Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

15.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55058

⸱

12 Aralık 2016

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

Bu makalede

Özet

Ardışık kriyo-bölümleri tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ekspresyonu ölçümleri için histolojik uygulamalar ve RNA zenginleştirme sağlamak için toplanır. doğrudan uygulamalar arasında karşılaştırılmıştır toplanmış cryosections ve ölçümlerin 30 mg - Yüksek kaliteli RNA 20 elde edilir.

Özet

Bu yöntem ile, birbirini takip eden cryosections tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ifadesi için doku histolojisi ve RNA zenginleştirilmesi için, her iki mikroskop uygulamaları sağlamak için toplanır. Tipik olarak, tampon hacimleri verimli taşlama uygulamaları için çok düşük olabilir, çünkü henüz yeterli mekanik kesinti olmadan, küçük iskelet kas örneklerinin yeterli homojenizasyonu sağlamak için zorlu, tampon reaktif kas sınırları penetrasyon yoğun doku mimarisi, sonuçta düşük RNA verim neden olur. Burada bildirilen protokolü takip ederek, 30 mikron kesitler toplanır ve tampon penetrasyonu maruz yüzey alanını arttırarak, krio-bölümleme ve sonraki iğne homojenizasyon kas bozabilir mekanik izin toplanmış. tekniğin başlıca kısıtlamaları bir kriyostat gerektirir, ve nispeten düşük bir kapasiteye sahip olmasıdır. Bununla birlikte, yüksek-kalitede RNA toplanmış m küçük örnekler elde edilebiliruscle cryosections, birçok farklı iskelet kaslarında ve diğer dokular için bu yöntem erişilebilir hale getirmek. Ayrıca bu teknik eşleşti sağlayan analizler (örneğin, doku histopatolojik ve gen ifadesi) ölçümleri doğrudan deneysel belirsizliği azaltmak ve küçük bir doku kaynak için gerekli replikatif hayvan deneyleri azaltmak için uygulamalar arasında mukayese edilebilir, böylece tek bir iskelet kası komşu bölgelerden birden çok uygulama.

Giriş

Bu tekniğin amacı, tek bir küçük iskelet kası kaynak dokusundan erişilebilir gibi histoloji ve gen ifadesi olarak farklı modaliteleri, birden fazla deneysel analiz yapmaktır. Mikroskopi uygulamaları dikkatle dondurulması sırasında buz kristali eserler oluşumunu sınırlamak için kontrol edilmelidir koruma yöntemleri, örnek en duyarlıdır. Böylece, yöntem geliştirme tibialis anterior dayanmaktadır (TA) kas kısmen immünfloresan mikroskopi ve gen ifadesi hem analizleri için kaynak materyal olarak -140 ° C sıvı nitrojen soğutmalı 2-metilbütan banyosunda reçine gömme ile kaplı dondurulmuş.

çeşitli teknik yaklaşımlar için aynı kaynak materyal kullanma ihtiyacı sol ve sağ kaslar farklı koşullar, deneysel ve tek kontrol temsil eden kas içi enjeksiyon tabanlı deneyler için özellikle önemlidir. Örneğin, kas yenilenmesi çalışmalarında, tek bir muSistemik lupus karşı kas aracı ile enjekte edilmiş kontrol 1 olarak hizmet ederken yaygın doku hasarına neden olmak için, bir toksin ile enjekte edilir. Benzer bir şekilde, kas Gen tedavisi yapılan çalışmalarda genellikle karşı tarafa 2 boş vektör olmayan vektör veya taşıyıcı kontrol ile karşılaştırıldığında gereken kas içine enjeksiyon ile gen terapi vektörünün doğrulama ile başlar. Nedenle, farklı bir uygulama için her bir ta kas kaynak yapmak mümkün değildir.

Bu konu ile ilgili ortak stratejiler şunlardır: i) ii) Ek fareler kullanmak, veya iii) her uygulama için kas bir parça kesmek için, her uygulama için farklı bir kas grubunu kullanmak için. Ancak, kas grupları arasında önemli farklılıklar zor ayrı uygulamalardan verileri karşılaştırmak için yapmak ve ek hayvanlar gider artırmak ve diğer alternatifler varsa kötü haklı. farklı uygulamalar kaynak diseksiyonu sonrası kas bölme en iyi seçenek in birçok durumda. Bununla birlikte, kas parçalar genellikle homojenleştirme 2-5 için sıvı azot ya da mekanik öğütme teknikleri altında toz haline kullanmak için çok küçüktür. kas hücre dışı matris ve kontraktil proteinlerin ile kaplı olan bir yüksek yapısal doku gibi, yetersiz mekanik homojenleştirme daha sonra, DNA, RNA ya da protein düşük verime yol açar. Burada açıklanan yöntem çoklu uygulamalarda kullanılacak bir kaynak kas dokusunun küçük miktarlarda sağlar ve krio-bölümleme ve iğne toz haline dahil iyi RNA verimi için mekanik homojenizasyon artırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri hayvan kullanımı protokol A2013 07-016 (Beedle) kapsamında Gürcistan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Sabitlenmemiş İskelet Kası 1. Kryoprezervasyon

