Method Article

Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

DOI:

10.3791/55051

⸱

January 4th, 2017

 ,  , 
1School of Biochemistry, University of Bristol

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı matris, hücrelerin mikro ortamını tanımlamada ve hücre davranışını ve fenotipini modüle etmede önemli bir rol oynar. Mikroskobik, biyokimyasal, proteomik veya fonksiyonel çalışmalar için farklı ölçeklere uyarlanabilen, hücre kaynaklı hücre dışı matrisin izolasyonu için hızlı bir yöntem tarif ediyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı matriks (ECM), çoklu hücre fizyolojik ve patolojik süreçlerinde yer alan çeşitli, dinamik ve karmaşık bir ortam olarak kabul edilir. Bununla birlikte, ECM'nin dokulardan veya hücre kültüründen izolasyonu, monte edilmiş ECM'nin çözünmez ve çapraz bağlı doğası ve ECM ekstraktlarının hücre yüzeyi ve hücre içi proteinlerle potansiyel kontaminasyonu nedeniyle karmaşıktır. Burada, aşağı akış deneyi için hücreden türetilmiş bir ECM'yi izole etmek için hücreleri hızlı ve güvenilir bir şekilde çıkaran kültürlenmiş hücrelerle kullanım için bir yöntemi açıklıyoruz.

Bu yöntemin kullanılmasıyla, izole edilmiş ECM ve bileşenleri, yerinde immünofloresan mikroskobu ile görselleştirilebilir. Spesifik ECM proteinlerinin dinamikleri, hücrelerin çıkarılmasından önce ve sonra floresan mikroskobu kullanılarak etiketlenmiş bir proteinin birikiminin izlenmesiyle izlenebilir. Alternatif olarak, izole edilmiş ECM, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve immünoblotlama gibi biyokimyasal analizler için ekstrakte edilebilir. Daha büyük ölçeklerde, kütle spektrometresi ile izole edilmiş ECM'nin tam bir proteomik analizi yapılabilir. Steril koşullar altında ECM izolasyonu gerçekleştirilerek, ilgilenilen herhangi bir hücre ile fonksiyonel veya fenotipik çalışmalar için steril ECM tabakaları elde edilebilir. Yöntem, herhangi bir yapışık hücre tipine uygulanabilir, gerçekleştirilmesi nispeten kolaydır ve geniş bir deneysel tasarım repertuarına bağlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç on yıl içinde, hücre dışı matriks (ECM) çoklu hücre fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol alan bir, çeşitli dinamik ve karmaşık bir ortam olarak kabul haline gelmiştir. Doku düzeyinde, ECM hücre sinyallerini, motilite, farklılaşma, anjiyogenez, kök hücre biyolojisi, tümörogenez, fibrozis, vb 1,2 etkiler. ECM organizasyon ve ECM-bağımlı süreçlerin çalışma böylece hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi için geniş etkileri vardır. ECM kompozisyon, organizasyon ve fonksiyonel özellikleri bir mekanistik anlayışa ulaşmak, ECM doğru izolasyon yöntemleri gereklidir. Doku 3 izolasyon güvenilemez ECM proteinleri erken tespiti ise, kültürlenmiş hücrelerden ECM'nin hazırlanması artık daha yaygın hale gelmiştir.

hücre kökenli ECM izolasyonu ve analiz iki ana nedenden dolayı karmaşıktır. İlk olarak, hücrelerin varlığı veir bol hücre içi proteinleri zor bir ayrık hücre dışı bir yapı olarak ECM izole etmek yapabilirsiniz. Gerçekten de, bazı ECM proteinleri hücre içinde hem de ECM 4 rollere sahiptir; ECM içinde proteinlerin çalışma, hücre içinde kendi rolleri ile karıştırılmamalıdır Bu nedenle, hücre kaynaklı ECM'den hücre içi proteinlerin etkili şekilde uzaklaştırılması önem taşımaktadır. İkinci olarak, hücre-türevi ECM genellikle kovalent olarak çapraz bağlantılı ECM montajı üzerine ve standart deterjanlarda nedenle çözünmeyen birçok büyük, oligomerik proteinler, oluşmaktadır. Bu özellikler çıkarma ve ECM daha fazla analiz karmaşık hale getirebilir. Bu sorunları çözmek için, bir yöntem olup, hücresel bileşenlerden ECM proteinlerinin verimli ayrılmasını sağlayan gereklidir.

Çeşitli yöntemler, hücre kültürü veya doku ekstreleri ya ECM izolasyonu için literatürde tarif edilmiştir. Bu yöntemlerin birçoğu bol ECM pr çıkarılması hedefleniyorotein dokulardan kollajen ve nötr tuzlar 3, asidik koşullar 5,6 veya pepsin 7 kullanımını içerir. Doku özütlerinin toplam ECM izolasyonu genellikle önceden ECM izolasyonuna doku decellularization içerir. Örneğin, bir sıralı özütleme yöntemi, insan kardiyak doku 8 ECM izole tarif edilmiştir. İlk olarak, gevşek bağlı ECM proteinleri sodyum dodesil sülfat (SDS) önce, 0.5 M NaCI ile ekstre edildi hücreleri çıkarmak için kullanılmıştır. Son olarak, kalan ECM proteinleri 4 M guanidin 8 ile ekstre edildi. ECM ayrıca 8 M üre 9 kullanarak hücresizleştirilmiş örneklerinden çözündürülebilir. Diğer teknikler santrifüjleme ile çözünür hücre lizatından çözünmeyen ECM proteinlerinin ayrılması önce her iki hücreleri ve ECM çıkarmak için, örneğin deoksikolik asit 10 olarak deterjan kullanımı.

