dikkatle 37 derece ° c 2 h ve %5 (v/v) CO2 için örnek bir doymuş su atmosferde yer.
    Kritik: Bir kez örnek da kuluçka makinesine yerleştirilir, mümkün olduğu kadar hızlı hücre eki lehine herhangi bir mekanik hareketi sınırlamak. Hücre tipine göre hücreleri en uygun platting verimlilik için 2 h daha uzun kuluçkaya için gerekli olabilir. Kontrol kuluçka atmosfer iyi buharlaşan dan damla önlemek için doymuş.
  8. Hücreleri iyi bir optik mikroskop kullanarak polikarbonat folyo bağlı olduğundan emin olun. Yavaşça taze tam orta 2 mL ekleyin ve 24 saat tutun.

3. nano tanecikleri hazırlık ve maruz kalma

Not: Floresan boya-modified TiO2 NPs tasarlanmış, sentez ve tetramethyl rodamine isothiocyanate (TRITC) kimyasal olarak değiştirilmiş. 20 , 21 nanopartikül algılama, izleme ve Yerelleştirme in situ ve cellulo içinde yaşayan ve sabit hücreleri veya çok hücreli organizmalar bu yüzey modifikasyonu sağlar. 12 , 13 , 18

Uyarı: Nanomalzemeler ve nano tanecikleri dikkatle ele alınması gerekir. Solunum, sindirim önlemek veya cilt ile temas. Havada yayılması önlemek için nano tanecikleri çözüm (ultrasaf su) korunur.

  1. 1 mg.mL– 1 TiO2 ultrasaf su NPS'de bir süspansiyon hazırlamak. RT yoğun 1-dak sonication darbeleri kullanarak TiO2 NPs dağıtmak (750 W, 20 kHz, genlik: % 30) ultra ses bir jeneratör ve adanmış bir konik microprobe kullanarak.
  2. 4 µg.cm−2 (son konsantrasyonu) bir pozlama askıya almak için TiO2 NPs adlı kültür orta istenen konsantrasyon sulandırmak. Orta içeren NPs hücreleri üzerinde uygun hacmi orta yerine ve TiO2 NPs. hazırlama homojen dağılımını kontrol hücreleri TiO2 NPs ek olmadan benzer şekilde karışımı yavaşça.
  3. Hücre popülasyonlarının 24 h 37 ° C, % 5 (v/v) CO2 ve doymuş su atmosfer için kuluçkaya.

4. paraformaldehyde fiksasyon ve floresan mikroskopisi.

  1. Taze bir çözüm paraformaldehyde çözüm (PFA, % 4 w/v) içinde fosfat tampon tuzlu (PBS, pH 7,4) arabelleğe hazırlayın.
    1. 4 g PFA tozu 100 ml PBS çözülür. Çözüm ila 65 ° C bir mıknatıs ve manyetik karıştırıcı bir duman mahallede kullanarak karıştırma sırasında ısı. PH çözüm temizlenene kadar bir defada 1 M NaOH bir damla ekleyerek artırmak. Oda sıcaklığında çözümü serin ve pH 7.4 için ayarlayın. Taze hazırlanmış çözüm hemen kullanın veya 4 ° C'de almak ve ışıktan korumak.
      Not: İngiltere'de yılın hazırlıksız bir hazırlanması daha fiksasyon kaliteli ve sabit örnekleri uzun vadeli korunması garanti eder ancak önceden yapılmış İngiltere'de yılın çözümleri kullanılabilir.
      Uyarı: İngiltere'de yılın toksik; solunum, sindirim önlemek veya cilt ile temas. Her zaman düzgün işleyen bir kimyasal duman başlık ve uygun filtreler kullanın.
  2. Bir kez, kuluçka süre geçtikten, TiO2 NPs. durulama taze kültür orta ile bir kez ve bir kez PBS (2 mL) ile hücre popülasyonlarının içeren hücre kültür orta kaldırın. PBS kaldırmak için hızlı bir şekilde taze ve soğuk PFA (% 4 w/v, 4 ° C) bir aliquot ile durulayın.
    1. İngiltere'de yılın (2 mL, % 4 w/v, 4 ° C) ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
    2. PFA kaldırmak için PBS (2 mL, 3 kez, 5 min) hücrelerle ajitasyon altında durulayın.
      Durma noktası: Bunlar kimyasal olarak sabit örnekleri-ebilmek var olmak kullanılmış için "Dalma-freeze" yordamı floresan sonra (5 adım git) görüntüleme veya sadece floresan (4.3 adım git) görüntüleme için kullanılan.
  3. PBS 10 min için hücreleri kuluçka Höchst33342 ile çekirdek leke. Hoescht33342 500 son bir konsantrasyon kullanılan nM. Kuluçka sonra çözümü kaldırmak ve PBS ile durulayın.
    Uyarı: Höchst33342 hücre permeant ve toksik olabilir. Doğrudan temas önlemek ve hazırlama ve Höchst33342kullanarak eldiven kullanın.
    Kritik: çözüm boyama Höchst33342 taze hazırlanmış ve steril koşullarda muhafaza emin olun.
  4. İşlem örnekleri in situ ve floresan mikroskobu (şekil 1) kullanarak tek hücre görüntüleme için sabit.

