Yöntem makalesi

İndaktif Plazma - - Lazer Ablasyon Beyin Dokusu Görüntüleme Metaller Kütle Spektrometresi (LA-ICP-MS)

23.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55042

⸱

22 Ocak 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Elemental Bio-imaging Facility, University of Technology Sydney, 2Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne, 3Department of Pathology, The University of Melbourne, 4School of Earth Sciences, The University of Melbourne, 5Research School, Ruhr University, 6Department of Physiology, Monash University, 7ESI Ltd., Bozeman, 8Agilent Technologies, Mulgrave

Bu makalede

Özet

Kantitatif lazer ablasyon ile dokuda metallerin haritalama - indüktif eşleşmiş plazma - kütle spektrometresi (LA-ICP-MS) metaller, normal fonksiyon ve hastalık sürecine katılmaları nasıl yeni bir fikir verebilir hassas bir analitik tekniktir. Burada, kantitatif fare nörolojik doku ince kesitlerde metal görüntüleme için bir protokol açıklar.

Özet

Metaller, belirli bir anatomik bölgede hem kimyasal reaktivite ve bolluk tarafından dikte biyolojik rolü, bir organizmanın boyunca yayg bulunur. beyin içinde, metaller, merkezi sinir sistemi içinde oynayabilir birincil işlevi ile ilgili olarak, bir yüksek bölümlere dağılımına sahiptir. Metallerin mekansal dağılımının görüntülenmesi Nöroanatomik bölgeler ve metal bağımlı süreçlerle ilgili kendi bilinen fonksiyonu arasındaki doğrudan bir ilişki sağlayan beynin biyokimyasal mimarisine benzersiz bir bakış açısı sağlamıştır. Buna ek olarak, çeşitli yaş ile ilişkili nörolojik bozukluklar genellikle, aksi analiz etmek zordur beynin küçük bölgelerle sınırlı metal homeostazını kesintiye sağlarlar. Burada, lazer ablasyon kullanarak, nicel fare beyninde metalleri görüntüleme için kapsamlı bir yöntem tarif - indüktif eşleşmiş plazma - kütle spektrometresi (LA-ICP-MS) ve özel olarak tasarlanmış görüntü işlemeyazılım. beyin içinde en bol ve hastalık ilgili metallerin üç olan demir, bakır ve çinko, üzerinde yoğunlaşırken, biz düşük mikrometre içindeki metal dağılımının haritalar üretmek için numune hazırlama, analiz, kantitatif ölçümler ve görüntü işleme temel adımları açıklar çözünürlük aralığı. herhangi bir kesim doku bölümü için geçerli Bu teknik, bir organ ya da sistemde metallerin oldukça değişken dağılımı sergileyebilme yeteneğine sahip olduğunu ve gayet iyi anatomik yapıların içindeki metal homeostazında değişiklik ve mutlak düzeylerini belirlemek için kullanılabilir.

Giriş

Metallerin eşsiz redoks kimyası sinyal iletimi, enerji üretimi ve nörotransmitter sentezi de dahil olmak üzere nörolojik fonksiyonları, bir dizi kolaylaştırır. En temel nörodejeneratif hastalık, bir dizi, bu metallerin dyshomeostasis iki hastalıkta patogenezinde ve terapötik müdahale 1 potansiyel yeni hedeflerin olarak tanımlanmıştır. Daha iyi metaller Alzheimer ve Parkinson hastalığı (AD ve PD, sırasıyla) olarak koşullarda katılmaktadırlar anlamak için, metal dağıtım ve seviyeleri olumsuz hastalık sürecinden etkilenen bölgeler içinde nasıl değiştiğini ölçebilmek için zorunludur. Bu değişiklikler genellikle yakından böyle PD 2 demir ve dopamin nörotoksisitenin bizim son zamanlarda önerilen mekanizma olarak, hücre ölümünü başlatmak süreçlerle bağlantılı olabilir biyokimyasal reaksiyonlarda ince vardiya göstergesidir.

Geleneksel olarak, bir metatanımlanmış anatomik bölgeler içinde l seviyeleri analitik teknikler 3 bir dizi kullanarak dikkatli eksizyonu, sindirim ve analiz yoluyla elde edilmiştir. Ancak, böyle bir yaklaşım hastalık durumları incelenmiştir küçük, iyi tanımlanmış bölgeler veya belirli hücre tiplerini içeren edilirken kritik olabilir uzamsal bilgiyi kaybeder. Analitik bir dizi yöntem emisyon spektroskopisi, floresan probları ve kütle spektrometresi 4 kullanılarak sağlam örneklerinden doku bölümleri ve iki ve üç boyutlu olarak biyolojik sistemlerde metaller, görselleştirmek için kullanılabilir. Her teknik hassasiyet, kimyasal türlerin seçicilik ve elde edilebilir uzaysal çözünürlüğü ile ilgili avantajları ve dezavantajları vardır. Mevcut tekniklerin aralığında kapsamlı bir bakış için, Hare ve arkadaşları tarafından gözden bakın. 5.

