Yöntem makalesi

Xeno-ücretsiz Koşullarda 3-D Kültürler Üretim ve Tedavi Mezenkimal Kök Yönetim / Stromal Cell (MSC) küremsi Astarlı

11.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55126

⸱

18 Mart 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mary Hardin-Baylor, 2Department of Pediatrics, University of Texas Medical Branch, 3Multi-Organ Support Technology Task Area, U.S. Army Institute of Surgical Research, 4Internal Medicine, Texas A&M University Health Science Center

Bu makalede

Özet

Mezenkimal kök/stromal hücrelerin (MSC'ler) terapötik potansiyeli iyi belgelenmiştir, ancak hücreleri hastalar için hazırlamanın en iyi yöntemi tartışmalıdır. Burada, deneysel ve klinik uygulamalar için kseno içermeyen koşullar altında hazırlanmış MSC'lerin terapötik küresel agregalarını veya 'sferoidlerini' verimli bir şekilde oluşturmak ve yönetmek için protokoller iletiyoruz.

Özet

Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH) Biyomühendislik ve rejeneratif tıpta büyük umutlar tutun. MSC'ler doku kültür plastik güçlü yapışması ile birden fazla yetişkin dokulardan izole edildi ve daha sonra en sık fetal sığır serumu (FBS) ile, in vitro olarak genişletilebilir. FBS MKH'ler immünojenik hale gelmesine neden olabilir beri, MSC kültürlerde varlığını hücrelerin hem klinik hem de deneysel uygulamalar sınırlar. MSC kültürleri Bu nedenle, çalışmalar kimyasal olarak tanımlanmış istihdamı xeno-free (XF) medya son derece değerlidir. MSC yararlı etkilerinin büyük bir tümör nekroz faktörü ile uyarılan gen 6 (TSG6) ve prostaglandin E2 (PGE2) gibi başlıca bağışıklık faktörlerin salgılanması sayesinde, inflamasyon ve bağışıklık düzenleme kabiliyetleri bağlanmıştır. Ancak, MKH bu faktörlerin üretmek için aktivasyon gerektirir ve MKH etkisi genellikle geçicidir, çünkü büyük ilgi hücreleri Prio öncesi aktive yollarını keşfetmek için ortaya çıkmıştırkullanımlarına R, ve böylece in vivo olarak aktivasyon için gecikme süresini ortadan kaldırır. Burada üç boyutlu (3D) kültürlerde etkili bir şekilde harekete geçirmek için protokoller ya da asal MKH'lerin sunuyoruz kimyasal olarak tanımlanmış XF koşullar altında ve in vivo bu ön-aktifleştirilmiş MKH'lerin uygulanması. Özellikle, ilk XF orta kullanarak küresel MSC mikro dokuları veya asılı damla 'parçacıklarının' oluşturmak ve küreler ve klimalı ortam (CM) çeşitli uygulamalar için hasat edilebilir göstermek için yöntemler açıklanmaktadır. İkinci olarak, gen ekspresyon ekranlarını tarif ve in vitro fonksiyonel deneyleri, hızlı hücre anti-enflamatuar ve anti-kanser potansiyeli vurgulayan parçacıklarının MSC aktivasyon seviyesini değerlendirmek. Üçüncü olarak, in vivo etkinliği test etmek için, fare periton boşluğuna sağlam MSC sferoidler enjekte etmek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Genel olarak, protokoller burada kimyasal olarak tanımlanmış XF con altında önceden etkinleştirilmiş MKH'lerin elde büyük zorlukların üstesindenkoşullarına ve tedaviler için MSC parçacıklarının yönetmek için esnek bir sistem sağlamak.