  1. Hazırlık
    1. Yaklaşık (küçük kareler bir jilet ile (yaklaşık 1 cm x 1 cm) içine mantar kesti kaynak fare ve kas belirlemek ve bir çok sığ kesim yapmak için 2-metilbütan dayanıklı bir ince uçlu işaretleyici ile mantar yazmak üst yüzeyi boyunca 1 mm). doku yönlendirmek için kullanılacak kesim içine plastik bir lamel yerleştirin. Her doku dondurularak saklanmasına yönelik bir mantar hazır olana kadar tekrarlayın.
    2. sıvı azot, 2-bromür, gömme reçine, düşük sıcaklık termometre, mantarlar, diseksiyon araçları ve çalışma fare alın.
      DİKKAT: Sıvı azot ısındığında patlayabilir sıkıştırılmış bir gazdır. ni sıvı işlerken bir laboratuvar önlüğü, düşük sıcaklık eldiven ve yüz koruyucu giyinTrogen; deri ile temas ya da gözleri yanıklara veya donmalara neden olabilir. 2-Metilbütan yanıcı, toksik, sağlık ve çevresel tehlike. , Kişisel koruyucu donanım (laboratuvar önlüğü, eldiven, koruyucu gözlük) giyin davlumbaz stok kabı açın, sıkıca kapatılmış ayrı bir kaba (genellikle 200 ile 400 ml) dondurma için gereken küçük bir miktar aktarabilir ve solumaktan kaçının .
    3. anestezi altında ötenazi onaylanmış bir yöntem ile fareler Euthanize. Kısaca, bir izofluran buharlaştırıcı gelen oksijen% 2.5 izofluran ile bir inhalasyon odasına fare takın, fare sonra 20 sn pedal refleks kontrol etmek için durana kadar bekleyin. Pedal refleks negatif olduğunda, servikal dislokasyon 6 ile çalışma fare euthanize.
      NOT: Ötanazi yöntemler kurumsal etik komitesi tarafından onayı gerekiyor.
    4. Cildi uzak hindlimb örten çıkarın ve sadece iyi nokta disse ile ayak bileği üstünde uzak ön tendonları kesmekction makas. ince forseps ile distal tendon kavrayın ve kas serbest bırakmak için yanal fasya kesim hafifçe yukarı çekin ve diz doğru. Diz dik kas çekin ve TA kas 7 tüketim için son bir kesim yapmak.
      NOT: TA kas burada örnek olarak kullanılır, ancak kullanıcının deneysel hedeflerine uygun olduğu takdirde herhangi bir fare iskelet kası ya da kalp Bu protokolde TA için ikame edilebilir. Tek sınırlama doku derinliği boyunca hızlı kriyopreservasyona elde etmek için yeterince küçük olmasıdır; 1 cm x 1 cm maksimum doku boyutu önerilir.
    5. ters bacak tekrarlayın ve tahsil edilecek herhangi bir diğer dokulara teşrih. Dondurmadan önce doku bozulmasını sınırlamak için mümkün olduğunca çabuk diseksiyon.
    6. Orient öncesi etiketli mantar üzerinde enine kesitler için her kas. mantar ve kas ext üst dokunmadan uzak tendon ile mantar için kas dik durmakuzakta biten lamel ile dik tuttu.
    7. tercihen kaynak hayvanın euthanization bu yana geçen 5 dakika ama kesinlikle fazla 15 dakika süre içinde, diseksiyonu sonrası en kısa sürede histolojik analiz için tüm dokuları cryopreserve.
  2. Kriyoprezervasyon
    1. Diseksiyon bitmeden dondurma Hamamı beş dakika soğutma başlayın. yaklaşık 3 cm derinliğe kadar açık bir metal kap içine 2-metilbütan dökün. 2 ila 4 cm bir derinliğe kadar yalıtılmış bir kap içine sıvı azot dökün. sıvı azot içine 2-metilbütan bir beher ayarlayın; azot kaynamaya başlayacaktır. 2-metilbütan behere azot sıçramasını önlemek.
      DİKKAT: Davlumbaz veya iyi havalandırılan bir alanda banyo dondurma hazırlayın.
    2. sıcaklığını izlemek ve soğutma da emin olmak için bir çatal ile sık sık karıştırılmıştır 2-metilbütan bir düşük sıcaklık termometresi yerleştirin. karıştırmaya devam edin ve soğuyana kadar 2-methylbutane gerekli dış banyo yeni sıvı azot ekleyerek, -140 ° C ulaşır.
      Not: 140 ° C, çizgili kas, buz kristali eserler en aza indirmek için optimum sıcaklık olan; diğer dokular, farklı ısılarda en cryopreserve (örneğin, beyin, -90 ° C).
    3. o mantar karşılar ve hemen -140 ° C'de 2-metilbütana içine mantar açılan kas% 50 - sadece alt 35 gömme reçine uygulayın. Hızla dondurma parti başına en fazla 8 dokular için tekrarlayın. dokular katılaşan 2-metilbütan içine donma yok sağlamak için kabın alt kazıma 30 saniye boyunca karıştırılır.
    4. Bir çatal kullanın, 2-metilbütan gelen her doku mantar çekmek için kaşık veya büyük forseps yaptı. Çabuk, lamel kaldırmak behere fazla 2-bromür kapalı kurulamak ve ardından dış azot banyoya doku mantar bırakın. beher kalan tüm mantarları tekrarlayın.
    5. Sıvı azot ya da kuru buz üzerinde Aktarım örnekleridepolama için -80 ° C derin dondurucu.
    6. herhangi bir doku dondurulması için kalırsa, tekrar 1.2.4 için 1.2.3 adımları. -140 ° C'ye kadar gerekli ve yeniden serin dış banyo beher veya sıvı azot ilave 2-bromür ekleyin. tehlikeli atık olarak kullanılan 2-metilbütan atınız.