Kütle spektrometrisi (MS) yöntemleri, bu tekniklerin en duyarlı tabanlı, Kendi ana konsantrasyonda 6 en biyolojik ilgili metalleri ölçebilen. Lazer ablasyon - indüktif eşleşmiş plazma - kütle spektrometresi (LA-ICP-MS) görüntüleme (bir dörtgen ışın şekil kullanılır veya genişlik)> çapı 100 mikron 1 arasında değişen büyüklüklerde odaklanmış morötesi lazer ışınını, istihdam altında örnek 7 geçirilir. Nicel bilgiler farklı yaklaşımlar 8, teknik zorluk ve analitik pratiklik değişen derecelerde her çeşitli kullanılarak üretilebilir standart referans malzemelerin temsili ablasyon yoluyla elde edilebilir. En yaygın yaklaşım, numunenin karşılaştırılabilir baskın kimyasal yapısına sahip, standart bağımsız analiz vasıtasıyla 9 ile homojenliğe ve mutlak metal konsantrasyonu açısından değerlendirildi doğru hedef analit ile spike hazırlanabilir ve matris eşlemeyi kullanır 10. Hazırlanan standartların ablasyon daha sonra sonuçta meydana gelen örnek bir görüntü konsantrasyonu verileri piksel başına ekstre sağlayan dış kalibrasyon amaçlı kullanılabilir.

Resim çözünürlüğü kiriş boyutu ve örnek taranır hızına tarafından belirlenir. (Dünya çapında tüm yüklü ICP-MS sistemleri 11% 90'ından sorumludur), standart dört kutuplu tasarım ICP-MS seçilen tüm kütle-ücret oranı ile kitle detektörü döngüleri, sıralı kütle analizörü (m / z ) yerine eş zamanlı olarak veri toplamak daha. Bu nedenle, kitlelerin her bir döngü için elde etme zamanı, istenen çözünürlük piksel temsilci 12 elde edilir sağlamak için, lazer ışınının bir genişliği hareket örnek için alınan zaman eşit olmalıdır. Lazer ışın boyutu seçimi duyarlılık ve toplam analiz süresi hem de önemli etkilere sahip olan bir çok önemli bir parametredir. lazer ablasyon fiziksel durumları olarakCally'nin argon taşıyıcı bir gaz ile, ICP-MS süpürülür malzemenin fiziksel kütle analizörü ile tespit edilebilir madde miktarı ters kare kanununa göre hareket kaldırır. dört kat ablasyon malzemenin bir azalma 25 um sonuç - Örneğin, 50, lazer ışını çapının azaltılması. Ayrıca, bir tarama yöntemi olarak, daha küçük kiriş çapları seçilen bir alanı baskılamak için gereken toplam süreyi artırır. Bu nedenle, deneysel tasarım duyarlılık ihtiyaçları ve zaman kısıtlamaları gerekli uzaysal çözünürlük dengelemek için esastır.

LA-ICP-MS ile görüntüleme nörolojik bozuklukların 13, 14, travmatik beyin yaralanması, 15 plasentada metal içeren anti-kanser ilaçları, 16 zehirli maruz dağılımı hayvan modellerinde de dahil olmak üzere, örnekler, matris ve hastalıkların bir dizi tatbik edilmiştir 17 ve metal distrErken yaşam diyet geçişler bir biyolojik belirteç olarak dişlerde ibution. Kolayca örnek türleri ve deneysel sonuçlar bir dizi adapte edilebilir olsa bu protokol 18 biz ihtiyaçlarına göre, 30 mikron çözünürlükte WT fare beyin demir, bakır ve çinko görüntüleme için genel bir yöntem tarif analisti.

Protokol

Burada tarif edilen prosedürler Howard Florey Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı ve hayvan bakımı Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi standartlarına uymak edilmiştir.

Analiz için 1. Numunenin hazırlanması

NOT: Bu adım, analiz edilecek numune matrisi bağlı olarak değişir.

  1. Örnek hazırlama ve kesit
    Not: Sabitleme 0.1 M PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) ve% 30 sukroz içinde soğuktan koruma kullanarak doku metal çözeltiye değişen miktarlarda neden olur. Belirli ayrıntılar için Hare ve ark 19 Bkz. Emin olun bütün numuneler aynı tespit ve Kriyoprezervasyon adımları uğramıştır.
    1. Transkardiyal buz soğukluğunda 0.1 M PBS, pH 7.4 ile ötenazi hayvan (Dodt ve arkadaşları. Ayrıntılar için, 20 Yöntemler bölümüne bakınız) serpmek ve beyin çıkarın.
    2. doku düzeltmek için% 4 PFA O / N beyin yerleştirin.
    3. cryoprotect daha sonra 24 saat süre ile 0.1 M PBS içinde% 30 sakroz içine yerleştirerek ve beyin bir 24 saat daha, taze,% 30 sakaroza değiştirin. 19
    4. en az 1 saat boyunca -20 ° C'de, bir kriyostat beyin dondurun.
    5. Uygun bir montaj orta kullanarak bir aynanın üzerinde beyin monte edin.
    6. Bölüm metal içermeyen tek kullanımlık bıçak kullanılarak bir kriyostat beyin (örneğin, politetrafloroetilen [PTFE] bıçakları -kaplı) ve standart bir mikroskop lamı üzerine monte edin. bölüm için en uygun kalınlığı yaklaşık 30 um olmalıdır.
  2. İstenilen kalınlıkta parafine gömülü örnekleri bölümünü kullanıyorsanız, bir sıcak su banyosu üzerine şerit yüzer ve standart mikroskop slaytlar monte.
    NOT: Uzun vadeli fiksasyonu ve biyolojik örneklerin parafin gömülmesi kesin etkileri bilinmemektedir. 1.1 anlatıldığı gibi, karşılaştırmalı analiz isteniyorsa bütün numuneler aynı numune hazırlama prosedürleri geçirmiş emin olun.
    1. Dewax paksilen 3 değişiklikler, 1 Her bir slayt daldırılmasıyla RAFFIN gömülü örnekler:% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve ISO 3696 ve bundan sonra denk saflaştırılmış su (3 değişiklikleri minimum 'olarak adlandırılır su ';. detaylı bir yöntem için Hare ve ark 21 bakınız).
  3. örnekleri izin kurumasını gibi raflara dikey olarak yerleştirilmiş örnekleriyle slayt kutusu ve aralık sol kapak gibi tozsuz bir ortamda yaklaşık 1 saat boyunca.