Giriş

Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH), çeşitli rejeneratif tıp yaklaşımları için büyük bir potansiyel göstermiştir. MSC'ler, başlangıçta, kemik iliği stromal bileşeni olarak izole edildi, ancak bu yana adipoz doku 1, 2, 3 dahil olmak üzere, pek çok diğer yetişkin dokulardan elde edilmiştir. İlginç bir şekilde, temel izolasyon yöntemi MSC gibi önemli bir özelliğe fetal sığır serumu (FBS) varlığında doku kültürü plastik üzerine sıkı bir şekilde yapışmasına içine alır. Bu geleneksel izolasyon tekniği iki boyutlu (2D) kültüründe MKH kolay ve hızlı genişlemesine izin veren iken, 5, aynı zamanda çok yapay ve önemli hücresel özellikleri 4 potansiyel kaybına yol açan doğal üç boyutlu (3D) çevrenin önemini göz ardı 6. Bu nedenle, 3D kültürlerde MSC çalışma, buradageleneksel 2B kültürlerin daha fizyolojik olan "kayıp / azalmış" MSC özellikleri arayışında ortaya çıkmıştır. Ayrıca, büyük ilgi klinik uygulamalar için hücreler daha müsait hale böylece MSC kültür ve aktivasyonu için xeno-free (XF) kimyasal olarak tanımlanmış koşulları tanımlamak ve yükseldi.

Birçok çalışma biyomalzeme ve küresel agrega ya da küresel cisimler hem MKH 3D kültürünü gösteren yayınlanmıştır. MKH sfero kültürleri klinik öncesi veya klinik çalışmalarda tedaviler için hücrelerin uygulanmasından sonra in vivo MSC davranışlarını anlamak için bir yol olarak görüldü oysa biyomalzeme MKH başlangıçta, hücre numaralı seribaşı iskeleleri ile hasarlı dokuların yerine doku mühendisliği yaklaşımları için tasarlanmış 4, 5, 7. İlginçtir, MKH formu sferoidler kendiliğinden doku kültürü plastik bağlılık izin verilmez zaman8, 9, 10. Geleneksel olarak, hücre birikme Spinner şişesi yöntemleri ya da sıvı kaplama teknikleri, tümör mikro taklit deneyin çabalarında Kanser biyolojisinde başlangıç ​​olarak kullanılan yöntemler ile kolaylaştırıldı. Daha yakın zamanda, ilave yöntemler kültür tabaklarına hücre toplanması hücre-plastik yapışma 4, 5, 6 önlemek için özel kimyasallar ile önceden kaplanmış göstermektedir ki ortaya çıktı. MSC sferoidler oluşturmak için en basit ve en ucuz yöntemlerden biri, genellikle, embriyonik kök hücreleri embriyoid organları üretmek için kullanılan bir teknik, asılı damla kültür bunların etmektir. damla kültürü tekniği asılı olan, doku kültürü plastik hücre yapışması, hücre aggreg kolaylaştırmak için yerçekimi, bir doku kültürü kabı kapağının altında ortamının bir drop içinde süspansiyona ettirilip engellenirdamla tepesinde yer tirme. sfero boyutu kolayca, hücre konsantrasyonunu veya açılan hacmini değiştirerek kontrol etmek son derece kolay asılı damla kültürleri yaparak manipüle edilebilir.

MKH 3D kültürü üzerindeki ilk çalışmalar onların 2B meslektaşları 6, 8, 9 ile karşılaştırıldığında 3D hücrelerin özelliklerinde radikal farklılıklar göstermiştir. Aynı zamanda, in vivo koşullarında raporlar MSC yararlı etkileri, yanıt olarak, mikro çevre hareketlerine göre aktive olma, anti-enflamatuar ve bağışıklık düzenleyici olarak 11 üretme yetenekleri dayanıyordu olduğunu göstermiştir. İlginç bir şekilde, prostaglandin E2 (PGE2), tümör nekroz faktörü ile uyarılan gen 6 (TSG6), hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve bu faktörlerin bir çok yol açan geleneksel 2D MSC daha MSC sferoidler göre çok daha büyük miktarlarda üretilmiştir fikrihücreler 8, 12, 13 aktif hale getirmek için 3D kültürleri kullanılmıştır. Ayrıca, 3D kültürlerinde gen aktivasyon fareler 12 içine enjeksiyondan sonra hücre aktivasyonunun, en azından kısmen, mekanizmaları özetlemek ortaya çıktı. In vivo geleneksel MSC etkisi genellikle gecikmeli ve geçici ve "vurmak ve koşmak" olarak tarif edilebilir gibi deneylerde bunların kullanımdan önce MKH'lerin aktive ederek, hücrelerin etkileri uzun süreli ve daha belirgin olabilir. Geçtiğimiz birkaç yıl boyunca, MSC küremsilerin kullanılması önemli fonksiyonel çalışmalar, bunların enflamatuar cevapları bastırma ve sferoidler hazırlanmış MSC 2 çekici formu hale makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller ve T hücreleri gibi efektör hücrelerin etkileyerek, in vivo olarak bağışıklık modüle olduğunu göstermiştir 3. Buna ek olarak, int anti-kanser moleküllerinin üretimierleukin-24 (IL-24) ve tümör nekroz faktörü ile ilgili apoptoz-indükleyici ligand (TRAIL), erişkin mono tabakasına MSC'ler nisbetle 3D kültürlerinde hedeflenen kanser tedavileri 8, 10, 14 için yararlanılabilir bir olgu artar.