2. Histoloji ve RNA Uygulamaları için cryosections toplayın

  1. Hazırlık.
    1. Bir analitik terazi üzerinde bir DNaz / RNaz ücretsiz otoklava tüp pre-tartın. Daha sonra, ön soğutma kriyostat odasına taşımak. tüm toplanmış cryosection örnekleri toplanacak için tüpler hazır olana kadar tekrarlayın.
    2. iskelet kası kesit için, kriyostat odası sıcaklığı iç termostat -21 -22 ° C olduğunu teyit etmektedir. odasına kesilecek dokularıyla herhangi bir kap aktarın ve kap (lar) açılmadan önce en az 15 dakika boyunca kriyostat sıcaklığına gelmesini sağlar.
    3. Yeni bir tek kriyostat bıçağı takın. Alternatif, RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile sprey, mevcut bıçağı kaldırmak GKD 2 O ile durulayın ve soğumaya kriyostat içine takın. % 70 etanol ile temiz bir doku sprey ve dikkatle bıçak ve bıçak sıkıştırma platformu silin.
      1. Bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile temiz bir doku sprey ve Kriyostat fırçaları silin. , GKD 2 O ile bir doku sprey tekrar fırçalar silin ve temiz bir yüzeye kriyostat odasına bunları.
        DİKKAT: Kriyostat bıçak kullanılmadığı zaman bıçak koruması kapsamına alınmalıdır. Ayrıca, RNaz dekontaminasyon çözeltisi toksiktir ve soğuk kriyostat bölmesinde bir çökelti oluşturmak üzere donar. Bu nedenle, dikkatli olun ve Kriyostat odasında kullanımını önlemek.
    4. Kriyostat odasının içinde, bir kuruş büyüklüğünde damla sıcak örnek aynası üzerine reçine gömme (yaklaşık 300 ul) yerleştirin, aşağı reçine üst basın bir doku mantar ayarlayın ve sonra fr Chuck setdemiryolu veya varsa hızlı bir dondurma elemanı üzerine eezing.
    5. gömme reçine katılaşır (beyaz) sonra, doku alt% 35 civarında, mantar üstüne ek gömme reçine ekleyebilir ve daha iyi doku stabilize etmek için hızlı bir dondurma için gömme reçine içine ısı çıkarıcı basın. Reçine tamamen sertleşmesine izin kesit önce 5 dakika bekleyin.
    6. örnek kelepçe en geri çekilmiş pozisyonda, bıçak en uzak olduğundan emin olun. örnek kelepçe içine doku örneği aynasını takın.
  2. Cryosection hazırlanması.
    1. Bıçak taşıyıcı tutucu gevşetin 10 ° (veya kullanılan bıçak taşıyıcı için uygun bir açı) ile bıçağın açıklık açısını ayarlamak ve yeniden sıkın. frenini bırakın ve bıçak doğru kas düşürmek için el çarkını. doku ve bıçak arasında en küçük mesafe tahmin sonra bıçaktan uzak doku taşımak ve el çarkı frenini çekin.
    2. Yükseklik ayar leve gevşetindoku uç bıçak daha yaklaşık 2 mm'den ise r, sırasıyla, ileri veya geri bıçak taşıyıcı taşımak ve ya bıçak dokusunu vurursa. Sıkın ve bıçak mesafe kontrol etmek için tekrar doku indirin. bıçak, görsel tahminle doku ucundan 1 ila 2 mm kadar ayarlamalar tekrarlayın.
    3. bıçak doğru doku indirin ve enine kesitler için doku açısını değerlendirmek. El çarkını kilitlemek ve numune kelepçe kolunu serbest bırakın. örnek kelepçe sola veya sağa doku yatay yönlendirme bıçak dik kadar itin.
    4. Bu doku kesitlerinde kas uzun eksenine dik olacak şekilde "y" yönünü ayarlamak için aşağı yukarı örnek kelepçe veya arkadan itin. örnek kelepçe kolunu sıkın.
    5. sadece bıçağa dokunana kadar numune ilerlemek için kurs ve ince ileri beslemeyi kullanın. Belirli bir doku derinliği bölümleri arayan varsa, (sıfıra bölüm kalınlıklarının toplamı sıfırlamakdoku üst).
