Method Article

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

DOI:

10.3791/55070

⸱

January 7th, 2017

 , 
12bind GmbH

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroScale Thermophoresis (MST), aptamer-hedef etkileşimlerini karakterize etmek için hassas bir teknolojidir. Bu el yazması, aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir MST protokolünü açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler etkileşimlerin bağlanma afinitesi, stokiyometri ve termodinamik gibi temel bağlanma parametreleri açısından karakterizasyonu, temel ve uygulamalı bilimlerde önemli bir adımdır. Mikro Ölçekli Termoforez (MST), bu önemli bilgiyi elde etmek için hassas bir biyofiziksel yöntemdir. Moleküllerin sıcaklık gradyanları boyunca hareketini tanımlayan termoforez adı verilen fiziksel bir etkiye dayanan bu teknoloji, çözeltideki bağlanma parametrelerinin hızlı ve hassas bir şekilde belirlenmesine olanak tanır ve tampon koşullarının (tampondan lizatlara/serumlara kadar) serbest seçimine izin verir. MST, bağlanmamış bir molekülün, bir bağlanma partneri ile kompleks halinde olan bir molekülden farklı bir termoforetik hareket gösterdiği gerçeğini kullanır. Termoforetik hareket, boyut, yük ve hidrasyon kabuğundaki değişiklikler nedeniyle moleküler etkileşim anında değişir. İki bağlayıcı ortağın farklı moleküler oranlarının hareket profillerini karşılaştırarak, bağlanma afinitesi (pM ila mM) gibi nicel bilgiler belirlenebilir. Aptamerler ve küçük bileşikler gibi küçük boyutlu moleküller arasındaki zorlu etkileşimler bile MST tarafından incelenebilir. DH25.42 DNA aptamer ve ATP arasındaki iyi çalışılmış model etkileşimini kullanarak, bu el yazması aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir protokol sağlar. Bu çalışma, MST'nin oldukça hassas olduğunu ve 7.9 kDa DNA aptamerinin bağlanma bölgesinin ATP'nin adenine haritalanmasına izin verdiğini göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

moleküller arasındaki etkileşim doğasının temelidir. Bu nedenle, temel ve uygulamalı araştırma birçok alanda bilim farklı moleküler etkileşimlerin temel ilkelerini anlamaya çalışın. Mikro Termoforesis (MST) tamponların bir özgür seçim ile, çözelti içinde moleküler etkileşimlerin hızlı, hassas, düşük maliyetli ve kalite kontrollü karakterizasyonu gerçekleştirmek için bilim adamları sağlar. Birden fazla bağlanma ortakları 1-8 ile olay doğrulamaları, rekabet deneyleri ve deneyleri bağlayıcı, kütüphane taramaları da dahil olmak üzere analizler farklı türde anlatan, yalnız 2016 den, MST kullanarak 1000'den fazla yayın zaten vardır. Genel olarak, MST, moleküler etkileşimin herhangi bir bağlanma afinitesi (mM'ye pM), stokiyometri ve termodinamik, klasik bağlanma parametreleri, çalışmasına izin verir. MST büyük bir avantajı etkileşimi mümkün boyutundan bağımsız bağlayıcı olayları incelemek için yeteneğidir. hatta çal'ıBu küçük moleküller, ilaçlar, antibiyotikler, veya metabolitler olarak zorlu bir yöntem, küçük nükleik asit aptamerler arasındaki etkileşimler (nt 15-30) ve hedefler belirlenebilir.

Güncel state-of-the-art teknolojileri aptamer hedef etkileşimleri laboratuvar yoğun ve son derece karmaşık ya vardır karakterize ya da aptamer-küçük molekül 9,10 etkileşimleri ölçmek için başarısız. Plasmon Rezonans (SPR) deneyleri 11,12 ve İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) 13-15, izokratik elüsyon 16, denge fi ltration 17,18 olarak gerçekten etiket içermeyen Kalorimetre yaklaşımları, tabanlı Surface, in-line 19 Jel- sondalama deneyleri vardiya, Durduğunuz akış fl uorescence spektroskopisi 20,21, floresan anizotropi (FA) 22,23, tek-molekül fl uorescence görüntüleme 24,25 ve Bio-katmanlı enterforemetre (BLI) 26 de aptamer-küçük molekül ile kesin olmayan veya uyumsuz ya vardır etkileşimleri. diğer principaBu yöntemlerin l sorunları düşük duyarlılık, yüksek numune tüketimi, hareketsizlik, yüzeylerde toplu taşıma sınırlamalar ve / veya tampon kısıtlamaları vardır. Bu teknolojilerin sadece birkaç toplama ve adsorpsiyon efektleri için entegre kontroller sağlar.