Geleneksel MSC kültür doku kültürü plastik değil, aynı zamanda FBS kullanımı sadece gerektiği gibi klinik kullanımı aşılması gereken vardı, başka bir engel MSC sferoidler daha müsait hale getirmek için. Bu engel üstesinden gelmek için, son zamanlarda, belirli kimyasal olarak tanımlanmış XF koşulları altında MSC parçacıklarının oluşumunu göstermiştir ve elde edilen MSC sferoidler FBS 14 koşullarda üretilen parçacıklarının aynı anti-enflamatuar ve anti-kanser molekülleri üretmek üzere aktive edilmiştir saptamıştır. Burada, bu bulgular XF kullanarak 3D kültürlerde önceden aktive MKH nesil gösteren birçok ayrıntılı protokoller sunulmuşturOrtam. Buna ek olarak, protokoller birlikte farelere sağlam sferoidler sunmak için pratik bir yöntem ile, anti-enflamatuar, bağışıklık düzenleyici ve anti-kanser etkilerine açısından MSC aktivasyon seviyelerini değerlendirmek için etkili yollar tarif eden sunulmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. MSC İzolasyon ve Genişleme

  1. Erken geçiş Hazırlama Merkezi'nden MKH'lerin ve Erişkin Kök Hücre (Dağılımı elde http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 olarak dondurulmuş flakon. Alternatif olarak, rutin bir protokol 14 aşağıdaki kemik iliği gelen MKH'lerin izole ve dondurulmuş şişeleri saklamak.
  2. minimum temel ortam (αMEM) FBS, 2 mM L-glutamin seçin% 15-20 prim ile takviye edilmiş a ve 1 x penisilin-streptomisin tam kültür ortamında (CCM) hazırlayın. süzme ile orta sterilize edin.
  3. 150 mm hücre kültür çanağı içine CCM 30 ml yerleştirilir ve% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de 30 dakika süreyle etiketlenir inkübe edin.
  4. 37 ° C su banyosu içinde 2 dakika süreyle yaklaşık 10 6 MKH'lerin ihtiva eden dondurulmuş şişesinden inkübe edin.
  5. 5 ml'lik serolojik pipet kullanarak kültür çanak şişenin içeriğini aktarmak ve artık hücreleri yakalamak için çanak 1-2 ml CCM ile flakon birkaç kez yıkayın. Uygun bir inkübatör çanak gecede yerleştirin.
  6. Dikkatlice oda sıcaklığında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) ile iki kez kültür yıkama ve önceden ısıtılmış,% 0.25 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi 3 ml MKH'lerin ayırın. Müfreze genellikle inkübatör yaklaşık 3-4 dakika sürer.
  7. 6 mi CCM önceden ısıtılmış 37 ° C çanak tripsin nötralize ve 50 ml konik bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu aktarın. Hücre verimi en üst düzeye çıkarmak için PBS yıkar ile birleştirin.
  8. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücreler (450 xg) santrifüj ve süpernatan aspire.
  9. CCM küçük bir hacim içinde hücrelerin yeniden askıya ve bir hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri sayın.
  10. 100 hücre / cm 2 150 mm yemekleri uygun sayıda tohum sıcak CCM 30 ml, yaklaşık% 70-80 konfluent kadar kültürleri inkübe genellikle 7 gün.
  11. tripsin / EDTA ile yukarıdaki gibi hücreler hasat ve uygun ortam ile tek bir konik tüp içine tüm hücreleri birleştirir. Tekrar santrifüj ve hücre sayımları için aynı ortamın küçük bir hacme içine hücreleri yeniden askıya. Standart CCM (FBS ihtiva eden) veya çeşitli ticari olarak temin edilebilir XF ortam formülasyonları kullanarak, burada ve insan serum albumini içermeyen iki, XF orta 1 (XFM-1) ve XF orta 2 (XFM-2) olarak adlandırılır (HSA, 13 mg / ml) takviyesi.