5. "dalma-Dondurma" fiksasyon ve dehidrasyon

  1. Bir alüminyum transfer plaka sıvı azot soğutma tarafından hazırlayın. Mağaza içine bir kutu plaka sıvı azot ile dolu ve plaka yüzeyi üzerinde soğuk azot buharı sıvı korumak.
    Not: Transfer plaka metalik herhangi bir tabak yapılabilir (burada, alüminyum kullanılan) o soğuduktan sıvı azot sıcaklık ve Donma kurutma makinesi örnek odası girebilirsiniz.
    Kritik: Kutuyu mümkün olduğu kadar soğuk levha yüzeyine su buhar biriktirme önlemek için kapalı tutulmalıdır. Hazırlık sırasında plaka üzerinde depolanan örnek nitrojen tarafından kapsanmayan.
  2. Hücre kültürü ortamında bir kez durulama ve sonra iki kez daha, kısaca, steril ve ultrasaf su almak için kalan ekstraselüler tuzları izine kurtulmak.
    Kritik: Medya taze hazırlanmış ve steril koşullarda muhafaza emin olun. 37 ° C'de tüm medya kullanılmadan önce ısı. Durulama (birkaç saniye) çok kısa olmalı ve aşırı sıvı örnekleri üzerinde kısa sürede kaldırıldı.
  3. Dalma-hücreleri dondurma-150 ° c sıvı azot soğutulmuş 2-methylbutane sırasında 30 s ve yer içinde onlar üzerine alüminyum plaka aktarmak. Buraya örnekleri diğer örnekleri hazırlanması sırasında saklayın. Tüm cryofixed olduğu, all-at-donma kurutucuya transfer plaka yerleştirerek once aktarın.
    Kritik: Cryofixation işlemi daha--dan 20 dk yapısal değişiklikleri geçici olarak transfer kutusunda depolanan örnekleri görünmesini önlemek için idare eder değil.
  4. Aşağıdaki dizileri kullanarak örnekleri şeytanibir: 1) 12-24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) düşük basınç ve düşük sıcaklık için birincil bir kuruma gerçekleştirmek, sonra 2) en az 24 h plaka sýcaklýðýna artan, ikincil kurutulma aşaması gerçekleştirmek + 40 ° C süre basınç düşük (+ 40 ° C, 10-3 mbar) tutmak.
    Uyarı: Sıvı nitrojen aşırı soğuk ve şiddetli soğuk ısırması veya göz temas üzerine zarar verebilir. Ulaşımına adapte tezgah üst kaplar kullanın ve güvenlik ekipmanları (kriyojenik eldiven, göz ve yüz koruma) giymek.
    Dikkat: 2-Methylbutane çok kolay alevlenebilir. Havadaki zararlı bir kirlenme buharlaşma + 20 ° C'de bu madde üzerinde oldukça hızlı bir şekilde ulaşılabilir Solunum, sindirim önlemek veya cilt ile temas. Nefes ve göz koruması ve koruyucu eldiven kullanın. Her zaman düzgün işleyen bir kimyasal duman başlığı kullan. 4 ° C'de depolanmış olabilir
    Kritik: 2-Methylbutane sıcaklıklar "Dalma-freeze" oturumu sırasında izlemek için uygun bir termometre (-150 ° C) kullanın. 2-methylbutane bir sıvı faz serin tutulması gerekir. Cryofixed örnekleri için ortam atmosfer aktarma sıcaklık artışı veya su buharı örnek yüzeyinde yoğuşma nedeniyle hücre hasarına neden. Buna göre transfer yapılması gereken olabildiğince hızlı şekilde makul (30 s)
    Durma noktası: Cryofixation sonra örnekleri oda sıcaklığında (toz ve nem korumalı) steril ve kuru koşullarda birkaç gün saklanabilir. Dikkatlice örnekler iyi Forseps ile idare ve parafilm ile kapalı steril bir 12-şey plaka koyun. Kurutucu atmosfer kuru için kullanılabilir.