MST bilim adamları bu tür proteinlerin 30-33 olarak aptamers ve küçük moleküllerin 27-29 arasındaki etkileşimleri, yanı sıra diğer hedefleri incelemek için bu sınırlamayı aşmak için için güçlü bir araç temsil eder. Teknoloji sıcaklık değişimleri ile moleküllerin hareketine dayanır. Olarak adlandırılan bu yönlendirilmiş hareket, "Termoforosis," molekülün 34,35 büyüklüğüne, ücret ve hidrasyon kabuğu bağlıdır. moleküle bir ligand bağlanmasının doğrudan değiştirildi thermophoretic hareket ile sonuçlanan, aşağıdaki parametrelerden en azından birinin değiştirecektir. Küçük boyutları ile ligandlar bağlı duruma bağlanmamış gelen boyut değişim açısından önemli bir etkiye sahip olmayabilir, ama onlar dr olabilir hidrasyon kabuğu ve / veya şarj amatic etkiler. Bağlama ortağı ile etkileşim sonrası moleküllerin thermophoretic hareketinde değişiklik temel bağlanma parametreleri 2,7,34,36,37 ölçülmesini sağlar.

Şekil 1A 'de gösterildiği gibi, MST cihazı flüoresan tespiti için aynı optik kullanılarak cam kılcal olan numune üzerine odaklanmış bir kızıl ötesi lazer oluşur. Lazer sıcaklık gradyanı (2-6 ° C DT) kurarken tryptophans 6 ya da flüoresan bir etkileşim, ortak olarak 3,8 arasında içsel fl uorescence ile proteinlerin thermophoretic hareketi izlenebilir. Boşluk, DT, içinde sıcaklık farkı Soret ile belirlenebilir yüksek bir sıcaklıkta alanında azalması veya molekül birikmesine yol açar, Katsayı (St):

g "/>

C sıcak ısıtılmış bölgede konsantrasyonunu temsil eder, ve C, soğuk ilk olarak soğuk bölge konsantrasyonudur.

Şekil 1B, ilgili zaman dilimlerinde ayrılabilir farklı aşamalarında oluşan MST hareket profilinin (zaman iz), tipik bir MST deney sonuçları gösterildiği gibi. başlangıç ​​floresans kesin bir başlangıç ​​floresans tanımlamak ve ışıkla ağartma ya photoenhancement kontrol etmek için sıcaklık gradyanı yokluğunda yer alan birinci 5 saniye cinsinden ölçülür. Sıcaklık Jump (T-Jump) hangi floresan değişiklikleri thermophoretic hareketinden önce safhasını oluşturuyor. floresanstaki bu ilk azalma kuantum verimi uorophore fl ısıya bağlı değişikliklere bağlıdır. Termoforosis aşaması nedeniyle sabit durum dağılım kadar molekül thermophoretic hareketine flüoresans azalır (veya artar) ulaşıldığında edildiği izler.Lazer kapatıldıktan sonra Şekil 1B gösterildiği gibi ters TJump ve BM uorescent moleküllerin beraberinde geri difüzyon gözlenebilir. Temel bağlanma parametreleri erişmek için, etkileşim ortakları farklı molar oranları incelenmiş ve karşılaştırılmıştır. Optik görebilir molekülü sabit tutulur ve etiketlenmemiş ligandın artan bir miktarı ile temin edilir ise tipik olarak, 16 farklı oranlar bir MST deneyde incelenmiştir. İki bağlanma ortakları arasındaki etkileşim Termoforosis değişiklikleri uyarır ve bu nedenle normalize fl uorescence olarak aşağıdaki şekilde hesaplanır F norm:

figure-introduction-1

F sıcak ve F soğuk MST izleri de fi ned zaman noktalarında fl uorescence yoğunlukları ortalama temsil eder. Bağlanma ilgileri (Kd ve EC50 değerleri) Curv hesaplanabilire uydurma (Şekil 1C).