XF Koşullarında Damla Kültürler Asma 3-D Aktif MSC küremsi 2. Hazırlık

  1. Yaklaşık 25,000 hücre küremsiler oluşturmak için, CCM olarak hasat mezenkimal, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2 veya XFM-2 + HSA 714 hücre (13 mg / ml) seyreltin / ul.
  2. hücrelerin pipetle 35 ul / damla üzerine150 mm ters kültür çanak kapağın alt. Çoklu damla kolayca çok kanallı pipet kullanarak pipetle edilebilir.
    NOT: Daha büyük veya daha küçük sferoidler istenirse, hücre konsantrasyonunu veya uygun damla hacmi (25-45 ul) değiştirin.
  3. çanak tabanına oda sıcaklığında 20 ml PBS aktarın ve bir sürekli ve düzgün bir hareketle damla uçlarının aşağı doğru gelecek şekilde bu, damlası içeren, kapağı çevirmek. kültür çanak baz dikkatlice kapağını yerleştirin.
  4. Uygun küre tertibatını izin için bozmadan 3 gün boyunca kuvöz içine çanak aktarın.
  5. 72 saat sonra, dikkatlice kapağı kaldırma ve damla, bir kez daha, yukarı bakacak şekilde onu ters çevrilerek sfero hasat başlar.
  6. Açı yaklaşık 10-20 ° kapak ve bir hücre kaldırıcı kullanılarak plaka kenarına, parçacıklarının içeren damla itin.
  7. 1.000 ul borusu ile 15 ml konik tüp içine küreler ve orta aktarıntte. Kullanım oda sıcaklığı PBS ve plaka yıkayın ve parçacıklarının maksimum iyileşme sağlamak için aynı ucu ile pipet.
  8. Gerçek zamanlı PCR testi (protokol 3) için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 xg'de küre süspansiyonu santrifüj ve süpernatant aspire. PBS ile parçacıklarının yıkayın ve her iki santrifüj ve aspirasyon adımları tekrarlayın. hayvanlara teslim (protokol 8) için, küre santrifüj olmadan tüp (~ 3-4 dk) alt yerleşmek için izin verir.

Anti-enflamatuar ve anti-kanser markerleri 3. Real-time PCR

  1. DNA içermeyen, toplam tek tabaka MSC RNA (Protokol 1), PBS ile yıkandı ve santrifüj edildi MSC sferoidler (Protokol 2) izole etmek için bir homojenleştirici kolon ve RNase-barındırmayan DNase Set RNA özütleme kiti kullanarak.
  2. Lyse en az 100.000 tek katmanlı MSC'ler ve ayrı 15 ml her bir durum 20 sferoidler RLT tamponu β-merkaptoetanol (1: 100) ihtiva eden konik borular.
  3. Trans1.5 ml RNase içermeyen tüpleri içine iyice karıştırılır lizatları fer ve küremsi liziz yardım etmek için bir derin dondurucu (-80 ° C), en az 3 saat içine koyun.
  4. kısaca buz, vorteks hücre lizatları çözülme ve piyasada bulunan bir memeli toplam RNA izolasyon kiti kullanılarak RNA izolasyonu için üreticinin talimatlarına uyun.
  5. Sayısal olarak ve bir spektrofotometre kullanılarak izole edilmiş RNA kalitesini değerlendirmek.
  6. Gerçek zamanlı PCR için cDNA oluşturmak için, üreticinin talimatlarına Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti veya eşdeğer göre kullanım.
  7. Buz üzerinde cDNA örnekleri, ticari olarak tasarlanmış gerçek zamanlı PCR primerleri / probu (gen sentezleme) ve PCR Master Mix yerleştirin. GAPDH (kontrol), PTGS2 (COX-2, anti-enflamatuar) için primerler / sondaları kullanarak, TNFAIP6 (anti-inflamatuar TSG6), Yol (anti-kanser) ve IL-24 (anti-kanser).
  8. Gen sentezleme ve de Hızlı Unive için imalatçının talimatlarına uygun olarak, gerçek zamanlı PCR reaksiyonları hazırlanmasırsal Master Mix.
  9. Deney belgeleri üreten ve çalıştırmak gerçekleştirmek için real-time PCR araç için yönergeleri izleyin.
  10. Bazal 8, 14 olarak endojen kontrolü ve tek tabakalı MKH olarak GAPDH kullanılarak gen ifadesinde göreceli değişiklikler (göreceli miktarı, RQ) hesaplayarak ΔΔC T yöntemini kullanarak verileri analiz edin.