    6. 30 mikron kesit kalınlığı ile trim fonksiyonu için Kriyostat ayarlayın. Kes ve doku toplama önceden seçilmiş derinlik ulaşılana kadar bölümleri atmak (örneğin, üst 400 mikron).
  3. RNA ekstraksiyonu için cryosections toplayın.
    1. toplama bölümler için tüp açın ve bıçak taşıyıcı yakın yerleştirin. o bıçak kesilir her bölümü pick up ve tüpe cryosection aktarmak için daha önceden soğutulmuş, temiz bir fırça kullanın. toplanmış bölümler 30 mg ağırlığında veya istenilen doku derinliğine ulaşılana kadar tekrarlayın.
      NOT: - 40 mg bir yetişkin fare tibialis anterior için, yaklaşık 400 mikron 4.000 doku derinliği toplama genellikle 25 verir. bölümler sopa ve metal yüzeyinde gelme eğilimi gibi metal forseps kullanılarak tavsiye edilmez toplama tüpüne bölümleri aktarmak için.
    2. reçine gömme kas cryosection çevreleyen ise, el frenini kilitlemek ve jilet kullanmakkas üst etrafında sadece ince bir tabaka kalmayıncaya kadar reçine küçük parçalar tıraş. bıçak ile her zaman kesilmiş reçine uzak kas açılı.
      NOT: esasen aşağı RNA hazırlık bozmaz reçine gömme ince bir tabaka. kalın gömme reçine varsa, toplama tüpünün içine cryosection taşımadan önce uzak kas onu kızdırmak için fırça kullanın.
    3. Alternatif olarak, toplama tüpüne toplu bıçak taşıyıcı ve transfer havuz bölümleri.
      Not: Bununla birlikte, bu yöntem daha yavaş olma eğilimindedir ve bölümler sopa ve sonraki adımda iğne homojenleştirme verimini azaltabilir, bir araya gelme olasılığı daha yüksektir.
    4. Hızla analitik terazi ve kayıt tüp ağırlığı içine toplanmış cryosection tüp yerleştirin. Hemen -20 ° C civarındaki bölümü sıcaklığı korumak için, soğuk kriyostat odacığına tüp döner. toplanmış bölümlerinin ağırlığı hesaplanır.
      NOT: RNA izolasyonu reklama oluşacak olursaifferent gün -80 ° C'de kullanıma kadar toplanmış cryosection tüpü saklayın.
  4. histoloji için cryosections toplayın.
    1. ince kesit ve kullanım okları 7 um (ya da diğer uygun kesit kalınlığı, genellikle 6 ila 10 um) için kriyostat kesit kalınlığı ayarlamak için kesit kalınlığı düğmesine basın.
      Not: ince kısımların (6 ila 10 um) ya da doku bölümünün derinlik nüfuz edebilir boyama reaktifleri sağlamak için histolojik uygulamalarda kullanılır. Ince kesitler cryosectioning sırasında herhangi bir derinliğe alınabilir, ancak doku derinliği ile artar reçine, gömme histolojik lekeleme bozmadığı için derin bölümler tercih edilir.
    2. Kes ve tutarlı, hatta doku yüzey elde etmek 4 ila 7 bölümleri atın. Doku derinliği not edin.
    3. Bir bölümü kes ve bıçak taşıyıcının yüzeyinde yönlendirmek. hızlı ve nazikçe ılık (oda sıcaklığı) mikroskop lamı dokunarak bölümü Pick upbıçak taşıyıcı bölümüne. Oda sıcaklığına kadar slayt dönün. İstenilen slaytlar sayısı elde edilene kadar devam edin. Nihai doku derinliği not edin.
      NOT: Her doku için ikinci bir (çift) bölümünde Toplama tavsiye edilir.
    4. tam kesit ile, el çarkı frenini çekin arka çoğu pozisyona örnek dönmek ve doku aynasını çıkarın. örnek aynası üzerinde doku mantar tutan gömme reçine eritmek için Kriyostat ısı elemanı kullanın. Doku mantar kaldırmak doku ile kurulayın ve depolama dönün.
    5. kalan her doku için adım 2.1.2 itibaren tekrarlayın. Geçen doku monte edildikten sonra slaytlar 20 dakika kurumasını bekleyin. kadar gerekli Sonra, bir slayt kutusunda -80 ° C'de histolojik veya immunofluorescent boyama ya da dondurularak için slaytlar kullanın.