Genel olarak, MST her türlü moleküler etkileşimleri çalışmak için güçlü bir araçtır. ve 25-nt kısa ssDNA aptamer DH25.42 (7.9 kDa); Bu yazının küçük molekül adenozin trifosfat (0.5 kDa ATP) arasındaki zorlu etkileşimi karakterize bir protokol sunar. Yazının boyunca ATP molekülü üzerindeki aptamer bağlanma yeri ATP adenin grubuna aşağı eşleştirilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptamer Çalışma Stok 1. Hazırlık

  1. Üreticinin talimatlarını takip ve 100 uM nihai konsantrasyon ulaşan su (18 referans 5-Cy5 CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sıra) oligonükleotidi çözülür.
  2. Bağlama tamponu ile 200 nM oligonükleotid stokları seyreltilerek aptamer çalışma çözeltisi hazırlayın (20 mM Tris, pH 7.6, 300 mM NaCI, 5 mM MgCl2,% 0.01 Tween 20).
  3. 90 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe karışımı Numune hemen buz üzerinde soğuması ve oda sıcaklığında örneğini kullanır.

Ligand seyreltme serisi 2. hazırlanması

  1. ) SAM (her ligandın (adenozin trifosfat (ATP), adenosin difosfat (ADP), adenosin monofosfat (AMP), adenin, guanosin trifosfat (GTP), sitosin trifosfat (CTP) deoksiadenosin trifosfat (dATP), ve S-adenosil metiyonin ; 10 mM stok her), bir 16 adım seri diluti hazırlamaküzerinde 200 ul mikro reaksiyon tüpleri.
    NOT: agrega kaldırmak için yardımcı olabilir 14.000 xg'de 5 dakika boyunca ligand stoklarının Santrifüj. Düşük hacimli, düşük bağlanma reaksiyon tüpleri tüp duvarları moleküllerin adsorpsiyonu önlemek için tavsiye edilir.
  2. Tahmini yakınlığından daha yüksek, en az 50 kez maksimum konsantrasyonu ile başlar ve her seyreltme basamağında% 50 lıgand konsantrasyonunu azaltır.
    NOT: Kontrol yazılım uygulanan konsantrasyon bulma aracı bağlama verileri taklit ve seyreltme serileri için doğru konsantrasyon aralığı bulma yardımcı olur.
  3. 16 mikro tepkime tüpleri içine 2 aptamer bağlanma tamponu 10 ul ekle borunun 1 ligand stok (10 mM) 20 ul doldurun.
  4. Transferi 10 tüp 2 tüp 1 ul ve yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı düzgün karıştırın. Bir sonraki tüp 10 uL aktarın ve kalan tüpler için bu seyreltme tekrarlayın.
  5. Son tüpten 10 ul fazlalığı atın. Herhangi b önlemekUffer dilüsyon etkisi. tüp 1 ve tüpler 2-16 tampon aynı olmalıdır.

Nihai reaksiyon karışımı 3. hazırlanması

  1. Pipetleme hatalarını en aza indirmek için, bireysel bağlama 20 | il hacminde reaksiyonları (aptamer hazır çözelti + ilgili ligand seyreltme 10 ul, 10 ul) hazırlayın. Sadece 4 ul bir hacim kılcal ll fi oluşturulmasına yeterli olduğunu.
  2. Her bir bağ seyreltme 10 ul 200 nM aptamer çalışma çözeltisinin 10 ul ilave edin ve pipetleme ve birkaç kez aşağı doğru karıştırılır.
  3. numune içine kılcal damarların batırarak standart kılcal damarların içine numunelerin ll oda sıcaklığında ve fi 5 dakika boyunca örnekleri inkübe. Daha uzun inkübasyon süreleri, bazı etkileşimler için gerekli olabilir; Bununla birlikte, 5 dakika için en uygundur. DEĞİL optik ölçüm alınacak orta kısmında, üzerinde, sadece tarafta kılcal dokunun.
  4. th üzerine kılcal yerleştirine kılcal tepsisi ve MST cihazı başlatmak.

4. MST Cihazı Başlangıç

NOT: Cihaz iki önceden yüklenmiş yazılım paketlerini, üretilen verilerin yorumlanması için yazılımın ' "' analiz kontrolü deneysel koşullar ve teknik kurulumu için yazılım '" sağlar.

  1. MST cihazın içine kılcal tepsisini yerleştirmeden önce, kontrol yazılımını başlatmak ve 'açılır menüden' " 'sıcaklık kontrolü de" el sıcaklık kontrolü sağlamak' seçerek genel istenilen sıcaklığa ayarlayın. Bu şekilde, 25 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlayın.
    Not: MST araçlar ısı kontrollü, 45 ° C 22 arasında olabilir.
  2. Beklenen seviyeye ulaşmak için sıcaklık bekleyin ve ardından MST cihazın içine kılcal tepsiye yerleştirin.
  3. Cy5 boyalar için "kırmızı 'LED kanalı ayarlamak ve bir fl uorescenc kazanmak için LED güç ayarlamakStandart sensör MST cihaz 300 ila 1000 floresans birimleri e sinyali. % 25 LED güç bu çalışmada kullanılmıştır.
    NOT: 6,000 18,000 floresan üniteleri yüksek hassasiyetli sensörü ile MST için tavsiye edilir.