Immünomodülatör ve Tahliller ve Anti-kanser Potansiyel CM 4. Koleksiyonu

  1. Ancak, bir hücre hırsızı ve bir pipet kullanarak, 15 ml konik tüp içine yukarıda açıklandığı gibi bu CM sulandırmak gibi PBS ile çanak kapakları yıkama yok parçacıklarının ve CM hasat.
  2. dikkatli bir şekilde bir pipet ile hücresiz süpernatan toplamak, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ve 1.5 ml tüpler içine süpernatant aktarın.
  3. dikkatle cl toplamak oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjarified bir pipet CM ve bir dondurucu içinde depolama için yeni 1,5 ml tüpler içinde CM transferi (-80 ° C). Birden deneyleri için kullanırken önce donma CM hacimde hazırlayın.
    Not: Ön alt tahliller yapmak için PGE2 konsantrasyonu, CM anti-inflamatuar potansiyelinin iyi bir göstergesidir, üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir ELISA kiti kullanılarak tespit edilebilir. TSG6 konsantrasyonu yayınlanmış bir protokol 14 kullanılarak belirlenebilir.

5. Makrofaj Deneyi MSC-CM Anti-inflamatuar Potansiyeli değerlendirin

  1. L-alanil-L-glutamin içeren ve FBS ve 1 x penisilin-streptomisin seçin% 10'luk ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) oluşan makrofaj orta, hazırlayın. Filtre sterilize orta.
  2. Yaklaşık 10 6 J774 fare makrofaj dondurulmuş şişesinden elde edilir ve 37 ° C su banyosu içinde 2 dakika süreyle flakon inkübe edin.
  3. 15 ml konik bir tüp içine şişenin aktarın 200-300 xg ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca makrofaj orta ve santrifüj 9 ilave edin.
  4. Süpernatantı aspire makrofaj ortamın 1 ml makrofajlar askıya ve makrofaj ortam, 30 ml ihtiva eden bir 150 mm petri kabı içine makrofajlar aktarın.
  5. 2 günde orta değiştirmek ve yaklaşık% 70-80 konfluent kadar inkübatör hücreleri kuluçkaya yatmaktadır.
    Not: makrofajlar ve böylece bir değiştirilen ortam içinde hücreler kaybetmemek için alınması gereken bakım, petri sıkıca bağlı değildir.
  6. Bir pipet yardımıyla hücreleri üzerine makrofaj orta püskürtülerek makrofajlar hasat. 200-300 xg ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 50 ml konik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri aktarın.
  7. süpernatan aspire ve bir hemositometrede hücre sayımları için makrofaj orta küçük bir hacim içinde hücrelerin süspansiyonu. makrofaj Me ile 200,000 hücre / ml'ye konsantrasyonu ayarlamakdium.
  8. Makrofaj deneyi için ayarlanmış başlangıç ​​12-kuyulu plakanın kuyularına makrofaj ortamın 480 ul ekleyin.
  9. Uyarılmamış kontrol kuyularına makrofaj ortamı 20 ul ekleyin ve 20 ul olmayan şartlandırılmış ortam MSC durumunu, deney kuyu içinde yukarıda hazırlanan. plaka dokunarak kuyularda orta karıştırın.
  10. uyarılmamış makrofaj kontrol oyuklarına makrofaj hücre süspansiyonu 500 ul aktarın.
  11. 500-1: 1 ilave edilerek kalan makrofajlan uyardığı 1,000 0.1 / ml lipopolisakarit (LPS) mg, oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkalayın.
  12. klimalı olmayan veya MSC klimalı ortam ile kuyuların içine uyarılan makrofajlar 500 ul aktarın. sürekli plaka birkaç kez sallayarak kuyu karıştırın.
  13. 16-18 saat boyunca bir kuluçka plaka aktarın.
  14. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 xg'de makrofaj koşullandırılmış bir ortam ve santrifüj hasat edilir.
  15. transferÜreticinin talimatlarını takip ticari ELISA kitleri ile tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) ve interlökin-10 (IL-10) içeriği için yeni boru ve tahlil yüzer.