izolasyon ve bu raporda açıklanan hücre kökenli ECM analizi için yöntem Repro sağlarhücre malzemenin çıkartılması in situ imünofloresansta analiz ya da daha fazla biyokimyasal analiz için elde edilebilir hücresinden türetilmiş ECM bırakmak için tekrarlanabilir bir yöntem. Bu yöntem, herhangi bir yapışık hücre tipi için uyarlanabilir ve immunoblotting ya da kütle spektrometrisi, veya fonksiyonel çalışmalarda izole ECM'nin kullanımı için alt-prosedürler için ölçeklenebilir. Yöntem ayrıca, gerçek zamanlı olarak ilgi konusu bir etiketli protein ECM birikmesini izlemek için canlı hücre konfokal mikroskobu ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bu ızgaralı cam tabanlı bir çanak kullanımı ile elde edilir. Genel olarak, yaklaşım, hücre-türevli ECM ve tespit etmek ve çökelmesini ve bireysel ECM proteinlerinin dinamiklerini izlemek için kapsam doğru bir izolasyon sağlar.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amonyum hidroksit çözeltisi ile Hücreleri 1. Temizleme

  1. Uygun Yoğunluk Kaplama ile yapışmış Hücreler hazırlayın.
    NOT: Hücreler analiz için yeterli ECM üreten herhangi yapışık hücre türü olabilir. Burada, COS-7 hücreleri, SV-40 viral DNA dizilerini içeren bir Afrika yeşil maymunu böbrek fibroblast benzeri hücre hattı kullanımını tarif; RCS, bir sıçan kondrosarkom hücre hattı; ya da normal insan dermal fibroblast (HDF) çocuk sünnet derisi dan zorlamaktadır. HDF geçit 1 geçişin 8 sadece kullanılır.
    1. Sabit ECM'nin floresan mikroskopi çalışmalarda için canlı hücre ECM, görüntüleme için lamelleri, hücreler plaka, ya da küçük çaplı, işlevsel tayinler için, hücre-türevli ECM'nin hazırlanması için kullanılmasıdır. SDS-PAGE analizi, immunoblot veya proteomik çalışmaları için hücre kültür kaplarına, hücreler plaka.
      Not: Hücre kültür koşulları (plaka hücreleri ve kültür ortamı sayısı), hücre tipine bağlı olacaktır. plakasına hücre sayısı gerekecektirözel bir hücre hattına veya hücre suşu için empirik olarak tayin edilebilir.
    2. Hücreler, genellikle> 16 saat ECM yatırmak için uygun bir zaman tanıyın. NOT: süre hücre tipine bağlı olacak ve ampirik olarak tespit edilmesi gerekir. ektopik ifade yapılması halinde, ilgi konusu transfekte edilmiş proteinin ekspresyonu için ECM birikim için uygun olan bir zaman sağlar.
  2. Bir aspiratörün içinde, deiyonize H2O ile stok çözeltisinden 1/14 seyreltilerek Uygun bir kap içinde, 20 mM amonyum hidroksit Hazırlama
    1. inkübatör hücreleri kaldırın ve yavaşça kültür ortamı çıkarın. Hafifçe çanak duvarlarına karşı dökülerek Ca 2 + / Mg2 + içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. iki çanak Kaya ve plastik bir transfer pipet ile sıvı çıkarın. iki kez daha tekrarlayın.
  3. Bir aspiratörün olarak, her yemeğin eğin ve plastik bir transfer pipet ile adım 1.2 den PBS kaldırmak. 3 ekle100 mm tabak başına amonyum hidroksit ml ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe. 5 dakikalık kuluçka süresi boyunca, yavaşça tüm hücrelerin parçalama sağlamak için çanak her dakika çalkalayın. Adım 1.4-1.7 aspiratörün içinde gerçekleştirilecektir.
    Not: Alternatif hücre çıkarma reaktifler, 10 dakika için hücreler ile kuluçkalanmıştır 2M ya da 8 M üre içermektedir.
  4. Sallanan, her tabak 100 mm tabak başına en az 20 mL deiyonize H2O bol miktarda ekleyin. Hidroksit çözündürülmüş malzeme olan amonyum hidroksit, lize edilmiş hücrelerden ve deiyonize edilmiş H2 oluşan bir transfer pipeti ile aspirasyon O-ile amonyuma şekilde atın. Sıvı atıklar için bir kap içine bu atık çözüm aktarın.
  5. Tüm amonyum hidroksit çözülmüş malzemenin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için bol deiyonize H2O dört kez daha çözünmeyen ECM tabakası yıkayın.
  6. immünofloresan ECM incelenmesi için,% 2 ekleyerek ECM düzeltmekparaformaldehit (PFA, 100 mm tabak başına 3 mL), 10 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır.
    Dikkat: PFA cilt veya göz teması ve akciğer hasarı, boğulma, bilinç kaybı, ya da ölüm üretebilir şiddetli Aşırı maruz kalma durumunda çok tehlikelidir. Bu sadece bir aspiratörün ele alınmalıdır ve kişisel koruyucu donanımlar giyilmelidir.
  7. Adım 1.2 gibi PBS ile iki kez her sabit bir örnek yıkayın ve uygun bir sıvı atık kabı içine PFA çözümün atmayın. Gerekirse, floresan mikroskobu için hazırlamadan önce, 4 ° C de PBS içinde ECM örnekleri saklayın.