Matris eşlemeli Standartlar 2. Hazırlık

NOT: Aşağıdaki önce 9 yayınlanan özet bir protokoldür. matriks uyumlu doku standartlarını hazırlamak için ayrıntılı adımlar için orijinal kağıt danışın.

  1. Ticari kuzu beyin elde (veya benzeri) ve tüm kan ve bağ dokusu kaldırarak, suyla durulayın.
  2. Bir neşter kullanılarak, dikkatli bir şekilde kortikal Tissu'nun yaklaşık 50 g teşrihE ya da kısmen düşük güç bir polikarbonat tek probla elde tutulan bir doku homojenleştirici kullanılarak homojen hale getirilir. sayı kalibrasyon aralığı ve istenilen kalibrasyon noktalarının sayısına bağlı olan, 5 gr kısma bölün.
  3. Her bir analitin bir çözünür tuz (örneğin, FeSO 4 · H2O)% 1 nitrik asit, 0.1, 1 ve 100 mg metali mL-1 stokları üretmek için eritilerek her örnek spike metallerin çözelti hazırlayın.
  4. Ani yüksek voltajlı metal seviyesi bir dizi elde etmek için (10 | ig g-1 ıslak doku yaklaşık nihai konsantrasyonda örneğin, 5 uL 10 mg ml-1) 5 g aliquoted dokuya stok çözeltisi bir önceden hesaplanmış hacim ekleme her bir standart.
    1. Her bir standart arzu edilen son konsantrasyona bağlı olarak, bir standart ilave edilir çözümler az miktarda sağlamak için her bir metal stok solüsyonu bir kombinasyonunu kullanır. equi sağlamak için her bir standart su son bir başak eklemeeklenen sıvının değerlikli hacimleri her standart mevcuttur.
    2. Yaklaşık 30 saniye boyunca düşük güç çivili standartları homojenize. Hemen kullanılacak Değilse, Parafilm ile sızdırmaz kapaklı polipropilen tüpleri içinde 20 ° C 'de dondurulmuş tutun.
  5. Doğru konsantrasyon ve aşağıdaki prosedürlerden birini kullanarak her bir standardın homojenliğini belirlemek:
    1. Mikrodalga sindirim
      1. Bir yıkandı PTFE sindirimi kabı içinde standart bir 6 doğru olarak tartılmış (yaklaşık 50 mg), alikot yerleştirin ve konsantre edilerek 4 mL (% 65), nitrik asit ve% 30 hidrojen peroksit 1 ml. Kapatın ve 30 dakika süre ile 500 W sindirimi.
      2. kantitatif davlumbaz sindirim kap, açık soğutma ve sonra 10 mL su alikotları ile bir asit-yıkanmış 50 ml tüp sindirilmiş çözelti aktarın. yaklaşık 50 ml olun ve doğru nihai çözüm kütlesini tartın.
      3. her standart için 2.5.1.2 - 2.5.1.1 tekrarlayın adımları.
    2. mikrodalga sindirim ekipman mevcut değilse aşağıdaki yordamı kullanın:
      1. asitle yıkanmış / metal içermeyen polipropilen tüp ve Lyophilize O / N içine standart hacimde - altı doğru ölçülen (200 mg 25 arasında) yerleştirin.
      2. 5 dakika boyunca 70 ° C'ye kadar bir ısıtma bloğu üzerinde, konsantre nitrik asit ve ısı, kapaksız 40 uL ekleyin ve% 30 hidrojen peroksit 10 uL ekleyin. 5 dakika daha için ısı ve daha sonra doğru bir şekilde% 1 nitrik asit 950 uL kullanılarak 1 mL toplam hacme olun.
        NOT: sindirim prosedürleri doğru olduğundan emin olmak için seçim yöntemini kullanarak bir sertifikalı referans malzeme sindirmek için tavsiye edilir.
  6. standart bir protokol kullanarak çözüm nebulization ICP-MS ile her sindirmek çözelti metal konsantrasyonunu belirlemek. her kısım arasındaki nispi standart sapmayı (% RSD) belirlenerek her bir standart homojenliğini değerlendirin. % RSDS'nun% 15 içindeki tüm düşüş emin olun. ea ölçülen kütlesi kullanarakch kısım, her homojenize doku standardının hassas metal konsantrasyonu hesaplamak.
  7. Homojenize doku standardına geri dönersek, 5 x 5 mm plastik tek kullanımlık histoloji kalıp paketi ve iso -pentan dondurma sıvı azot içinde soğutulmuş. Örnek olarak aynı kalınlıkta bir kriyostat üzerinde kalıp ve bölümünden dondurulmuş standart doku bloğunu çıkarın.
    Not: Gelecek deneyler için, farklı kalınlıklarda bölümleri bir dizi hazırlanması tavsiye edilir. Hava ile kurutulmuş standartlar hava geçirmez ve tozsuz bir kap içinde belirsiz bir süre depolanabilir.