Toplanmış cryosections 3. RNA İzolasyon

  1. RNA ekstraksiyonu,
    1. buz toplanmış cryosections Taşı tüp (ler). Hemen bir ekleme50 mg cryosection ağırlığı başına yaklaşık 1 ml reaktif, tüp başına tipik olarak 600 ul'lik bir oranda organik RNA ekstraksiyon reaktifi.
      DİKKAT: RNA izolasyon reaktifler, zehirli, aşındırıcı, ve rahatsız edici. Güvenli kullanım için üreticinin talimatlarına uyun.
    2. 18 kalibrelik bir iğne ile 1 ml şırınga kullanarak, RNA ekstraksiyonu, sıvıyı çekmek ve doku çözeltisi içinde süspansiyon haline gelene kadar borunun duvarları yıkayın. İğne homojenizasyon sırasında hava kabarcıkları en aza indirmek için deneyin.
    3. Tüp duvarına yapışan clumped cryosections ve parçaları püre ve dağıtmak için iğne ucu kullanın. Çiğnemek beş vuruş için iğne ile yukarı ve aşağı örnek geçirilerek homojenize ve daha sonra buz numunenin geri dönün. tüm kümeleri bozmak ve iğne ile kolayca örnek geçmek için gerekli olduğu gibi hem üç ila beş kez, ya da birçok kez adımları tekrarlayın.
    4. 18 iğne çıkarın ve 22 gauge iğne ile değiştirin. dikkatle trBeş vuruş için örnek iturate ve daha sonra buz numunenin geri döner. çok ince dağılmış doku Homojenat elde etmek için toz haline getirildikten üç ya da dört kez tekrarlayın.
      NOT: Doku parçacıklar örneği çizerken iğne engellemek başlarsanız, şırınga tüm örnek kovmak ve geri ileri homojenizasyon için 18 gauge iğne geçin. 25 ya da 26 numara iğne ile ek toz haline getirme adımı maksimum verim elde etmek için ilave edilebilir. Numune dökülmesi riski var bu yüzden Ancak, iğne tıkanabilir.
    5. buz, oda sıcaklığına kadar örnek getirin. moleküler kompleksler bozmak için 5 dakika boyunca inkübe edin.
    6. Bir duman başlığı içinde, tüp başına kullanılan RNA izolasyonu reaktifi 1, ml başına 1-bromo-3-kloropentan (BCP) (aşama 3.1.1), 0.1 mi, tipik olarak 60 ul ekle. (Vorteks yapmak) 15 sn için elle kuvvetlice tüpü çalkalayın. 2 ila 3 dakika boyunca oda sıcaklığında örnek inkübe edin. Daha sonra, 12,000 x g'de 15 dakika 4 ° C'de santrifüjlenir.
      DİKKAT: BCP yanıcı ve zehirlidir. Davlumbaz Kulp ve eldiven, bir laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın.
    7. Dikkatle üst sulu fazı (renksiz) içeren RNA toplamak ve temiz bir tüpe aktarın. % 70 (DEPC su içinde) etanol ve karıştırmak için girdap eşit hacim. En fazla 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
      Not: Orta interfaz ve alt fenol-BCP fazlar, üreticinin talimatlarına göre veya uygun bir şekilde bertaraf edilmesi için fenol-BCP tehlikeli atık kapta toplanır göre sırasıyla genomik DNA ve protein için işlenebilir.
  2. RNA saflaştırma.
    1. 8 küçük değişikliklerle bağlayıcı numune, yıkama ve elüsyon için üreticinin talimatlarını izleyin. Örneğin:
    2. Aşama 3.2.4-sıcak ön 37 ° C banyo veya inkübatör içine DNaz / RNaz içermeyen su bir kısım yerleştirin.
    3. bir saflaştırma sütunu yukarıda 3.1.8 RNA örneği eklenir ve 15 saniye boyunca numune santrifüjOda sıcaklığında 12.000 xg'de. Aynı sütunda ve yeniden santrifüj geri akışı dökün. RNA bağlayıcı üst düzeye çıkarmak ve sonra üzerinden nihai akışını atmak için ek süre tekrarlayın.
    4. Üreticinin talimatlarına 8'e göre yıkama adımları uygulayın. 12.000 xg'de 15 sn kolona yıkama tamponu 700 ul (yok etanol), spin uygulayın ve akış atmak.
    5. 12.000 xg'de 15 sn için kolona (etanol) ile yıkama tamponu 500 ul, sıkma ekleyin ve akış atmak. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
    6. membran kuru 12,000 xg'de 1 dakika boş sütun dönerler.
    7. Temiz bir RNase-, DNaz ücretsiz tüp spin kolon aktarın. Sütun membranın merkezi (3.2.1 arasında) önceden ısıtılmış DNaz / RNaz içermeyen su 40 ul ekle. Oda sıcaklığında, 2 dakika süreyle inkübe edilir ve daha sonra, 12.000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
      Not: 40 ul elüsyon hacmi, orijinal mg başına yaklaşık 1.3 ultoplanmış cryosections 30 mg doku. farklı başlangıç ​​doku ağırlıkları için uygun sağım ses seviyesini ayarlamak, ancak 32 ul altına düşürmek yok. orijinal dokunun mg başına yaklaşık 0.7 ul kullanarak ikinci bir yıkama, toplam RNA, verimi artırmak için ilave edilebilir.
    8. Bir spektrofotometre, elektroforez ve / veya Bioanalyzer ile konsantrasyon ve saflık için RNA (sütun elüsyon) analiz eder. Bu kantitatif PCR 4 ters transkripsiyon alt-uygulamalar için gerekli olana kadar -80 ° C'de RNA saklayın.
      NOT: Bir DNaz tedavi aşağı uygulamalarda RNA kullanmadan önce tavsiye edilir. Bu tedavi kolon yıkaması, sonra bu belirli bir noktada, yıkama aşamasından önce bir RNA saflaştırma kolon üzerinde gerçekleştirilmiştir ya da herhangi bir alt uygulamada ilk adım olarak RNA bir tümbölen üzerinde olabilir. RNA, birkaç yıl için kararlı olmalıdır.