5. Kılcal Tarama

  1. "Kontrol" yazılım üzerinde kılcal konumunu seçme ve tıklayarak numunenin farklı kalite yönlerini kontrol etmek için bir kılcal taraması yürütmek "kap tarama başlatmak" MST ölçümü başlamadan önce.
  2. floresan geliştirme / söndürme ve yazılım sokma etkileri (zirveleri U-şeklinde veya düzleştirilmiş) için kılcal taraması kontrol edin.
    Not: algılama ve floresan işlenmesi ve yapışma etkileri hakkında daha fazla ayrıntı tartışma bulunabilir.

6. MST Ölçümü

NOT: MST ölçümü başlamadan önce, dışlamak emin olun yapışmasını etkileri, geliştirme / söndürme etkisi, ya dapipetleme hataları ve kılcal tarama fl uorescence sinyali oluşturulmasına yeterli olduğunu gösterir emin olun. Daha fazla bilgi için, tartışma bakın.

  1. . '' Kontrolü "yazılım ilgili kılcal konumuna sulandırma dizileri 'nden ligand konsantrasyonları atama aptamer liganda karıştırma seyreltme adım olarak (1: 1).
  2. Kılcal # 1 için ligand yüksek konsantrasyon (5 mM) doğru olarak girin seyreltme türünü seçin (burada, 1: 1), maksimum konsantrasyon tıklayın ve otomatik kılcal kalan konsantrasyonlarını # 2- atamak için sürükle işlevini kullanın 16. düşük konsantrasyon 152.6 nM'dir.
  3. kontrol yazılımı ilgili bölümündeki fl uorescent aptamer (burada, 100 nM) konsantrasyonunu girin.
  4. 5 sn fl uorescence tespit varsayılan ayarları kullanın 30 sn MST kayıt ve lazer t inaktivasyonu sonra başka bir 5 saniye floresan kayıt o moleküllerin geri emilimini izlemek.
  5. kontrol yazılımı ilgili bölümündeki% 20 lazer gücünü ayarlayın.
    NOT: sipariş en iyi sinyal-gürültü oranını almak ve belirsiz etkileri önlemek için ise,% 20-40 bir lazer güç tavsiye edilir. Belirli durumlarda, daha yüksek bir lazer gücü bağlanmamış ve bağlanmış moleküller, iyi bir ayırma için gerekli olabilir.
  6. Hedef klasörü seçtikten sonra deney kaydedin ve 'Başlat MST ölçümü "düğmesine basarak MST ölçümü başlatmak.
    NOT: .ntp dosyası hedef klasörde oluşturulur. Bu kurulumu kullanarak, bir ölçüm 10-15 dakika sürer.
  7. EC50 değeri daha doğru bir şekilde belirlenmesi için en az iki kez deney prosedürü tekrarlayın.
    Not: Teknik tekrarlanabilirliğini test etmek amacıyla, aynı kılcal taranabilir birkaç kez (Teknik tekrarlar).

7. MST Veri Analizi

nt "> Not: analiz yazılımı ölçüm sırasında fl y ilişkin verilerin analizini sağlayan analiz yazılımı ligand konsantrasyonu 37 karşı MST zaman izleri ve normalize fl uorescence (F norm) değişiklikleri çizer..