6. Splenocyte Deneyi Sfero-CM İmmünomodülatuar Potansiyeli değerlendirin

  1. Rosewell Park Memorial Institute (RPMI),% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS, 1 x penisilin-Streptomisin ile desteklenmiş -1640 orta ve 2-merkaptoetanol içermektedir tam splenosit ortamı hazırlar. Filtre sterilize orta.
  2. Dalak üzerinde karnın sol tarafında hazırlanan bir kesiden ötenazi-erkek BALB / c farelerinden Hasat dalak, yaklaşık ön arasında orta yollu ve bacaklar 14 hind. Splenositlerin 14 izole etmek bir 70 mikron hücre süzgecinden için dalak aktarın.
  3. steril bir petri usin içine 70 mikron süzgeç vasıtasıyla dalak iterek splenositler / lenfositler izole etmekg 2-3 bir pistonun yumuşak kauçuk / plastik uç 14 şırınga ml. dalak ayırmak için bir taşlama dairesel hareketler kullanın.
  4. soğuk PBS ile hücre süzgeç birkaç kez yıkayın ve bir 50 ml konik tüp içine petri hücreleri aktarın. 10 dakika süre ile 4 ° C de soğuk PBS ve santrifüj (500 x g) ile tüp doldurun.
  5. Süpernatant aspire ve 5-10 dakika boyunca (dalak başına) 5-10 mi alyuvar lisiz çözeltisi ile kuluçkaya yatırılması ile eritrositlerden hücreleri temizlemek.
  6. 500 x g'de 5-10 dakika boyunca, 4 ° C'de tüp ve santrifüj soğuk PBS eklenerek lizis durdurun.
  7. Tam splenosit ortamda izole hücreler Askıya 40 mikron süzgecinden filtre ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 10 6 hücre / ml'lik bir nihai hücre yoğunluğu elde etmek için, hücre süspansiyonuna splenosit orta ekleyin
    NOT: Bu teknik, tipik olarak, fare dalak başına yaklaşık 3 x 10 7 splenositlerin verir.
  8. 5 dakika boyunca 2 ug / ml anti-CD3e antikoru ile splenositlerin uygun uyarır.
    Not: splenositlerin miktarı gerekli araştırmacı tarafından belirlenen deney koşulları sayısına bağlıdır (adım 6.9 bakınız). Her deneysel örnek için / de 10 6 splenositler gereklidir.
  9. Aktarım 10 6 splenositler (uyarılmış veya uyarılmamış) 1 nihai seyreltme oranında kuyulara 12 oyuklu bir plaka gözlerine olmayan durumunu (kontrol) ekleyin veya MSC-CM: 10-1: 20.
  10. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de 24 saat ve santrifüj sonrasında splenosit CM hasat edilir.
  11. imalatçının talimatlarına uygun olarak, ticari bir ELISA kiti ile interferon gamma (IFN-γ), içeriği için yeni boru ve tahlil süpernatant aktarın.