Immunofluorescent lekelenme tarafından 4. Histolojik AnaliziKas cryosections g

  1. Basit immünofloresan protokolü.
    1. Her bir slayt bölümlere grup daire için bir hidrofobik kalem kullanın. Yavaşça dokuları dokunmamaya dikkat ederek, daire içine alana (geniş bir yüzey alanı için 500 ul kadar küçük bir yüzey alanı için yaklaşık 80 ul) PBS bırakın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
      NOT: Dondurulmuş slaytlar kullanıyorsanız, -80 ° C derin dondurucuda slaytları çıkarın ve 20 ila 30 dakika çözülme ve kuru, daha sonra yukarıdaki gibi devam etmek için oda sıcaklığında kuluçkaya yatmaktadır. En az iki slaytlar ihtiyaç vardır: Biri deneysel slayt birincil ve ikincil antikor inkübe edilecek; ve primer antikor için bir kontrol slayt, "ikincil sadece" kontrol hariçtir.
    2. PBS kapalı dökmek için slayt İpucu. daire alana PBS (engelleme çözeltisi)% 5 eşek serumu ekleyin; kas bölümleri kurumasına etmemelerini sağlamak için dikkatli olun. bir nem odası birkaç saat kadar 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin (ya da).
    3. kas rejenerasyonu analiz etmek birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Bir eMHC antikoru (01:40) ile bir COLVI antikor (: 1.000 1) ile, bloke etme çözeltisi karıştırın. sırasıyla küçük, orta veya büyük slayt alanlar için, 300 ul veya 500 ul yaklaşık 150 ul hazırlayın. Vorteks 5 saniye için, ve daha sonra bir çökelti pelet 15,000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
    4. Deneysel slaytlar için, engelleme çözümü kapalı dökün ve sonra 4.1.3 birincil antikor çözümü eklemek için slayt ipucu. İkincil kontrol slayt için, engelleme çözümü kapalı dökün ve sonra taze engelleme çözümü (hiçbir antikor) eklemek için slayt ipucu. gece boyunca 4 ° C'de bir nem odasında slaytlar inkübe edin.
      NOT: Slaytlarınıza antikor çözümler pipetleme, her zaman tüpün alt kısmında herhangi bir çökelti bozmak yok, primer antikor çözüm tüpünün üst sıvıyı çekin.
    5. İpucu çözümü kapalı dökmek için slaytlar. yıkamak için her slaytın daire içine bölgeye PBS damla damla ekleyin, ucu dökmek içinkapalı daha sonra PBS ilave edin ve 3 ila 5 dakika boyunca inkübe edin. üç yıkamadan toplam tekrarlayın.
      NOT: yıkama süresi oldukça esnektir ve istenirse 20 dakikaya kadar uzatılabilir. Genel olarak, çözelti değişim sayısı zaman daha önemlidir.
    6. DAPI nükleer 10,000 seyrelti: fare IgG1 (eMHC) ve tavşan IgG (COLVI) ve 1 ile tespit etmek için kırmızı ve yeşil fluorofor-bağlı ikincil antikor: 500 oranında seyreltilmiş 1 kullanılarak (ikincil kontrol slayt dahil) slaytlar için ikincil antikor çözeltisi hazırlayın leke.
      1. Örneğin, DAPI 1:10 seyreltme yapmak GKD 2 O 9 ul DAPI 1 ul karıştırın. Daha sonra, 500 ul nihai hacim için, bloklama çözeltisi 447,5 ul 1:10 DAPI 1.0 ul 1.0 + anti-fare IgG1-kırmızı ul anti-tavşan IgG-Yeşil + 0.5 ul ekleyin. Girdap herhangi bir çökelti pelet 15,000 x g'de 2 dakika süre ile karıştırılır ve santrifüjlenir için.
        NOT: İdeal olarak, tüm ikincil antikorlar aynı ana türlerinden olmalıdır.
    7. Geçen PBS yıkama kapalı dökmek için slaytlar İpucu. tüm dokuları kapsayacak şekilde ikincil antikor çözüm ekleyin. ışıktan korumak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe slaytlar örtün.
      NOT: Tüm ikincil antikorlar ikili etiketleme deneylerinde diğer türler ile minimum çapraz reaktivite sahip valide edilmelidir.
    8. 4.1.5 tarif edildiği gibi slaytlar yıkayın. Son yıkamadan sonra, PBS dökün ve bir doku üzerinde slayt ayarlamak için slayt ipucu. bir tarafı boyunca bir sulu montaj ortamı 3 ila 4 damla ekleyin.
    9. Sadece montaj medya dış kenarına cam lamel kenarına ayarlayın. forseps kullanarak, yavaş yavaş, sonra, dokulara doğru lamel alt lamel bırakın ve yavaşça yerine dokunun. Son olarak, hafifçe stabilize etmek için lamel her köşesini basın.
    10. kullanılana kadar 4 ° C'de ışık ve mağaza slaytlar koruyun.
      NOT: Uzun süreli depolama için, th kenarı boyunca oje ince bir tabaka uygulayıne lamel kurumasını slayt önlemeye yardımcı olur.
  2. Histolojik değerlendirme.
    1. Görüntü uygun filtreler ile bir Epifluorescent veya konfokal mikroskop kullanılarak slaytlar eMHC (kırmızı) tespit etmek; COLVI (yeşil); ve tipik bir 20X objektif 1,5 kullanarak, çekirdekleri (mavi) DAPI ile boyanmış.
    2. Deneysel slaytlar floresan sinyal eMHC ve COLVI tespiti 4 özgünlüğünü göstermek için ikincil kontrol slayt farklı olduğundan emin olun.
      NOT: eMHC pozitif canlandırıcı lifleri kas yaralanma sonrası ve değişken müsküler distrofi ile farelerde yaklaşık 2 ila 7 gün arasında görünür olmalıdır. Kollajen VI kas lifleri, kan damarları ve sinirler çevreleyen hücre dışı matrisin ve peri- ve epimysium büyük bağ dokusu demetleri mevcuttur. DAPI nükleer leke kas lifi rejenerasyon gösteren periferik çekirdeklerin karşı santral nükleuslu lifleri ve i varlığını tespit etmek yararlıdırhücrelerin nfiltrating. Nekrotik veya yaralı elyaflar nedeniyle hasar kas zarlardan lifleri nüfuz endojen IgG deteksiyonuna fare IgG ikincil antikor ile zayıf leke yapabilir.
    3. rejenerasyon ölçmek için, tüm görüntü boyunca her floresan filtre ile örtüşen mikroskop fotoğraf çekmek. Tüm bölüm 1,5 haritasını yeniden resim hizaya sonra her bir yer için eMHC, COLVI ve DAPI görüntüleri birleştirme ve.
    4. analiz yazılımı kullanılarak, eMHC pozitif liflerin sayısı ve son yenilenme (100 * (# eMHC + lifler / # toplam lifler)) hesaplamak için toplam elyaf sayısını saymak. Ayrıca, (100 * (# CN + elyaf / toplam # elyaflar)) 1,5 uzun bir süre boyunca rejenerasyon ölçmek için toplam elyafın üzerinden merkezi çekirdekli elyafların sayısı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kas cryosection RNA kalitesi yüksek ve uygulamaların çoğu için yeterli verim sağlar