Canlı hücreler Konfokal Mikroskopi Görüntüleme tarafından ECM Protein 2. Takip Biriktirme

  1. Bir hemasitometre altında hücreleri saymak. COS-7 hücreleri için, transfeksiyon için bir 60 mm hücre kültür çanağı üzerine 250.000 hücre plaka.
    Not: canlı hücre görüntüleme için, hücreler genetik olarak kodlanmış floresan ile çerçeve içinde kaynaşık ilgi ECM proteini kodlayan bir vektör ile transfekte edilebilir olmalıdırnt etiketi. Bu canlı hücre görüntüleme sırasında ilgilenilen ECM protein tanımlanmasını sağlamaktır.
  2. Görüntüleme için 35 mm Gridlenmiş, cam tabanlı tabak üzerine protein ekspresyonu (örneğin, 16 saat) uygun bir süre sonra, Tripsin-EDTA çözeltisi ile çanak hücreleri çıkarmak bir hemositometrede saymak ve plaka ~ 150,000 hücre. hücreler 2 saat yeniden bağlanması için izin verme ve ECM çökelmesini başlatmak için (süre hücre tipine bağlı olacak ve deneysel olarak tespit edilmelidir).
    NOT: Bu resim kalitesini etkiler kırmızı bir renk elde gibi, fenol kırmızısı içermeyen bir hücre ortamı kullanın.
  3. Yukarıdaki 2 saatlik bir süre boyunca, 37 ° C inkübatör odası ve bir CO2 kaynağı olan konfokal mikroskop ayarlayın. odasında ve çanak sıcaklık görüntüleme önce 37 ° C stabilize etmek için izin ver; Bu 1 saat kadar sürebilir.
  4. 30 dakika boyunca bir flüoresan hücre belirteci ile çanak Gridlenmiş 35 mm üzerine kaplama hücreleri inkübe edin. Ardından, hücreleri yıkayıniki görüntü vermeden önce fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı içinde.
    NOT: sitoplazmik floresan markör, hücre hacimleri görselleştirmek için kullanılabilir, ya da bir zara içeren işaretçi hücre kenarları görselleştirmek için kullanılabilmektedir.
  5. konfokal mikroskop 20X objektif ve faz kontrast kullanarak, bir numara (> 3) yapışık, sağlıklı hücreleri içeren uygun bir ızgara kare tanımlar. 63X veya 100X hedefleri ve floresan mikroskobu altında uygun dalga boylarını kullanarak seçilen ızgara kare içinde hücrelerin seçiminde hedef proteinin ifadesini onaylayın.
  6. z-yığın yazılımı kullanarak floresan ve faz-kontrast time-lapse görüntüleme ayarlayın. sadece hücre gövdesi üzerinde olması sadece ECM tabaka ve "End" yığının altında olması "Begin" yığınını ayarlayın. hücre tipine bağlı olarak, 0.3 um Z adımlı boyutu ve toplam 5 um bir ila 10 derinliğe z seviyesini ayarlayın. Bu zaman noktası başına 15-30 z bölümleri arasında verecektir.
  7. Capturperiyodik bir dizi bir süre boyunca ve faz kontrast görüntüleri (kırmızı floresan proteini (RFP), uyarma = 555 nm ve emisyon = 584 nm için) e floresan. Örneğin, 2 dk zaman aralığı ve 2 saat süresini belirlemek için time-lapse yazılımı kullanın. belirlenen süre içinde z-bölüm görüntüleri yakalama başlamak için "start" düğmesine basın.
  8. ECM daki floresan etiketli protein lokalizasyonu teyit etmek için, adım 1.1-1.5 tarif edildiği gibi bir süre sonunda, çanak hücreleri çıkarmak.
  9. İlgili ızgara kare taşınmaya faz-kontrast görüntüleme ve 20X objektif kullanın.
  10. 63X objektif geçin ve floresan mikroskobu altında ECM tabakası tespit. ön-ekstraksiyon görüntü bu görüntü karşılaştırın

Hücre Fonksiyonel Tahliller için Hücre türetilen ECM 3. Steril hazırlanması

  1. lamelleri ve başka populasyona üzerindeki hücrelerin bir nüfusu ( "matris yapımcı" hücreleri) büyütünlasyon en az 24 saat süre ile 100 mm hücre kültür çanağı standart kültür ( "test" hücreleri) içerir.
    Not: Bu, herhangi iki farklı yapışık hücre tipi olabilir ve deney tasarımı floresan etiketli ECM proteini ifade etmek için, bir ya da her iki hücre popülasyonlarının transfeksiyonunu kapsayabilmektedir.
  2. Bir laminar akış başlığı içinde, hücre kültürü için kullanıldığı haliyle, Ca2 + olmaksızın PBS steril çözeltiler hazırlanması steril 0.2 her geçen 2 O / Mg2 +, 20 mM amonyum hidroksit (adım 1.3), ve de-iyonize H uygun bir steril kap içine mikron filtre.
  3. steril teknik bakımı, nazikçe steril PBS (adım 1.2) ile lamelleri üç kez "matris yapımcı" hücreleri yıkayın.
  4. steril bir pipet ile aspirasyonu ile PBS kaldırmak ve uygun bir sıvı atık kabına onu atmayın. 20 mM steril amonyum hidroksit (3 mL / 100 mm tabak) ekleyin ve aralıklarla sallanan 5 dakika boyunca inkübe.
  5. bol miktarda ekleyinSteril deiyonize H "matris üretici" çanak 2, O, en az 20 sallanan 100 mm tabak başına mi, ve uygun bir atık kabına hücre lizatının uzaklıkta dökün.
  6. Adımı tekrar 3.5 dört kez daha amonyum hidroksit çözülmüş malzemenin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için.
    NOT: lamelleri "matris yapımcı" hücreler tarafından yatırılan ECM ilgi herhangi bir test hücreleri ile fonksiyonel testleri için steril bir ECM sağlar.
  7. 100 mm tabak başına tripsin-EDTA çözeltisi 1.5 mL hücre hazır yemek test hücreleri inkübe test hücreleri tabak ayrılır kadar (% 0.05 w / v tripsin ve% 0.02 w EDTA h / Hank dengeli tuz çözeltisi içinde) . Hücre orta ekle 5 dakika boyunca 400 xg'de Test hücreleri santrifüj ve süpernatant sıvı kaldırmak.
  8. Taze, steril bir ortamda test hücrelerinin yeniden süspanse edin ve bir hemositometrede say. coversli steril, izole ECM üzerine bu test hücrelerinin uygun sayıda Plateps. 2-3 saat için ya da deney tasarımı için gerekli bir süre için uygun hücre ortamı içinde kültür bunları.
  9. , Aktin hücre iskeletinin organizasyonunu incelemek% 2 test hücreleri düzeltmek PFA ve floresein izotiyosiyanat ile leke (FITC) -phalloidin (uyarma = 490 nm ve emisyon = 525 nm) görselleştirmek için F-aktin ve 4 ', 6 -diamidino-2-fenilindol (DAPI; uyarma = 358 nm ve emisyon = 461 nm) çekirdekleri 11 görselleştirmek için.
    NOT: Kendi GİP'te kaplama testi hücreleri ile heterolog hücre kaynaklı GİP'te kaplama testi hücreleri morfolojisi ve aktin organizasyonu karşılaştırın.