6. nükleer Microprobe analizi

Not: Nükleer Microprobe analiz tamamlayıcı iyon demeti analitik teknikler parçacık x-ışını emisyonu indüklenen (μ-microbeam hattı ile AIFIRA (uygulamalar Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions tr Région Aquitaine), gerçekleştirilmiştir PIXE) ve iletim iyon mikroskobu (μ-STIM) tarama. Tesisin MeV enerji aralığı içinde ışık iyon kirişler teslim 3,5 MV parçacık hızlandırıcı temel alır. 22 , 23

Durma noktası: AIFIRA önerilen deneme bilimsel değerlendirme sonrasında ulusal ve uluslararası takımlar bir ulaşılıyor Bordeaux Üniversitesi ev sahipliğinde bir iyon demeti tesistir.

  1. PEEK örnek sahipleri çift taraflı bant kullanarak apertured bir tabağa bağlayın.
  2. Işın yönüne dik bir dikey düzlemde örnek destekleyen tabak koyun.
  3. Analiz odası kapatın ve analiz odası vakum.
  4. İletim iyon mikroskobu (μ-STIM) tarama
    Not: STIM alan yoğunluğu haritalar hücre hücresel kitle, enerji kaybı dönüştürme sonra kaydetmek için enerji kaybı (µg.cm-2ifade edilir) örnek alan yoğunluğu ile orantılı olduğu gerçeğini yararlanarak kullanılır.
    1. Bir sonda bir boyutu yaklaşık 300 odak düzlemi ile 2 MeV helyum (He+) microbeam kullanmak nm çapındadır ve düşük akıcılık (2000 ions.s-1). Ölçü enerji (tırtıl dedektörü, 25 mm2, 5,4 MeV @ 11 keV enerji çözünürlük), düzlemsel Silisyum dedektörü ile iletilen iyonların yerleştirilen kiriş eksenindeki örnek arkasında.
  5. Parçacık x-ışını emisyonu (μ-PIXE) ve Rutherford gelmekte spektrometresi (μ-KÇY) indüklenen.
    Not: μ-Pixe ve μ-KÇY analizleri miktar alt mikrometre çözünürlüğü ile kimyasal elementlerin ve kayma dağıtımı sağlar.
    1. 1 µm ve tarama çapı aşağı 4 STIM 8 saat ve yaklaşık 100 x 100 µm2tarafından ilgi aynı hücreleri üzerinde odaklanmış bir 1,5 MeV proton (H+) microbeam (50-150 pA) kullanın.
    2. Atomlar bir yüksek çözünürlüklü Si(Li) katı hal dedektörü (145 eV enerji çözünürlük, @Mn-Kα) tarafından (Na ağır) örnek mevcut gelen ışın eksenden 45 ° konumlandırılmış üzerinden yayılan indüklenen X-ray fotonlar toplamak. Tespit edilen foton enerji emitters (örneğin öğesinin Z) ve x-ışını yoğunluğu öğe konsantrasyonu belirlemek için doğasını belirlemek için kullanın.
    3. Aynı anda arka dağınık proton-135 ° silikon bulmak ile toplamak (kısmen tükenmiş dedektörü, 25 mm2, 11 keV 5,4 MeV @ FWHM) gelen parçacıklarının toplam sayısı ölçmek için ve x-ışını yoğunluklarda normalize etmek.
      Kritik: Atomik konsantrasyon miktar için Sertifikalı kalibrasyon standartları topluluğu x-ışını dedektörü yanıt kalibre için kullanılır. Başvuru malzemeleri ince atomik filmlerin 6.3 µm kalınlığında Mylar folyo yatırılır bir koleksiyon bulunmaktadır. Yayılan x-ışını enerji aralığından 0.6 (Li, K line) 20,2 keV (Rh, K satır).