Analiz için LA-ICP-MS 3. hazırlanması

  1. ablasyon odasında Yeri standartları ve örnek, onlar LA ünitesine takılan CCD kamera alan derinliği içinde olmasını sağlamak. Cihazın ayar gerekiyorsa, (örn, Cam NIST 612 Trace Elements) uygun bir referans materyali içerir. inci mühür oda kapısı iki vidayı parmak sıkıne ablasyon odası.
  2. ICP-MS yazılımında, 'Bakım' veya benzer panelinde açık argon gaz vanasını seçin ve uygun diyalog kutusunda dk -1 1.2 L taşıyıcı gaz akışını ayarlayın.
    NOT: Bu protokol, argon, taşıyıcı gaz olarak kullanılmıştır. Çeşitli örnekler, helyum veya bir taşıyıcı gaz olarak helyum ve argon karışımından birini kullanabilirsiniz. Aerosol taşıyıcı gaz olarak helyum ve argon karışımları kullanarak teknik detaylar için Günther ve Heinrich 22 Bkz.
  3. LA yazılımında, 30 dakika en az argon gazı ile hücreyi temizlemek için 'tasfiye' düğmesine tıklayın.
    NOT: Temizle zaman 'tasfiye zamanı' veya benzer butonuna tıklayarak değiştirilebilir. İki ciltlik ablasyon hücre ile ablasyon sistemi kullanırken, periyodik her köşesine sahneye taşımak ve çapraz kadar artık hava mümkün olduğunca hücreden çıkarılır sağlamak için hücre hareket. Bu "ana aşamaları 'ya da eşdeğer seçerek elde edilebiliraynı yağı fonksiyonu.
  4. 'Üzerinde plazma' tıklayarak ICP-MS açın ve 3.5 adımları sırasında iki saat süreyle ısınmasını bekleyin - 4.4 yapılabilir. Uygun LA-ICP-MS, işletim koşulları Örnek Hare ve ark bulunabilir ancak alet ayarları üreticileri arasında değişmektedir. 10.
  5. Doku standartlarının Temsilcisi ablasyon
    1. satırı aracını seçin ve doku yüzeyi boyunca yaklaşık 3 mm uzunluğundaki ablasyon tek bir çizgi çizin.
    2. (Tarama hızını 4 kat kiriş çapı, kiriş (30 mikron kare kiriş burada kullanılan kullanıcı tarafından uygun olarak seçilmiştir) çapı: Deney listesinde ablasyon hattı sağ tıklayıp aşağıdaki değiştirerek parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayınız saniyede; -1 120 mikron ler) ve enerji akıcılığa (0.3 -0.5 J cm -2 yumuşak doku için;) zor matrisler için gerekirse optimize. 30 mikron doku kalınlığı en lazer ışını tam thic nüfuz etmezMikroskop destek, herhangi bir potansiyel kirletici ortadan bu doku kness. Karbon 23 Normalize ablasyon doku miktarı varyasyon düzeltmek için kullanılabilir. 'Varsayılan' radyo düğmesini seçerek sonraki her satır için varsayılan olarak bu parametreleri ayarlayın.
    3. İlk çizgi, sağ tıklayarak seçip 'yinelenen taramaları' seçerek bu hat altı kez çoğaltın. Işın çapı veya y ekseni - emin çizgiler ya x ofset emin olun. Bu standart başına yedi satırlık bir toplam verir, ışın çapına göre aralıklı.
    4. aynı uzunlukta çizgi sağlanması, her standart için 3.5.3 - Tekrar 3.5.1 adımları.
  6. İki aşağıdaki yöntemlerden birini izleyin, numune üzerinde ablasyon alanını çizmek için:
    NOT: Aynı tarama parametreleri (ışın çapı, tarama hızı, enerji akıcılık) emin olun numune hatları için kullanılır.
    1. LA sistemi ile donatılmış isegörüş geniş alan, çizgi aracını seçin ve 3.5 özetlenen aynı lazer parametreleri kullanarak en geniş noktasında örnek kapsayacak kadar uzun numunenin sol üst köşesinden bir çizgi çizin. gerekli oldukça numune tam kapsama sağlamak için ışın çapına göre aralıklı çizgilerle Bölüm 3.5.3'te belirtildiği gibi, bu tarama yinelenen.
    2. Geniş alan görünümü mevcut değilse, tespit ve x ve y koordinatları kayıt tüm örnek kapsayan bir dikdörtgenin köşelerinde karşılık gelen (genellikle 'sahne pozisyonunda' veya benzer olarak ana ekranda gösterilir). 3.7.1 de açıklandığı gibi tüm numune alanını kapsayan ablasyon paralel çizgiler konumlandırmak için bu koordinatları kullanın.
    3. ~ 3.5'de tarif edilen işlem tekrar edilerek örnek tarama 20 saat sonra en geç standartların aralıklı tarama için çizgiler çizin. Bu birden çok kez gerekli olabilir numunenin tarama süresine bağlı. Bir addin ile deney Endstandartların tional tarama.
      NOT: Hücre ev pozisyonları seçerek, tasfiye ediliyor ve eksenin ilişkili kalibrasyon değişecek ise x ve y koordinatları belirlenirken, daha önce fark ise x özelliklerini ve y koordinatlarını edinilen (yani hattın uzunluğu) olacak etkilenmez.