SDS-PAGE, imüno-lekeleme analizi veya proteomik ECM'nin 4. Yalıtım

  1. sekresyon ve ECM çökelmesini sağlamak için, hücre tipi için uygun bir şekilde, 24-96 saat boyunca 100 mm'lik bir hücre kültür tabaklarında (proteomik için 5 ile 10 yemekleri ve bağışıklık boyama için 1-2 yemekler) üzerine çıkar yapışmış olan hücrelerin büyütün.
  2. descr olarak hücreleri çıkarınadımda 1.1-1.5 anlatılagelmiştir.
  3. Çanak alt bakiye H2O boşaltmak için bir açı her levha eğim ve plaka tamamen kuruyana kadar dikkatlice P200 pipet ile kalan H2O çıkarın.
  4. Buna paralel olarak, ısı, SDS-PAGE numune tampon maddesi, bir ısıtma bloğu kullanarak 2 dakika boyunca 95 ° C'de 100 mM ditiyotreitol (DTT) içeren ve daha sonra plaka ekleyin. Numuneler İmmunoblotta tarafından muayene edilmesi için 100 mm plaka başına numune tamponu 200 uL uygundur.
    1. kütle spektrometrisi ile ECM analiz etmek için, (aşağıdaki adımları 4,5 4,6, tarif edildiği gibi) çanak SDS-PAGE numune tampon toplayarak daha konsantre bir örnek elde, 95 ° C'ye kadar yeniden ısıtma ve boyunca aynı kısım kullanılarak 2-3 ek plakalar.
  5. iyice yemeğin tüm alanları kazınmıstır sağlanması, çanak kapalı ECM kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
  6. hücre kazıyıcı ile, yemeğin bir tarafına örnek toplamak ve 200 ile kaldırmaBir tüp içine uL pipet.
  7. ECM madde kaybını en aza indirmek için bir tüp içine hücre kazıyıcı ucundan herhangi bir kalıntı, SDS-PAGE numune tampon maddesi özü aktarın. konsantre örnek için, 95 ° C'ye kadar, aynı SDS-PAGE numune tampon maddesi kısım yeniden ısı ve 2-3 ilave plakalar arasında da yeniden kullanımı.
  8. % 7 veya% 4-7 gradyan poliakrilamid jeller kullanarak SDS-PAGE 12 ile ECM proteinleri giderin.
    NOT: öncesi lekeli protein belirteçlerinin kullanmak daha uygun olur.
  9. yüksek moleküler ağırlıklı ECM proteinlerinin çözünürlüğünü artırmak için, 37 kDa'lık bir moleküler ağırlık markörü yakın jel ve moleküler ağırlık işaretçileri <37 kDa alt çalışan jel kaçıp ki bu jel çalışma süresini uzatır.
  10. ECM proteinleri proteomik analizi için, bir protein leke ile jel leke ve bir görüntü yakalamak. Jelden ilgi bant kesme tripsin ile sindirilmesi ve matris destekli lazer desorpsiyon ile analiz / iyonizasyon (MALDI) -Kitlesel spektrometrisi 13.
  11. Seçenek olarak ise, ECM özü daha kapsamlı bir analizi için ve tüm numune analiz için bölümlere jel şerit dilim, tripsin ile sindirilmesi ve sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) 14 gerçekleştirin.
  12. Seçenek olarak ise, 15 immün için, yüksek moleküler ağırlıklı ECM proteinlerinin transferi sağlamak için en az 1 saat 10 dakika boyunca (yarı-kuru metodu) 15 V de poliviniliden florit (PVDF) membran üzerine SDS-PAGE jeli proteinleri aktarmak . Bir Ponceau S boyası ile membrana aktarılır total protein gözünüzde canlandırın.
  13. Adım 4.11 takiben, varlığı kurmak ve / veya bireysel ECM proteinleri 15 bir yarı-kantitatif analiz yapmak antikorlar kullanır.
    1. gece boyunca 4 ° C'de% 2 TBS-Tween 20 (blokaj tampon çözeltisi) içinde (ağırlık / hacim) süt ile membran bloke. bloke edici tampon içinde ECM proteinleri için spesifik antikorlar seyreltin ve fib (oda sıcaklığında 1.5 st için membran ile antikorun inküberonectin trombospondin-1 1/150 seyreltilmiş için 1/600 ve antikorun seyreltildi; Ek Tablo 1).
    2. Böyle aktin veya tubulin (anti-aktin 1 / 10.000 seyreltilmiş ve anti-tübülin 1 / 5.000 seyreltilmiş) gibi bol hücre içi proteinlerine karşı antikorların aynı blot yeniden sondalama ile ECM izolasyon kalitesini test.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