7. veri analizi

  1. IBA-J eklentisi kullanarak ImageJiçin kimyasal temel haritalar yeniden. 24
    Not: ImageJ bir eklenti şeklinde adanmış yazılım ham nükleer microprobe analiz verileri işlemek için geliştirilmiştir. Ham veri olayların kronolojik bir sıra olarak ışın konumunu birlikte kaydedilir hücreleri ile partikül ışını etkileşimi kaynaklanan karşılık gelir.
    1. IBA-J eklenti olayları tipine göre sıralamak için kullanın: iyon enerji (STIM) aktarılan, backscattered iyon enerji (KÇY) ya da x-ışını foton enerji (PIXE). Sonra ayrı ayrı her veri türü işlem.
    2. STIM alan yoğunluğu harita hesaplamak
    3. Ortalama x-ışını foton enerji spectra hesaplamak ve öğe kayma dağıtım almak için ilgi bir enerji pencere kimyasal her öğe için tanımlayın.
    4. Faiz (ROI) (örneğin tek tek hücreler, yoğun yapısı, toplamları, vb) bölgelerinde tanımlamak ve karşılık gelen x-ışını spektrumları hesaplamak.
  2. Olay parçacıklar25toplam sayısını hesaplamak için karşılık gelen KÇY spectra analiz.
  3. X-ışını spektrumları her yatırım Getirisi için öğe konsantrasyonu belirlemek için Gupix yazılım26 kullanarak uygun.
    Not: Tipik algılama (lod olarak) yöntemi için aralığı 1-10 µg.g-1 (LOD Z ile azalıyor) elementlerin atom numarası bağlı olarak kuru kütlesi sınırıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre kültürü ve fluorescently etiketli TiO Floresans görüntüleme 2 NPs