4. ICP-MS için Veri Toplama Yöntemleri Kurma

  1. ablasyon standart hat için, tek bir hat için toplam analiz süresi belirlemek için, lazer tarama hızı ile hattın uzunluğunu bölün. Örnek hattı için bu işlemi tekrarlayın.
  2. ICP-MS yazılımında, (bir 'toplu' olarak burada gösterilir) yeni bir yöntem oluşturmak ve 'zaman analizi çözüme' veya eşdeğeri seçili olduğundan emin olun. m / z değerleri tespit edilecek seçin ve bir devir için toplam entegrasyon süresi 0.25 sn eşittir, böylece daha sonra her bir m / z entegrasyon süresini ayarlamak. 'Kaydet Batbuna göre ch gibi, 've isim (örneğin, Std1).
    Not: Örnek dört kez ışın çapı lazer ışınını hareket edeceği gibi, bu durum, her kütle için bir veri noktası ışın çapı 12 eşdeğer kaydedilir sağlar. Örneğin, gerçek piksel boyutlarına sahip görüntüler üretecektir 0.25 sn bir entegrasyon süresi ile 100 mikron spot büyüklüğü, 400 mikron s tarama hızı -1 kullanarak. İntegral süre duyarlılığını artırmak için ayarlanabilir; 0.33 s tarama hızı ile entegrasyon süresini artırırken üç kez ışın çapı yavaşladı edilmelidir.
  3. standartları için uygun kutuya her satır tarama için analiz saatini girin, artı ek 15 s lazer ısınma ve yıkama süreleri hesaba. Örnek bir çalışma listesine girmek satın almalar aynı sayıda (genellikle numaralar, yani 001, 002, vs.) ile (taramaları çalıştırmak sırayla yani), standart satır sayısı olarak.
  4. örnek için, Örnek baskılamak olacak çizgilerin sayısını eşleştirmek için (ek 15 sn dahil) toplam satın alma süresi ve satın almalar toplam sayısını alternatif bir dosya adı ile geçerli yöntem veya toplu kaydederek standartları için kullanılan yöntem yinelenen ve ayarlamak .
    NOT: En LA-ICP-MS sistemleri tek yönlü tetikleyici (LA ICP-MS tetikler) kullanmak gibi, ICP-MS yazılım ablasyon başlar sonraki satırından önce LA tetiği bekliyor esastır. ICP-MS edinim penceresi 'start almayı bekleyen' okuyacaktır.

5. Denemenizi Çalıştırma

  1. sıraya ilk yöntem veya toplu ekleyerek ICP-MS sıra başlatın ve yazılım LA sisteminden tetiği bekliyor emin olun.
  2. LA yazılımında, 'emisyon' tıklayarak lazer güç kaynağını etkinleştirmek 'koşmak' tıklayın ve uygun kutulara 20 saniye lazer ısınma 10 s zaman ve temizlenme zamanı ayarlayın.
    Not: Bu taşması olacaklazer ablasyon sonraki her satırı başladığında ICP-MS, yeni verilerin elde başlamak için hazır olduğundan emin olun.
  3. 'Başlangıç' tıklayarak lazer dizisi başlayın. İki ciltlik hücre kullanıyorsanız, numune kabı konumda olduğundan emin olun.

6. miktar tayini Standartları hesaplanıyor

NOT: görüntülere ICP-MS verilerini dönüştürmek için birden fazla varyasyon vardır. Bu açık kaynak dilleri 17, 24, 25, ticari makro 26 ve veri analizi yazılımı yazılı ev yapımı yazılım araçları kullanımını içerir. 7 Burada, özel bir LA-ICP-MS veri analizi paketi 28 dayalı (Paul ve ark. 27'de açıklanmıştır) yeni geliştirilen yazılım eklentisi kullanın.

  1. Bir run verilerini (001.d, 002.d, vb.) Içeren tüm toplu klasörleri üzerinde transferYüklü analiz yazılımı ile ayrı bir bilgisayar. Ayrı bir klasöre toplu her satırı için * .csv veri dosyalarını ayıklayın.
    NOT: otomatik olarak yeni bir klasöre * .csv dosya aktarmak için bir komut dosyası kullanma tavsiye edilir. Daha fazla bilgi için ekteki Python kodunu bakın. Bu komut ya bir Agilent 7700 veya 8800 Serisi ICP-MS uyacak şekilde kaleme alınmıştır, ancak diğer üreticilerin çıktı dosyasını uygun düzenlenebilir.
  2. yazılım platformu açın ve ithalat ve aşağıda tarif edildiği gibi nicel görüntüler üretmek için standartları analiz etmek sekmeleri sırayla izleyin.
  3. İlk standart toplu veri almak için, 'İthalat türü' için 'Dosya Türü' için 'Agilent .csv', 'Tüm klasör' seçin ve 'Tarih biçimi' bilgisayar formatı ile özdeş olup olmadığını kontrol edin. 'Al' düğmesine tıklayın standartların ilk seti için .csv dosyalarını içeren klasörü seçin ve 'altçizgilerin' sekmesine gidin.
  4. Baselineçıkarma
    1. 'Ithalattan Bilgiler' seçin ve 'Devam tıklayın Araç çubuğundaki ana uygulama açılır menüden' Otomatik seçmeler 'sekmesini (komut 2) kullanın.
    2. 'Tümünü Seç' ve entegrasyon için 'Baseline_1' seçeneğini tıklayın.
    3. İkinci değerler '0' ve girerek verileri kırpmak, (lazer ısınma süresi karşılık gelen) her tarama hattının ilk 10 sn seçmek için '(hat süresini - 10 ler)' ve ( 'entegrasyonları Ekle' tıklayın, örneğin bir 35 s tarama hattı için) değerlerin '0' ve '25' girin.
  5. Örnek verileri seçmek için, 6.4 anlatıldığı gibi 'Otomatik seçmeler' sekmesini kullanabilirsiniz, ancak entegrasyon 'OUTPUT_1' seçin. Başlangıçta ve her standart satırın sonunda ekin verileri (bir 35 s tarama hattı için örneğin girdiğiniz değerler '13' ve '4') arka plan sinyalini dışlamak için.
  6. Possi kaynaklanan sinyal damla hariç tutmak içinstandartlarda ble delikler, 'örneklerinde' sekmesinde, gürültü oranı (örneğin, C13 veya P31) yüksek bir sinyal ile bir kanal seçmek için grafik alanının sol üst köşesinde 'Kanallar' tıklayın. sinyali herhangi bir keskin damla not edin ve bu örneklerin içinde normal varyasyon altında yeterince düşük bir CPS değerini seçmek, ama yeterince yüksek sinyal keskin damla ortaya çıkarmak için.
  7. 'DRS' sekmesini tıklayın ve 'Güncel Veri Azaltma Programı' için 'Baseline_Subtract' seçeneğini seçin. Endeksi Channel 'için 6.6 kanal ve' düşük sinyalleri maskeleme Eşik kullanmak 'için CPS değerini seçin. ICP-MS için lazerden sinyal aktarımında gecikme için hesap 'düşük sinyaller önce / sonra Döşeme Saniye' için bir değer <0.5 sn yerleştirin.
  8. Düşük sinyal alanlarının yeterli maskeleme onaylamak için, 'numuneler' sekmesine geri tıklayın ve işlenmiş (örn., Fe56_CPS) kanal iz seçin. Tekrarlayın ve CPS ve & # rafine39; Saniye gerekirse 6.7 gibi düşük uydu sinyal değerlerine önce / sonra düzeltmek için.
  9. 'Sonuçlar' sekmesini tıklayın ve ana uygulama açılır menüden 'İhracat verileri' seçin. Sonuçların bir tablo veri dosyası (örneğin, Std1 hesaplamaları, Std2 ...) oluşturmak için bir dosya adı girin.
  10. Uygun bir tablo programında veri dosyasını açın ve her bir kanal Miktarını belirlemek üzere CPS değerlerini hesaplamak. Her ölçülebilir element için (ug g -1) ppm CPS değerlerinden dönüşüm faktörünü hesaplamak için çözüm nebülizasyon ICP-MS önceden belirlenmiş metal konsantrasyonları kullanın.
  11. vadede standartların tüm kümeleri için 6.10 - Tekrar 6.3 adımları.