açıklanan protokol hücreleri çıkarmak ve hücre kökenli ECM geride bırakmak için 1.1-1.5 eylemleri adımları. Protokol COS-7 hücreleri cam lameller üzerine 96 saat için büyütülmüştür üzerinde gerçekleştirilmiştir ve hücre-türevi ECM floresan mikroskobu ile analiz edildi. DAPI ve falloidin boyama sırasıyla (Şekil 1) 'e göre, hücre çekirdeğinde aktin hücre iskeletinin kaybı ile oluşturulan amonyum hidroksit ile işlem, etkili bir şekilde hücre çıkarıldı. 2 M üre ile hücrelerinin alınması amonyum hidroksit kadar etkili değildir; DAPI ve Phalloidin boyama izleri tedavi sonrasında tespit edildi. 8 M üre amonyum hidroksit benzer bir etkiye (Şekil 1) vardı. Daha sonra, hücre kökenli ECM amonyum hidroksit, tedavi öncesi ve sonrası görselleştirildi (2.1-2.11 adım). COS-7 hücreleri bir monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) ile transfekte edildi trombospondin-1 C-terminal trimer (mRFPovTSP1C) 1 etiketli1 ve ızgarah cam tabanı ile 35 mm çanak yetiştirilen.

mRFPovTSP1C ifade eden çok sayıda sağlıklı hücreleri içeren iki saat sonra kaplama, uygun bir ızgara kare konfokal mikroskop altında görüntülendi. Bir referans resmi, faz kontrast bu alanda alındı ve daha sonra, floresan zaman atlamalı görüntüleme, 2 saat (Şekil 2A) her 1 dak gerçekleştirilmiştir. Hücreler daha sonra, amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve çanak aynı ızgara kare faz kontrastı altında taşındı ve floresan mikroskobu ile yeniden analiz edilmiştir. Hücreler artık kılavuz kare mevcuttu, fakat mRFPovTSP1C karakteristik puncta (Şekil 2A) ve floresan mikroskobu ile tespit ECM içinde kalmıştır. Hücre çıkarılması öncesinde ECM yatırılır herhangi mRFPovTSP1C floresans model öncesi ve hücre sonrası kaldırma karşılaştırarak tanımlanmıştır. Her iki görüntüde tespit flüoresan puncta (Figu2A yeniden, örneğin ok) ECM ile ilişkili olduğu çıkarılmaktadır.

Amonyum hidroksit ile işlem daha sonra kültür, yapışkan hücrelerden alınan yerel ECM izole etmek için kullanılmıştır. İnsan dermal fibroblastları (HDF) 96 saat boyunca cam lameller üzerinde büyütüldü. Hücreler, amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve ECM karakteristik fibril ve ağ örgüsü boyama kalıbı 16 (Şekil 2B) göstermektedir, bir anti-kollajen I antikoru ile problanmıştır. Fibronektin model verme RCS hücreleri (Şekil 2C) çıkarılmasından sonra yaklaşık sabit olmayan permeabilize fare kondrosarkom hücreleri (RCS) ve ECM içinde incelenmiştir. "Test" hücreler fenotipik veya fonksiyonel çalışmalar için ECM üzerine yeniden kaplanabilir böylece ECM'nin amonyum hidroksit izolasyonu steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Örneğin, "test" COS-7 hücreleri, steril RCS hücreleri tarafından üretilen ECM ve t üzerine, 2 saat için kaplanmıştırTavuk kendi ECM üretiminde COS-7 hücreleri (3.1-3.9 adımlar) (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında, sabit geçirgen ve FITC falloidin boyama ile F-aktin organizasyon için analiz edilmiştir.

daha büyük bir ölçekte, yöntem, biyokimyasal işlemler için ECM izole etmek için kullanılmıştır. Örneğin, RCS hücreleri 7 gün için iki 100 mm'lik bir hücre kültür tabaklarında büyütülmüş ve adımda 4,1-4,7 prosedürler takip edildi. Hücre türevi ECM proteinleri, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içine kazınarak toplandı ve indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrıldı. Jel proteini için lekeli ve dört büyük bant her izole edilmiş ve kütle spektrometrisi (Şekil 4A) ile analiz edilmiştir. 5 / kıkırdak oligomerik matriks proteini (TSP5 / COMP) ve matrilin-1, trombospondin, fibronektin dahil olmak üzere ECM proteinleri, bir dizi (1, TSP1) trombospondin, (Şekil 4B) tanımlandı.

Alternatif olarak, ECM küçük ölçekli hazırlıkları immunoblotlarda tarafından değerlendirilebilir. Örneğin, ektopik mRFPovTSP1C bir anti-TTT antikoru (Şekil 4C) olan bir PVDF membrana aktarıldı ve RFP problanmış, SDS-PAGE ile ayrılarak ifade eden COS-7 hücreleri hücre-türevi ECM. Bu teknik, TSP1 (mRFPovTSP1C) bir yerli trimerik ve TSP1 C-terminal bölgesinde (MRFP-TSP-5-1C) 17 (Şekil 4C) arasında pentamer bir mühendislik arasındaki birikme farklılıkları tespit etmek için yeterince hassastır. HDF endojen ECM incelemek için, hücre lizatı veya izole edilmiş ECM'de spesifik proteinlerin varlığı bağışıklık-beneklemesi ile incelenmiştir. Bol miktarda hücre içi proteinlerdir α-tübülin ve β-aktin izole ECM (Şekil 4D), eksik oysa karakteristik ECM proteinleri, fibronektin ve trombospondin-1, ECM tespit edilmiştir.