On altı çizgili kas RNA preparatları analizleri 8 kontrol farelerinden alınan havuzlanmış tibialis anterior (TA), kas 19.4 41 mg kullanılarak Tablo 1 'de gösterilmiştir. Hem sol (L) ve sağ (R) ta kasları yöntemlerle kas yaralanmasına neden 3 gün tuz veya 10 uM cardiotoxin 25 ul uzunlamasına kas içinden enjeksiyondan sonra alın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

fazlalık reçine toplanmış cryosections toplanması yavaş olacak ve RNA izolasyonu reçine kirlenme gömme artabilir, çünkü bu yöntem ile en iyi sonuçları elde etmek için, doku kriyoprezervasyon sırasında kas alt üçüncü ya da yarısına sınırlı reçine gömme tutun. Ayrıca, iğne homojenizasyon sırasında dikkatli dikkat verimi en üst düzeye çıkarmak ve iğneyi tıkanma olasılığını en aza indirmek için önemlidir. protokol iğne bloke ve yapışmasına neden çıkarmak için yüksek basınç gerektiren hale gelirse örnek kaybına karşı korumak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar, birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre ve Junna Luan teknik yardım sağladı. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından AR065077 numaralı ödülle desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarın sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MantarVWR Scientific23420-708Keskin bir bıçakla küçük kareler halinde kesin.
Plastik lamelFisher Scientific12-547Donma sırasında kası yönlendirmek için kullanılır.
Düşük sıcaklık termometresiVWR Scientific89370-158
2-metilbütanSigmaM32631-4LDikkat: tehlikeli kimyasal. Yanıcı dolapta saklayın.
Gömme reçine: "kriyomatris"Thermo Fisher Scientific6769006Diğer gömme reçineleri kriyomatris yerine kullanılabilir.
CryostatThermo Fisher Scientificmicrom HM550, tek kullanımlık bıçak taşıyıcılıÇalışan herhangi bir kriyostat protokol için yeterli olmalıdır.
Tek kullanımlık kriyostat bıçağıThermo Fisher Scientific3052835Kullanılacak kriyostat için uygun bir bıçak veya bıçak kullanın.
RNAse dekontaminasyon solüsyonu: "RNase Zap"Thermo Fisher ScientificAM9780
Analitik teraziMettler ToledoXS64
Boya fırçasıDaler Rowney214900920Kriyoseksiyonları işlemek için kullanın. Basit sanat malzemeleri ile mağazalarda bulunabilir.
Tıraş bıçağıVWR Scientific55411-050
Mikroskop lamıVWR Scientific48311600
RNA organik ekstraksiyon reaktifi: TRIzolThermo Fisher Scientific15596026Dikkat: TRIzol tehlikeli bir kimyasaldır. Not: İskelet kasından RNA ekstraksiyonu için sadece organik ekstraksiyon reaktifleri önerilir.
18 gauge iğneVWR ScientificBD305185
22 gauge iğneVWR ScientificBD305155
26 gauge iğneVWR ScientificBD305115Opsiyonel. RNA ekstraksiyon protokolünde üçüncü bir numune öğütme turu için kullanılabilir.
1 ml şırıngaVWR ScientificBD309659Çok yüksek değerli numuneler için bir Luer-Lok şırınga önerilir (örn., VWR BD309628).
1-bromo-3-kloropentan (BCP)SigmaB9673
DEPC suyunda% 70 etanol için: 200 geçirmez alkolDecon Laboratories, Inc.+M18027161M35 ml 200 geçirmez alkol + 15 ml DEPC suyu karıştırın.
DEPC suyunda %70 etanol için: DEPC ile arıtılmış suThermo Fisher ScientificAM992235 ml 200 geçirmez alkol + 15 ml DEPC suyu karıştırın.
RNA saflaştırma kiti: PureLink RNA minikitThermo Fisher Scientific12183018ARNA hazırlamanın son adımları.
DNase/Rnaz içermeyen su Gibco10977DEPC ile arıtılmış su da kullanılabilir.
Spektrofotometre: Nanodrop 2000Thermo Fisher Scientific NanoDrop2000
Dnase IThermo Fisher ScientificAM2222Aşağı akış uygulamalarından önce herhangi bir DNA kontaminasyonunu gidermek için saflaştırılmış RNA'yı tedavi edin.
hidrofobik kalemThermo Fisher Scientific8899
Dulbecco'nun PBSGibco14190PBS'si.