  1. MST analiz yazılımı (MO.Affinity Analizi) başlatın ve hedef klasörden .ntp dosyasını yüklemek. veri seçme menüsünde analiz türü olarak "MST" i seçin.
    Not: liganda bağımlı floresans etkileri durumunda, başlangıç ​​floresans analizi için seçilebilir.
  2. sürükle-bırak yöntemiyle veya ilgili deneysel çalışma altındaki "+" düğmesine basarak yeni bir analize ilgili teknik veya biyolojik run (ler) ekleyin.
  3. Deneyin, MST izleri, kılcal tarama, kılcal şekli, ilk floresan ve ağartma oranı özellikleri hakkında bilgi edinmek için ilgili deneysel çalışma Aşağıdaki bilgiler düğmesine basın.
    NOT: Bu ham veriler can albu yüzden analizin daha sonraki adımlarda kontrol edilmelidir.
  4. Görme görünür darbelere ve ani olarak toplama ve yağış etkilerinden MST izleri, kontrol edin.
    NOT: algılama ve toplama etkilerinin aktarılması konusunda daha fazla bilgi için, tartışma okudum.
  5. Görme düzleştirilmiş ya da U-şekilli zirveleri olarak görünür kılcal tarama ve adsorpsiyon etkileri kılcal şekil bindirme, kontrol edin. Görme kılcal tarama ve floresan efektleri için ilk floresan inceleyin. Görme etkileri photobleaching için ağartma oranını kontrol edin.
  6. doz-yanıt moduna geçin ve ilgili düğmeye basarak kadar "uzman" mod analizi ayarını değiştirin. MST değerlendirme stratejisi olarak "T-Jump" seçeneğini seçin.
  7. eğri fi tting için "Tepe" modelini seçin. bağlayıcı parametreleri otomatik olarak hesaplanacaktır. "Sonuçları karşılaştırmak" menüsünden normalleşme ilgili türünü seçerek veri normalleştirmek. ihracatBir .xls veya .pdf gibi ya veri.
    NOT: bağlayıcı grafiğin Aşağıdaki tabloda hesaplanan bağlanma parametreleri özetlemektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, MST ATP DH25.42 DNA aptamer 18 bağlanma sitesi karakterize etmek için uygulanmıştır. ATP veya rasgele bir veya daha fazla fluorophores 38-40 ile etiketlenmiş proteinler ile küçük moleküller ATP'ye taklit etkileşimlerini karakterize eden başka çalışmalardan farklı olarak, bu çalışma 5'ucundaki bir Cy5 molekülü ile 7.9 kDa ssDNA aptamer etiketlenmiş bir versiyonunu içerir . Farklı ATP türevlerinin ve ilgili moleküllerin, çeşitli pozisyonlarda ATP'den far...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalite kontrolleri:

Spesifik olmayan yapışma / yüzeylere örnek malzeme, hem de çekiş etkileri adsorpsiyon, afinite verinin kalitesi üzerinde önemli bir etkisi vardır. Ancak, sadece bir kaç state-of-the-art teknolojileri izlemek ve bu etkilerden kaçınmak için doğru ve hızlı seçenekler sunuyoruz. MST algılar ve teknik kurulum adım adım optimizasyonu sağlayan, bu sorunların üstesinden gelmek için yardımcı entegre kalite kontrolleri sunmaktadır. toplama / yağış etkileri (adım 7.7) hareket profiller...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CE ve TS biyofiziksel analitik hizmet vermektedir 2bind GmbH çalışanlarıdır. Bu video-makale için yayın ücreti 2bind GmbH tarafından karşılanır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir onayları var.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aptamer bağlayıcı tampon20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; %0.01 Ara-20
Floresan etiketli ATP aptamerIDT, Leuven, Belçikadizisi: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATPSigma Aldrich, Almanya A238310 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C
ADPSigma Aldrich, Almanya A275410 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C
AMPSigma Aldrich, Almanya A225210 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C
AdenineSigma Aldrich, Almanya A862610 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de saklanır; C
SAMSigma Aldrich, Almanya A700710 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C
dATPSigma Aldrich, Almanya 1193451100110 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C
CTPSigma Aldrich, Almanya C150610 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C
GTPSigma Aldrich, Almanya G887710 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C
Monolit NT.115 NanoTemper Teknolojileri, Münih, AlmanyaMO-G008Mavi/Kırmızı Kanal
Standart dedektörlü MST cihazı, Monolith NT115 pico, yüksek hassasiyetli dedektöre sahip MST cihazıdır
Monolith NT.115 kılcal damarlar StandartNanoTemper Teknolojileri, Münih, AlmanyaMO-K002
Eppendorf PCR tüpleriEppendorf, Almanya30124537
Monolith kontrol yazılımı. 2.1.33, önceden yüklenmiş cihazNanoTemper Teknolojileri, Münih, Almanya
MO.affinity analizi v2.1.1NanoTemper Teknolojileri, Münih, Almanya
Kaleidagraph 4.5.2Sinerji Yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100(2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913(2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14(2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705(2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948(2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403(2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103(2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546(2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518(2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MicroScale ThermophoresisAptamer Binding SiteDNA AptamerSmall Molecule InteractionBinding AffinitySerial DilutionFluorescence DetectionCapillary ScanHill ModelBinding Parameters

Related Articles