7. Sayısal Görüntüler oluşturma

  1. yazılım açmak için komut istemine 'BioLite ()' yaz.
  2. fo .csv dosyalarını içeren 'Yük Görüntüler' tıklayıp klasörü seçerek örnek veri almakörnek resmini r.
  3. Zemin düzeltme
    1. numune için arka plan düzeltme uygulamak için 'taban çizgileri' sekmesini tıklayın. fosfor üzerinde (P31) görüntü ekranda istenirse, dikdörtgen çizmek aracını kullanarak arka plan seçin alanları. Sinyal / plazma sürüklenme bir görüntü çapında harita mümkün olduğunca çok sayıda bölgeleri oluşturur seçilmesi Bu faktörler yeterli tazminat sağlamak.
    2. , Arka plan sinyali daha görünür hale grafik düzenleme aracını seçmek için (üst görüntülenen resmin sol) ve sağ görüntüyü tıklatın. 'Görüntü Görünüm Değiştir' ve büyük bir negatif değer (örneğin -100000) için '= Z Birinci Renk' değiştirmek seçin. 'Bitti' seçeneğini tıklayarak devam edin.
  4. CPS / ppm düzeltme faktörleri için bir tablo getirmek için 'Standartları' sekmesini tıklayın. elemanların her biri için adım 6.10 standartlara hesaplanan değerleri girin. Bu adım ICP-MS hassasiyet sürüklenme düzeltmek için yardımcı olacaktır. 'Git tıklayın! '
  5. her elemanın ve her adım için görüntüleri tutar 'Data' sekmesinden, Aç 'Veri Tarayıcı ".
  6. ihracat için bir görüntü sonuçlandırmak için, 'StdCorrImages' klasöründe istediğiniz görüntüyü seçip görüntü adını (* _ppm) sağ tıklayın ve 'newImage tıklayın. Sağ tıklayın istenilen renk tablosu ve renk skalası seçmek için 'Görüntü Görünüm Değiştir' açmak için görüntü. resmi sağ tıklayıp 'Açıklaması ekle seçerek görüntüye bir renk skalası ekleyin. sol üst açılır menüden 'ColorScale seçin ve istenilen renk skalası değiştirmek için sekmeleri kullanın.
  7. Bir görüntüyü dışa aktarmak için, söz konusu görüntü seçili olduğundan emin olun ve 'Dosya' sekmesine gidin ve 'grafik kaydet ...'. istediğiniz formatı seçin ve görüntüyü kaydedin. Alternatif olarak, seçilen görüntü kopyalama ve yapıştırma araçları kullanılarak transfer edilebilir.
  8. Tekrarlayın ilgi tüm görüntüler için 7.6 ve 7.7 adımları tekrarlayın.
  9. QuantifYing ayrı ayrı bölümler
    1. YG araçlarını etkinleştirmek için, 'Analiz' sekmesinde, 'paketler' gidin ve 'Görüntü İşleme' seçeneğini seçin.
    2. İstediğiniz görüntüyü seçin ve 'Resim' sekmesine gidin ve 'ROI ...'. 'Start ROI beraberlik tıklayın ve örnek bir ilgi bölgeyi seçmek için bir çizim aracını kullanın. Çizimi bitirmek için, 'Bitir ROI tıklayın.
    3. Seçilen ROI için istatistikleri elde etmek için, 'Resim' sekmesine gidin ve 'istatistik ...'.
    4. Kopyala ve ayrı bir elektronik tabloya sonuçları yapıştırın. tüm bölgeler ve ilgi elemanları için tekrarlayın ROI seçimi (7.9.2).