Şekil 1: Hücre çıkarması Yöntemlerinin Karşılaştırılması. COS-7 hücreleri% 2 PFA sabit lamelleri 96 saat için, yüksek yoğunlukta yetiştirilir ve% 0.5 Triton X100 geçirgen ya da hücre çıkarılması için belirtildiği gibi muamele edildi. Lameller sonra çekirdekleri görselleştirmek için F-aktin ve DAPI görselleştirmek için FITC falloidinle boyandı. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Bu rakam Hücre Bilimi 11 Journal of orijinal yayından değiştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-1
Şekil 2: İzole ECM ECM Proteinlerin tanımlanması. (A) Faz-kontrast ve floresan görüntülerimRFPovTSP1C ifade ve 2 saat boyunca bir cam tabanlı, ızgara baz ile, 35 mm bir kap üzerinde yetiştirilen COS-7 hücreleri. Fotoğraflar önce ve amonyum hidroksit ile hücrelerin çıkarılmasından sonra gösterilmiştir. Izgara harfi kenarı noktalı bir çizgi ile faz-kontrast görüntüleri gösterilir. Beyaz oklar önce ve hücre çıkarılmasından sonra mevcut olan flüoresan puncta örnekleri göstermektedir. Ben dolaylı immünofloresan HDF ECM kollajen (B) tespiti. HDF 96 saat boyunca büyütüldü ve amonyum hidroksit ile kaldırılır ve ECM ECM sadece FITC-konjuge anti-tavşan ikincil antikoru ile boyanmış insan fibriler kollajen I için lekeli edildi. Indirekt immunfloresan tarafından tespit edilen (C) RCS hücreleri etrafında veya izole RCS ECM içinde fibronektin lokalizasyonu. RCS hücreleri% 2 PFA sabit 48 saat boyunca büyütüldü ve fibronektin ve DAPI ile boyanmıştır. Paralel yemekler, hücreler, 20 mM amonyum hidroksit ile çıkarıldı ve ECM fibr için lekelionectin ve DAPI ile. Hücreler, tek başına FITC ile konjüge edilmiş anti-fare IgG antikoru ile boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 3: Fonksiyonel Çalışmaları Steril ECM kullanımı. RCS "matris üretici" hücreleri cam lameller üzerinde 48 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücreleri çıkarmak için, steril koşullar altında, 20 mM amonyum hidroksit ile muamele edilmiştir. COS-7, "test" hücreler% 0.5 Triton X100 geçirgen,% 2 PFA, sabit ya da 2 saat süre ile izole RCS ECM olmayan lamelleri kaplama ve çekirdek görselleştirmek için F-aktin ve DAPI görselleştirmek için FITC falloidinle lekeli . RCS ECM üzerine kaplanır COS-7 hücreleri daha geniş yayılan ve büyük mikrofilaman demetleri (örneğin ok) ve kenar tüyler oluşanles. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 4: SDS-PAGE, kütle spektrometresi, ve immünolojik işaretleme ile izole edilmiş ECM Proteinlerin Tanımlanması. (A), RCS hücreleri 7 gün için büyütülmüştür ve 20 mM amonyum hidroksit ile çıkarıldı; ECM, 100 mM DTT ihtiva eden, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içine kazınmıştır. ECM hazırlanması indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Dört önemli bantlar (oklar 1-4) protein lekeleme ile teşhis edildi. RCS ECM bantlar 1-4 (B) Proteinler MALDI kütle spektrometrisi ile tanımlandı. (C), ya mRFPovTSP1C (trimeri) ya da MRFP-TSP-5-1C (pentamer), 48 saat için kültürlenmiştir ifade eden COS-7 hücreleriH ve 20 mM amonyum hidroksit ile ayrılmış ve ECM 100 mM DTT ihtiva eden, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde izole edilmiştir. ECM, preparat bir PVDF membrana aktarıldı indirgeme koşulları altında bir% 7 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmış ve anti-RFP antikoru ile problanmıştır. Bu panel Bioscience Reports 17 özgün bir yayından değiştirilir. (D) HDF 96 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücreleri çıkarmak için, ya PBS içinde% 2 deoksikolik asit (hücre lisatı) ile ya da 20 mM amonyum hidroksit ile muamele edilmiştir. ECM, sıcak, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde kazınmıştır. belirtildiği gibi, iki fraksiyon, bir PVDF membrana aktarıldı indirgeme koşulları altında bir% 10 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılmış ve antikorlar ile problanmıştır. her panel, moleküler ağırlık belirteçleri konumları kDa cinsinden belirtilmiştir. Bu fi büyük halini görmek için buraya tıklayınızşekil.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