Hücre kültürü, hücre işleme gibi multimodal analiz için uyarlanmış bir örnek sahibi dizayn ettik. Özellikle, sahibi de nükleer microprobe çözümleme ve görüntüleme rutin optik mikroskobu izin önemliydi. Bu örnek sahibi bir göz karede yatırılır 2-µm kalınlığında polikarbonat folyo temel alır. Hücrel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ne hücre altı düzeyinde özellikle diğer görüntüleme teknikleri ile mümkündür ötesinde yararlı bilgiler sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Görüntüleme yeteneğini yanı sıra, nükleer microprobe analiz de miktar biyolojik örnek kompozisyon girerek kimyasal elementlerin olanakları sunuyor. Mevcut çalışmada, biz insan hücre popülasyonlarının okudu ve aşağı seçilen bölge TiO2 için NPs maruz tek bir hücre temel ilgi analiz odaklı. Diğer teknikleri ile onun birlikte morfolojik hücresel görüntüleme ve hassas Nicel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serge Borderes yönetmenlik ve video düzenleme için teşekkür ederiz. Fransız Ulusal araştırma ajansı araştırma programı TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01) destekler. CNRS ve entegrasyon etkinlik olarak Avrupa Topluluğu "destek genel ve endüstriyel araştırma kullanarak iyon ışın teknolojisi (ruhu)" EC sözleşme n ° 227012 altında sağlanan. Bu eser EC Sözleşme No 317169 altında Marie Curie eylemleri - bir "entegre etkinlik destekleyen yüksek lisans araştırma ile staj in sanayi ve eğitim Excellence" (SPRITE, D1.3) olarak ilk eğitim ağları (ITN) tarafından desteklenmiştir. C'NANO Grand Sud Ouest ve bölge Aquitaine araştırma programı zehir-NANO (n ° 20111201003) ve araştırma programı POPRA (n ° 14006636-034) destekler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre kültürü< / güçlü >
U2OSATCC, LGC STANDARTLARIATCC HTB-96
Orta MCCOY 5A, L-GlutaminDominique DUTSCHERL0211-500
FBS 500 mLDominique DUTSCHER500105U
Penisilin / Streptomisin ve nbsp;ThermoFisher Bilimsel11548876
  L-Glutamin 200 mM, 100 mL İnvitrojen25030024
Geneticin,  20 mLThermoFisher Scientific10092772
Tripsin-EDTA %0.25 (h/h)  500 mLThermoFisher Scientific11570626
Viromer KırmızıLipokaliksVR-01LB-01
Matrix-roGFP PlazmidAddGene#49437
Hoechst 33342ThermoFisher ScientificH3570Dikkatli
NPs hazırlama ile tutun
TiO2 P25 AEROKSITDegussa/Evonik
Tetrametilrodamin izotiyosiyanat (TRITC)SIGMA-ALDRICHT3163NP'lerin yüzey modifikasyonu
Numune hazırlama
Polikarbonat folyoGoodfellowCT301020
Polieter Eter Keton desteği (PEEK)MatechplastA-239-4047
Etanol, ACS mutlakSIGMA-ALDRICH02860-6x1L
Klorform, Susuz, %99SIGMA-ALDRICH372978-1L Dikkat: toksik
Formvar 100 gAğar BilimselAGR1201Zararlıdır. 10 & mikro konsantrasyonda kullanın; mL başına g kloroform
NaOHSIGMA-ALDRICHS5881-500G
Numune fiksasyonu
Toz, %95 ParaformaldehitSIGMA-ALDRICH158127-500GDikkat toksik. PBS PBS'de %4'lük bir çözelti olarak kullanın
PBS (pH 7.4, Ca2+ ve Mg2+ olmadan)ThermoFisher Scientific11503387
Prolong Gold Antifade ReaktifiThermoFisher ScientificP36934
Triton X-100SIGMA-ALDRICH93443Zararlı
Numune kriyofiksasyonu
Sıvı nitrojenlihava sıvıları santeZararlı
Metilbütan > =% 99SIGMA-ALDRICH& nbsp; M32631-1LDikkat toksik
Alüminyum transfer plakasıEv yapımı
Damıtılmış ve deiyonize suEv yapımıBarnstead Smart2Pure sistemi kullanılarak laboratuvarda üretilmiştir
ParafilmVWR52858-000
Equipment
Barnstead Smart2PureThermoFisher Bilimsel50129870
Biyogüvenlik tezgahı, sınıf IIThermoFisher ScientificMSC-Advantage
TC20 otomatik hücre sayacıBiorad145-0102SP
Sayma slaytları 2 kuyuBiorad1450016
PIPS dedektörü, 25 mm2, 12 keV enerji çözünürlüğü @5.5 MeVCanberra PD25-12-100AM
Yüksek çözünürlüklü Si (Li) katı hal dedektörü, 145-eVenergy çözünürlüğü, @Mn-K ve alfa;Oxford Instruments
Everhart-Thornley tipi ikincil elektron dedektörü (SED) Orsay Fizik1-SED
XRF Kalibrasyon Standardı NaCl olarak sodyum veya KlorMikromadde34381
XRF Kalibrasyon Standardı MgF2 olarak MagnezyumMikromadde 34382
XRF Kalibrasyon Standardı Al metal olarak AlüminyumMikromadde34383
XRF Kalibrasyon Standardı SiOMikromadde34384
XRF Kalibrasyon Standardı CuSx Micromatter olarakKükürt 34385
XRF Kalibrasyon Standardı CaF2 Mikromaddeolarak Kalsiyum 34387
XRF Kalibrasyon Standardı Ti metal olarak TitanyumMicromatter34388
XRF Kalibrasyon Standardı Fe metal olarakMicromatter34389
Sonicator 750WSonics Malzemeler11743619
3MM mikroprobBiyoblok bilimsel220-05
VakumluLiyofilizatör ElexienceEK3147
Optik mikroskop Zeiss AxioObserver Z1Carl Zeiss MicroImaging, GmbH431006-9901
Motorlu sahne xyCarl Zeiss MicroImaging, GmbH432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 amaçCarl Zeiss MicroImaging, GmbH420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objektifCarl Zeiss MicroImaging, GmbH420781-9910
Zeiss filtre seti 02Carl Zeiss MicroImaging, GmbH488002-9901
Zeiss filtre seti 38HECarl Zeiss MicroImaging, GmbH489038-9901
Zeiss filtre seti 31Carl Zeiss MicroImaging, GmbH000000-1031-350
Kimyasal çeker ocakErlabCaptair SD321
Parçacık hızlandırıcıHVEEsingletron
Software
ImageJ yazılımıUlusal Sağlık Enstitüleri, ABDImageJ 1.51
SimNRA yazılımıMax-Planck-Institut fü r Plasmaphysik, AlmanyaSIMNRA 6.06
Gupix yazılımıGuelph üniversitesi, KanadaGUPIXWIN 2.2.4
, , , olarak Silikon demir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
  4. Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
  5. Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
  6. Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
  7. Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
  8. Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
  9. Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
  10. Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , Elsevier Ltd. (2014).
  11. Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
  12. Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
  13. Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
  14. Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
  15. Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135(2014).
  16. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  17. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
  18. Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  19. Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  20. Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
  21. Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
  22. Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
  23. Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
  24. Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
  25. Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
  26. Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
  27. Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Titanyum Dioksit Nanopar ac klarTaramal Ge irimli yon MikroskobuPar ac k Uyar m X I n EmisyonuRutherford Geri Sa l m SpektrometresiKriyojenik SabitlemeFloresan MikroskobuKimyasal Element G r nt lemeH cre K lt r Tutucusu

İlgili makaleler