Sonuçlar

Bu LA-ICP-MS görüntüleme yaklaşımının yeteneklerini göstermek için, koronal planda korpus kallosum de ikiye ve kesitli bir WT C57BL / 6 fare beyninin tek bir bölümünü kullanarak basit bir deney sunulmuştur. Analiz bölümü (Şekil 2), metal dağılımının temsili bir görüntüsünü temin etmek için hem de, Bölüm 6 ve 7'de tarif edildiği gibi BioLite (Şekil 1) kullanılarak, veri analizi için bir iş akışı, aynı zamanda açıklanmaktadır.

Görüldüğü gibi, fare beyninde metal dağıtım anatomik bölgeye göre değişkendir. Bu değişken roller metallere bağlanabilir ve daha özel olarak protein bağlı oldukları için, her beyin bölgesi 27 görüntülemektedir. Örneğin, demir, çinko Corti'den en bol ise, orta beyin ve dentat girus birlikte yüksek konsantrasyonlarda eğilimical alanları. Yaygın olarak kullanılan bir iç standart 8 karbon, homojen dağıtılır. Metallerin ko bilgiler özel metal bağlayıcı proteinlerin ifade bir beynin içinde metallerin fonksiyonu içgörü sağlayabilir edebilir mevcut anatomik ve fonksiyonel referans atlasları 29 ile birlikte kullanıldığında Elemental haritalar (Şekil 2) özellikle yararlı olabilir bölgesi veya bir tespit hastalıkla ilişkili biyomolekülün uygun metal düzeylerindeki değişiklikler. analitlerin, daha geniş bir aralığı için optimize edilmiş açıklanan yaklaşım kullanarak, mangan gibi düşük bolluk elemanları duyarlılık engel yapar ve yöntemler diğer ölçülen kitlelerin pahasına bekleme sürelerini arttırarak bu analitin odaklanabilmenizi uyarlanabilir.

LA-ICP-MS ile görüntüleme kullanarak büyük avantajı metal concentr göreli farklılıkları gözlemleyerek olduğunutirme ve deney grupları arasında dağılımı. Biz daha önce artan PD 2, 10 taklit bir nörotoksin hakaret aşağıdaki demir ve insan Alzheimer hastalığı dokusunda 21 kortikal demir düzeylerindeki değişimlerin göstermek için böyle bir teknik kullandık. Burada tarif edildiği gibi bir protokol kolayca belirtilen yöntemlere az değişikliklerle başka doku tipine adapte edilebilir.

figure-results-1
Şekil 1: Görüntü İşleme için iş akışı. fare beyin metal dağılımının niceliksel resimlere ICP-MS ham zamana bağımlı veri dönüştürme gösteren Bölüm 6 ve 7, tamamlayıcı iş akışı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: bir fare beyni içinde Biyo tipik Element dağılımı. LA-ICP-MS ile analiz tek bir fare beyin yarımkürede bir 30 mikron kalınlığında koronal bölümünün temsilcisi eleman haritaları. (Üst satır); Karbon-13 (C13), magnezyum-24 (MG24) ve fosfor-31 (P31) için Görüntüler Altın renkli pullarla (CPS saniye başına sayım) görüntülenen. Mangan-55 (Mn55), bakır-63 (Cu63), demir-56 (Fe56) ve çinko-66 (Zn66) kantitatif görüntüleri (alt sıra) karşılık gelen BlueHot renk ölçekleri (mikrogram g -1) görüntülenir. Beyin bölümü için toplam analiz süresi yaklaşık 5 saat oldu. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Kod veri çıkışı ICP-MS üreticinin yöntemine göre uygun bir Python editörü kullanılarak değiştirilebilir 6.1 de açıklandığı 1. Açık kaynak Python kodu, dosya. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Tartışma

Nörolojik dokusunda görüntüleme metaller bu protokol herhangi bir biyolojik matris içinde metallerin dağılımı ve miktarı hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir nasıl sadece bir örnektir. standart referans malzemelerin hazırlanması zorlu olabilir rağmen, bir kez gerçekleştirilir ve daha sonra kullanılmak üzere arşivlenebilir bir deneydir.

LA-ICP-MS, çoğunlukla erişilebilirlik ve duyarlılık açısından böyle sinkrotron tabanlı X-ışını floresan mikroskop gibi alternatif yöntemler üzerinde bazı avantajlara sahiptir. Ancak, LA-ICP-MS kullanılarak bir deney hazırlanırken dikkate alınması gereken bazı dezavantajları vardır, ve gibi genellikle alternatif metal analiz teknikleri yanı sıra karşılaştırmalı histokimya 5 içerir kimyasal görüntüleme için yararlı bir tamamlayıcı bir tekniktir.

fare beyninin bilinen anatomik özellikleri ile uyum olası fonksiyonel relati hakkında yararlı bilgiler sağlayabilirmetal düzeylerinin ve mekansal dağılımı arasındaki öğrenmekten yararlanma. Daha önce, Allen Beyin Atlas online kaynak, hem metal bağımlı enzim ifade 14 ve nöroanatomi 27 uzaysal korelasyonu incelemek için C57BL / 6 fare beyninde hem anatomik ve gen ifade verilerinin açık erişim depodur 29 kullandık, 30. Böyle Kemirgen Beyin WorkBench 31 gibi diğer kaynaklar da genellikle küçük anatomik bölgelerde metal dağılımının doğru teşhisinde yardımcı olmak için kayıt ve metal görüntüleri hizalama yardımcı vardır.