Sfero-CM Anti-kanser Potansiyeli değerlendirin 7. Prostat Kanseri Testi

  1. RPMI-1640 ortamı, 10 ile takviye edilmiş olan tam RPMI büyüme ortamı hazırlamak% FBS, 1x penisilin-streptomisin.
  2. LNCaP prostat kanseri hücrelerinin bir dondurulmuş şişesinden elde edilir ve 37 ° C su banyosu içinde 2 dakika süreyle flakon inkübe edin.
  3. 30, motorlu bir pipet kullanarak tam RPMI büyüme ortamı ilave edildi ve 5 ml serolojik pipeti içeren bir kültür kabı içine şişenin içeriğini aktarın. çanak orta flakon birkaç kez yıkayın ve inkübatör içine çanak yerleştirin.
  4. Hücreler birleşik duruma ulaştılar hemen önce, oda sıcaklığında PBS ile iki kez kültür yıkama ve önceden ısıtılmış,% 0.25 tripsin / EDTA solüsyonu, 3 ml LNCaP hücreleri ayırmak.
  5. tam RPMI büyüme ortamı ile çanak tripsin nötralize ve 50 ml'lik konik tüp içine yıkar birlikte hücreleri aktarın.
  6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj hücreleri ve süpernatan aspire.
  7. tam RPMI büyüme ortamı küçük bir hacim içine hücrelerin yeniden askıya ve hemasitometre kullanarak kanser hücrelerini saymak.
  8. durumunu olmayan ya da küremsi-CM% 25 içeren tam RPMI büyüme ortamı 120 ul / oyuk 5000 hücrede 96-yuvalı tabak içine LNCaP hücreleri aktarın. 72 saat inkübatörde inkübe edin.
  9. Hücre proliferasyon deneyi kiti kullanılarak hücre büyüme deneyi yapmak için, havuzdan alınan ortam aspire bir dondurucu (-80 ° C), en az 3 saat içinde plaka aktarın.
    1. plaka çözülme ve iyi 180 mM NaCl, 1 mM EDTA ve 0.2 mg / ml RNase A ihtiva eden hücre liziz reaktifi 100 ul ekleyerek her hücreleri lize
    2. Standart bir eğri için, LNCaP hücrelerinin lize bilinen miktarları, yukarıda tarif edildiği gibi.
    3. 1 saat sonra, 1 içeren 1x hücre parçalama tampon 100 ul: Hücre çoğalma tahlili tepkin maddesi 100 seyreltme ve hücre miktarını belirlemek için, her bir gözündeki floresans ölçümü.