yöntem ECM başarılı izolasyon ve analiz sağlamak için takip edilmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. Örneğin, amonyum hidroksit hücreleri çıkarmak için ve analiz için ECM izole etmek için kullanılır. amonyum hidroksit, karanlıkta, sulu çözeltiler içinde kararlı olan ve oda sıcaklığında muhafaza edilebilir olsa da, şişe sıkıca her kullanım arasında yeniden sızdırmaz hale getirilmelidir. Gaz ve böylece konsantrasyonunu azaltarak, çözümden buharlaşması olabilir, çünkü biz güçlü bir taze şişeyi her 6-8 haftada başlayan öneririz. Buna ek olarak, çalışma çözeltisi, her bir deney için taze yapılmış olmalıdır. Hücrelerin tam de-iyonize su içinde bol yıkar ile kaldırıldığını da esastır. Bu adımlar yeterince yerine getirilmemesi halinde, hücresel materyal çanak kalır ve alt analizler kirletebilir. Hücreler 10 gün ya da daha uzun süre için yetiştirildiği takdirde, ilave su yıkama gerekli olabilir. Bu n önemlidirgörüntüleme sırasında ECM belirlerken dikkat gerekir, böylece izole ECM tabakası, tipik olarak hücrelere 11 ile karşılaştırıldığında çok ince ote. SDS-PAGE numune tampon maddesi izole edilmiş ECM etkin ekstre için, numune tamponu bir indirgeme ajanı içerir esastır. ECM en etkili kaldırılması için, kaynar örnek tamponu kullanılmalıdır. ECM örnekleri protein lekeleme veya proteomik için SDS-PAGE elektroforezi ile çözülecektir olan deneyler için, örnek tamponu, aynı kısım halinde ECM'nin birkaç tabak değerinde kazıyarak konsantre örneği elde etmek için kritiktir.

Değişiklikler ve Sorun Giderme

ECM proteinlerinin üretimi ve salgılanması hücre tipleri arasında önemli ölçüde değişebilir, bu nedenle ECM sekresyon ve birikimi için zaman periyodu, her hücre türü için de novo belirlenmelidir. ECM kompozisyon ilişkisi t dinamik değişecek farkında olmak da önemlidirkültür 18 o hücre yoğunluğu ve süresi. Deney tasarlarken Bu faktör dikkate alınmalıdır. Toplam ECM proteininde bir miktar gerekebilir kütle spektrometresi ile analiz için ECM ekstre özellikle Açıkçası, bu yöntem için bir hücre tipinin seçimi önemlidir.

Tekniğin Sınırlamalar

ECM proteinlerinin çok düşük seviyelerde salgılayan hücreler bu yöntemle kullanım için daha zor olacaktır. Yapışkan olmayan hücreler, 3D hücre kültürleri veya hücre istilası tahlilleri bu yöntemle ECM izolasyonu için şu anda uygun değildir. yöntemi standart "2 boyutlu" hücre kültürleri ile kullanım için uygundur. amonyum hidroksit ekstraksiyon tamamen ECM hücrelerin üst tarafı ile ilişkili ve salgılanmış hücreleri ortadan kaldırır, fakat sınırlayıcı olmayan çapraz bağlı olduğundan, ECM proteinleri aynı zamanda aşağıdaki ve bazlar çevresinde tabak üzerine monte ECM ince bir tabaka bırakmak çıkarılır hücrelerin 11,17 arasında Sup. Malzeme, aynı zamanda serbest salgılanmadan önce ya da hücre yüzeyinden alımından sonra da hücre içi ECM proteinlerini içerdiği için, amonyum hidroksit ekstre serbest ne kadar ECM ölçmek için karmaşıktır.

Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi

İzole ECM ile deneyler geniş bir yelpazede yürütebilme hücre biyolojisi ve doku fizyolojisi bağlamında önemlidir ve aynı zamanda doku rejenerasyonu ve doku mühendisliği alanlarında etkileri vardır. yöntem, hücrelerin, doğal çapraz bağlama mekanizmaları ile kökenli hücre tipine uygun oranlarda mevcut tek tek ECM proteinleri ile, kendi ana boyutta karmaşık ECM yapıları monte bu saflaştırıldı kollajenler ya da saflaştırılmış ECM proteinleri oluşan jeller üzerinde avantajlara sahiptir. beklenen Örneğin, RCS ECM'nin proteomik çalışmada, bol matrilins COMP / TSP5 gösterdikıkırdak ECM 19,20 (Şekil 4). Genel olarak, hücre kaynaklı ECM analizi kovalent çapraz bağlanma ile sonuçlanan bir geniş, çok-protein ağı ve bir çok ECM proteinleri çözülemediği olma özelliği ile engellenmektedir ve ayrıca ECM potansiyel kirlenme hücre içi proteinleri ile ayıklar. Proteomik analizi için doku ECM fraksiyonunu izole etmek için tasarlanmış bir çok-aşamalı bir prosedür 21 tespit toplam protein grubu ECM proteinlerinin% 8 elde edildi. Ancak, ECM proteinleri gelen peptidler belirlenen toplam peptitlerin% 73 idi. hücresinden türetilmiş ECM izolasyonu ve analiz için bu yöntem, hızlı ve güvenilir bir şekilde ECM proteinlerini muhafaza ederken, hücresel maddeyi temizler. Bu yöntem, hücre tipleri ve alt bir uygulama aralığı için kullanılan ve hücre kültüründe ECM biyoloji ve hücre-ECM etkileşimlerin analizine kolaylaştırır. yöntem farklı ölçeklerde nasıl uygulanabileceğini Bizim protokoller detay exp geniş bir yelpazede ele almakECM organizasyon, dinamikleri, ya da kompozisyon ile ilgili erimental sorular ve hücreler izole ECM fonksiyonel etkileri.

Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi

Geleceğe bakıldığında, yöntem, 3D hücre kültürleri ile kullanım için adapte edilebilir; Bu fizyolojik alaka genişletmek olacaktır. Hücresizleştirilmiş yerel doku kayıp ya da hasar görmüş doku rejenerasyonu için ve kalp yetmezliği 22 sonra da transplantasyon alternatif olarak bir iskele olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Verici kullanılabilirliği ve immunorejection sorunlarının üstesinden gelmek için bir potansiyele sahiptir. Bu raporda açıklanan yöntemin gelecekte uygulamaları daha bu yaklaşımın kapsamını artıracak 3D hücre kültürleri veya doku Decellularization ile kullanımını araştırmak olabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz RCS ECM proteomik analizi yürütmek için, Dr. Belinda Willard, Proteomik ve Metabolomik Laboratuvarı, Lerner Araştırma Enstitüsü, Cleveland Clinic en müteşekkiriz. Biz JKA'li için, numara K018043 hibe, theMedical Araştırma Kurumu İngiltere'de mali destek için minnettarım.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
COL1A1NovusNB600-408Tavşan poliklonaline karşı antikor. Diğer fibriller kollajenler ve kollajen I ile reaksiyona girer. IF: 1/200
FibronektinSigmaF3648Tavşan poliklonaline karşı antikor. WB: 1.5 saat için 1/600. IF: 1/200
Trombospondin 1ThermoFisher'aMA5-13398Fare monoklonal klonu A6.1. WB: RFP
Abcamab62341antikor. WB: 2 saat için 1/2.000
β-aktinSigmaA1978Fare monoklonal klonu AC-15'e karşı antikor. WB: 1.5 h için 1/10.000
α-tubulinSigmaT9026Fare monoklonal klonu DM1A'ya karşı antikor. WB: 1,5 saat için 1/5.000
Cell Tracker GreenThermoFisher C2925Floresan hücre işaretleyicisi. 1 & mikro'da kullanın; 30 dakika boyunca
M Floresein izotiyosiyanat (FITC)-PhalloidinSigmaP-5282Stok = DMSO'da 50 mg / mL. 45 dakika için 1/50
FITC konjuge keçi anti-fare IgGSigmaF8771IF: 1 saat için 1/50
FITC konjuge koyun anti-tavşan IgGSIgmaF7512IF: 1 saat için 1/50
Yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge keçi anti-fare IgGLI-COR926-80010WB: 1 saat
HRP konjuge keçi tavşan karşıtı IgGLI-COR926-80011WB için 1/100.000
VectorH-1200Vectorshield montaj ortamı4 & ° C'de saklayın; Karanlıkta C
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's MediumSigmaD6429Kullanmadan önce sıcak
Fibroblast büyüme ortamıPromoCellC-23010Kullanmadan önce sıcak, 50 & ile takviye; g/mL askorbik asit
Fenol kırmızı içermeyen DMEMThermoFisher21063-029Kullanmadan önce ısıtın
Tripsin-EDTA çözeltisiSigmaT3924Kullanmadan önce
ısıtın Izgaralı cam tabanlı çanakMatTekP35G-2-14-C-GRID
NH4OH, %28-30 çözeltiSigma221228Deiyonize suda 20 mM'ye seyreltin. Açıldıktan sonra karanlıkta saklayın, sıkıca kapatın.
Paraformaldehit, %16'lık çözeltiAlfa Aesar43368PBS
Deoksikolik asitSigmaD2510'da%2 (h/h) ile seyreltin %2 (h/h) nihai konsantrasyonda kullanın
Triton X-100SigmaT8787%0,5 (h/h) nihai konsantrasyona seyreltin
GelCode Blue leke reaktifiThermoFisher 24590SDS-PAGE jelleri için protein lekesi
Precision Plus protein standartlarıBiorad161-0374SDS-PAGE jelleri için protein standartları
Trans-Blot SD Yarı Kuru transfer hücresiBiorad1703940Yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin verimli transferi
PVDF transfer membranıMilliporeISEQ00010Immobilon-PSQ 
Ponceau S lekesiSigmaP7170için geri dönüşümlü protein boyası
LI-COR926-80200
Yüksek performanslı kemilüminesans filmiGE Healthcare28906837
Steril filtrasyon ünitesi, MILLEX-GVMilliporeML481051
SP8 AOBS konfokal lazer tarama sıcaklıkve CO2 kontrolü için gerekli mikroskop
Anahtar: IF, İmmünofloresan; Dünya Bankası, Batı Lekesi
karşı antikor; Tavşan poliklonaline karşı 1.5 saat için 1/150DAPI ile 1 saat PVDF membran WesternSure Gelişmiş kemilüminesans (ECL) substratı Leica Çevre odası (Life Imaging Services)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).">Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).
  2. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903(2012).">Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903(2012).
  3. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).">Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).
  4. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).">Hellewell, A. L., Adams, J. C. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).
  5. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).">Li, D., Yang, W., Li, G. Y. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).
  6. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).">Strawich, E., Nimni, M. E. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).
  7. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).">Kim, B. S., et al. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).
  8. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).">Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).
  9. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).">Carter, W. G. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).
  10. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).">Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).
  11. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).">Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).
  12. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).">Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  13. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).">Hillenkamp, F., Karas, M. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).
  14. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).">Davis, M. T., et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).
  15. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).">Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
  16. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).">Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).
  17. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).">Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).
  18. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).">Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).
  19. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).">Myllyharju, J. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).
  20. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).">Roughley, P. J. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).
  21. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647(2012).">Naba, A., et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647(2012).
  22. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).">Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Matrix IsolationCell derived ECMAmmonium Hydroxide TreatmentSDS PAGE AnalysisImmunoblotting DetectionMass Spectrometry AnalysisImmunofluorescence MicroscopySterile ECM PreparationFunctional ECM StudiesECM Protein Extraction

Related Articles