Bu tekniğin Uygulamaları, normal yaşam olayları hem boyunca mikroölçeklerde nasıl metal düzeyleri ve dağıtım değişikliği değerlendirmede yararlıdır (örneğin, yaşlanma) ve hastalık durumlarında; olarak tasarlanan iki metal ihtiva eden bileşikler ve uyuşturucu etkilerini araştırmak beni hedeftal metabolizması. mekansal metal dağılımı değerlendirmek için bir görüntüleme tekniği olarak LA-ICP-MS mevcut büyük sınırlamalar çıktı ve hassasiyet vardır. Uzun analiz süreleri gerektiren yüksek çözünürlüklü görüntüleri ile analiz hızı ve uzamsal çözünürlük 5, 12 arasında bir değiş tokuş vardır. manganez, kobalt ve selenyum gibi elementler ICP-MS ile bunların tespit normal doku ve / veya sınırlamalar düşük çokluğu nedeniyle sınırlıdır da teknik, yüksek konsantrasyonlarda biyolojik elemanları uygundur. Bu tür üçlü dört kutuplu kütle analizörleri giriş olarak ICP-MS teknolojisinde yeni gelişmeler, yüksek hassasiyetleri 33 böyle selenyum 32 gibi zor analit, hedeflenen tespiti için izin verir. Bir teknoloji odaklı bir prosedür olarak, artan teknik gelişmeye devam bu görüntüleme göreceksiniz lazer ve kütle spektrometresi tasarımı hem de gelişmeleranaliz ve duyarlılık 34 hızı.

Açıklamalar

RWH ve COC, ESI Ltd.'nin ücretli çalışanlarıdır. FF ve TPH, Agilent Technologies Australia'nın ücretli çalışanlarıdır.

Teşekkürler

DJH ve PAD Almanya'nın Mükemmellik Girişimi [DFG GSC 98/3] tarafından finanse Ruhr Üniversitesi Araştırma Okulu PLUS, tarafından desteklenmiştir Agilent Technologies ve ESI Ltd. BK katılım Avustralya Araştırma Konseyi Bağlantı Projesi (LP120200081) tarafından desteklenmektedir. DJH kısmen Ramaciotti Vakfı tarafından desteklenmiştir. KK Sigrid Juselius Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Soda cam mikroskop slaytların/an/aTipik slaytlar tüm deneyler için uygundur
PTFE kaplı mikrotom bıçaklarıC.L. StuckeyDT315R50Bıçak boyutu kriyostat bıçak tutucusuna bağlıdır. Sipariş vermeden önce kontrol edin.
Parafomaldehit (PFA)Sigma-Aldrich16005Uygun herhangi bir tedarikçi
Sükrozn/an/aTicari sınıf beyaz şeker uygundur
Fosfat tamponlu Salin (PBS)Sigma-AldrichP5368Listelenen önceden karıştırılmış poşetler, normal laboratuvar protokollerine göre hazırlanabilir
XyleneSigma-Aldrich247624Herhangi bir tedarikçi uygun
EtanolSigma-AldrichE7023Herhangi bir tedarikçiye uygun
Kuzu beynin/an/aÇoğu yerel kasaptan temin edilebilir
Metal tuzların/an/aİstenilen analitleri içeren suda çözünür metal tuzları kullanın
Omni TH Doku HomojenizatörüOmni IncTHP115Alternatif homojenizatörler uygundur
Polikarbonat homgenizatör problarıOmni IncTH115-PCRH
Mikrodalga parçalama ünitesin/an/aİsteğe bağlı. Bkz. Bölüm 2
1,5 mL mikrofüj tüpleriTechnoPlasP4010Metal içermeyen polipropilen tüpler. Asitle yıkanmış tüpler de uygundur
%65 nitrik asitMerk Millipore100441İz analiz sınıfı
%30 hidrojen peroksitSigma-Aldrich95321İz analizi sınıfı
10 x 10 mm tek kullanımlık kriyokalıplarTed Pella27181
İzopentanSigma-Aldrich76871
Sıvı nitrojenn/an/a Kullanım yerel tedarikçi
NWR213 Lazer Ablasyon sistemiESI Ltdn/aBu deneylerde kullanılır. Uygun olan diğer üreticiler, protokolde değişiklik yapılmasını gerektirebilir
Agilent 8800 Serisi ICP-MSAgilent Technologiesn/aBu deneylerde kullanılır. Uygun olan diğer üreticiler, Iolite
IoliteYazılımın/ahttp://iolite-software.com/'dan edinilebilir. Diğer yöntemler mevcuttur, protokole
bakın ExcelMicrosoft yok
IGOR ProWave Metricsyok https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm'dankullanılabilir
protokolünde değişiklik yapılmasını gerektirebilir

Kaynaklar

  1. Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
  2. Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
  3. Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
  4. New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
  5. Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
  6. Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
  7. Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912(2005).
  8. Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
  9. Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
  10. Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53(2009).
  11. Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690(2008).
  12. Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159(2012).
  13. Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson's disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
  14. Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
  15. Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
  16. Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
  17. Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
  18. Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
  19. Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
  20. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
  21. Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
  22. Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
  23. Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
  24. Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
  25. Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis - An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
  26. Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
  27. Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
  28. Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508(2011).
  29. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  30. Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
  31. Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4(2007).
  32. Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
  33. Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements - a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
  34. Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lazer Ablasyonlu ICP MSBeyin Dokusu Metal G r nt lemeKantitatif Metal AnaliziDoku Kesiti AnaliziMetal Da l m HaritalamaDemir Bak r inko TespitiNumune Haz rlama ProtokolVeri leme Yaz l mROI Analiz Y ntemiN rodejeneratif Hastal k Ara t rmalar

İlgili makaleler