Eşek serumuJackson ImmunoResearch Laoratories, Inc017-000-121Normal eşek serumu stoğunu üreticinin talimatlarına göre rehidre edin, ardından immünofloresan için bir alikotu %5'e seyreltin.  Normal keçi serumu da kullanılabilir.
eMHC antikoruIowa Üniversitesi Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma BankasıF1.652
Kollajen VI antikoruFitzgerald Industries#70R-CR009x
Eşek anti-tavşan AlexaFluor488Thermo Fisher ScientificA21206
Keçi anti-fare IgG1 AlexaFluor546Thermo Fisher ScientificA21123
DAPI (4',6- diamidino-2-fenilindol)Thermo Fisher ScientificD1306
Sulu montaj ortamı: PermafluorThermo Fisher ScientificTA-030-FMYalnızca solma önleyici özelliklere sahip floresan uygulamaları için tasarlanmış montaj ortamını kullanın.
Cam lamelVWR Scientific16004-314İmmünofloresan protokolün sonunda slaytları monte etmek için kullanın
Görüntü analiz yazılımı: ImageProExpressMedia Cybernetics, Inc.Image-Pro Express veya daha gelişmiş ürünlerÜcretsiz ImageJ, manuel sayım için de çalışmalıdır. Segmentasyon yeteneklerine sahip daha gelişmiş yazılımlar, sürecin kısmi otomasyonuna izin verebilir; ör, ImageProPremier.
Bölüm görüntülerini birleştirme ve eşleme: PhotoshopAdobePhotoshop
CardiotoxinSigmaC9659Sigma C9659 kullanımdan kaldırıldı. Kardiyotoksin için diğer seçenekler EMD Millipore #217503; Amerikan Özel Kimyasallar A.Ş. # BIO0000618; veya Ge Script # RP17303; Ancak bunlar doğrulanmadı.
ters transkripsiyon kiti: Üst simge III Birinci iplikli sentez sistemiThermo Fisher Scientific18080051Herhangi bir doğrulanmış, yüksek kaliteli ters transkripsiyon reaktifi kullanılabilir.
Standart PCR: GoTaq Flexi polimeraz sistemiPromegaM8298Herhangi bir doğrulanmış, yüksek kaliteli Taq polimeraz sistemi kullanılabilir. PCR'nin aşağı akışındaki herhangi bir uygulama için DNA dizilimi kullanılacaksa, bunun yerine yüksek kaliteli bir PCR sistemi kullanılmalıdır.
SYBR yeşilThermo Fisher ScientificS7585Özel bir qPCR ana karışımı kullanılmadığında qPCR'de kullanım için. SuperROX (Uygulamalı Biyosistem cihazları için) ve GoTaq Flexi polimeraz ve tamponları ile birlikte kullanın.
ROX: SuperROX, 15 mMBioResearch Technologies, Inc. Novato CASR-1000-10SuperROX, PCR reaksiyonunda daha kararlıdır, bu nedenle ROX (karboksi-X-rodamin) yerine qPCR pasif referans boyası olarak kullanılması tercih edilir. Applied Biosystems cihazları ile qPCR için
Gerçek zamanlı PCRApplied Biosystems7900HT
İmmünofloresan protokolü için

Kaynaklar

  1. Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
  2. Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
  3. Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
  4. Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
  5. Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20(2016).
  6. AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
  7. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
  8. Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211(2010).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).
  10. Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
  11. Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
  12. Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
  13. Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).
  14. Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
  15. Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
  16. Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
  17. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
  18. Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

RNA EkstraksiyonuHistolojik AnalizDoku Homojenizasyonune HomojenizasyonuHavuzlanm KriyokesitlerFare Tibialis Anterior KasuDoku Kesit alma
Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.