Bozulmamış küremsi 8. intraperitoneal teslim

  1. (Protokolü 2) ve tekrar süspansiyon t yukarıda tarif edildiği gibi küremsi MKH'lerin hazırlayınO XF koşulları sağlamak için 0.2-0.5% HSA ile takviye edilmiş steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde küreler. çözeltide HSA enjeksiyon sırasında plastik küre yapışmasını önlemek için yardımcı olur.
  2. 15 ml konik tüpler içine 40-120 parçacıklarının aktarın ve tüpler 6 ml HBSS / HSA ekleyerek hücreleri yıkayın. küreler inmeleri için 3-4 dakika bekleyin. Her bir hayvan için sferoidlerin bağımsız konik tüp hazırlanır. Ayrıca, küremsi tutma (aşağıda 8.18) ve istenirse devri sonrası tedavi faktörlerin üretimini (aşağıda 8.19) belirlemek tahliller için parçacıklarının ilave tüpler hazırlamak.
  3. Süpernatantı aspire 0.2-0.5% HSA ile desteklenmiş steril HBSS 100-200 ul parçacıklarının kaplamak ve buz üzerinde tüpler yerleştirin.
  4. Kısaca indüksiyon odasında yaklaşık 2 dakika süreyle tutam parmak refleksinin kaybolması kadar% 100 oksijen içinde% 2 izofluran ile hayvan uyutmak.
  5. BSL-2 dolap, dorsal Aspe içinde hayvan yerleştirinBir burun konisi yoluyla% 1.5 izofluran / oksijen karışımı sürekli akış ile, (ventral yüzü yukarı bakacak şekilde) aşağı ct.
  6. antiseptik gibi% 70 alkol ile alt fare karın temizleyin.
  7. 20 G intravenöz (iv) kateter kapağını çıkarın ve kateter-stiletto montaj ile intraperitoneal gerçekleştirin. fare cilt tutmak için bir elinizi kullanın ve başka bir enjeksiyon yapmak. Yaklaşık iğne ucu orta hatta doğru bakacak şekilde bir bükülü diz eklemi ve genital bölgeyi bağlayan yapay satırın ortasında enjeksiyon noktasını bulun.
    NOT: kateter-stiletto düzeneği normal iğne daha yüksek bir dirence sahiptir, bu nedenle bakım iç organlara yaralanmaya yol açabilecek karın içine çok derin iğne enjekte etmek için değil alınmalıdır. Cildin Penetrasyon ve sonra kaslar / periton zarı kateter yerleştirilmesi sırasında hissedilebilir.
  8. Yavaşça kateter stiletto montaj metal kama / iğne çıkarılır. checkan, idrar ve dışkı için kama k ve atın. iğne Kan iç organ (lar) ın patlağı gösterir.
  9. sıvı akışını sağlamak için enjeksiyonlar sırasında dik konumda, plastik kateter tutun.
  10. 100-200 ul ucu ile bir pipet kullanılarak kateter ile steril HBSS / HSA yaklaşık 100 ul enjekte edilerek, plastik kateter doğru yerleştirilmesi kontrol edin. sıkı bir mühür oluşturan kateter şırınga adaptörünün içinde pipet ucunu yerleştirin. Yavaş yavaş periton boşluğunun içine sıvı enjekte.
    NOT: Doğru yerleştirilmiş kateter sıvı serbestçe kateterin sadece küçük ayar ile periton boşluğuna içinde akacaktır. kateterin yanlış yerleştirilmesi (deri altı veya intra-intestinal ya da böbrek gibi iğne yaralı periton organların ucu ise) direncini artırmak ve akışını azaltacaktır. Deri altına yerleştirilmesi deri altına açık bir "kabarcık" bir oluşumu ile sonuçlanacaktır.
  11. t toplayınO 200 ul pipet kullanarak, HBSS / HSA (adım 8.3) 100-200 ul hazırlanan sferoidler, MSC ve yukarıda açıklandığı gibi kateter yoluyla periton boşluğuna kürelerin tüm hacmi (40-120 küre) aktarın.
  12. herhangi bir kalıntı parçacıklarının toplanması ve periton boşluğu içine enjekte etmek için, yukarıdaki ile aynı ucunu kullanarak HBSS / HSA 100 ul küreleri içeren tüp yıkayın.
  13. (İsteğe bağlı) kateteri yıkamak için periton boşluğuna HBSS / HSA ilave 100 ul enjekte edilir.
  14. kateter üzerinde antiseptik batırılmış gazlı bez yerleştirin ve yavaş yavaş periton boşluğuna kateter kaldırmak ve atın.
  15. Yavaşça küremsi eşit dağılımını sağlamak için parmakları ile periton boşluğuna masaj yapın.
  16. Hayvan yakın gözetim altında kurtarmak ve enjeksiyon yerinde kanama izleyelim.
  17. Kalan sferoidler için kateter ve 15 ml tüp kontrol edin. Birkaç küreler gözlemlemek normaldirKateter / tüp.
    Not: MSC sfero teslimat için tarif edilen teknik, normal hayvanlarda ya da yaralanma modellerinin çeşitli kullanım için kabul edilebilir. Bu teknik, başarılı bir şekilde fare korneal hasarı ve endotoksemi modellerinde parçacıklarının enjekte yanı sıra zimosan ile indüklenen peritonit modelinde 8'de kullanılmıştır.
  18. (Isteğe bağlı) tutulan sferoidler sayısını ölçmek için, bir DNA tabanlı hücre sayısı ölçümü kiti / reaktifi kullanın. 15 ml tüp üzerinde kullanılan kateter tutun ve şiddetle geri 15 ml tüp içine kalan küreler zorlamak için kateter yoluyla HBSS / HSA dağıtmak.
    1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 xg'de 15 ml tüp santrifüj ve süpernatan aspire. bir dondurucu (-80 ° C) en az 3 saat içine sfero pelet içeren tüp aktarın.
    2. tüp çözülme ve 180 mM NaCI, 1 mM EDTA ve 0.2 mg / ml RNase A ihtiva eden hücre liziz reaktifi 500 ul ekleyerek küreler lize
    3. Bir kontrol, freeze ve lize yukarıda tarif edildiği gibi (tek bir enjeksiyon için hazırlanan parçacıklarının sayısı tercihen eşdeğeri) parçacıklarının bilinen bir miktarı.
    4. kit hücre proliferasyon deneyi reaktif 1:50 seyreltme ihtiva 1x hücre parçalama tampon 100 ul 1 saat sonra, 96-çukurlu, iki kopya halinde, hücre lizatı, 100 ul transfer ve her oyuğuna ilave edin. 10 dakika sonra, kontrol numunesi ile deney örnek (ler) karşılaştırılması ile enjekte değil küre sayısını belirlemek için, her bir gözündeki floresans ölçümü.
  19. transfer küreler tarafından üretilen PGE2 konsantrasyonu ve TSG6 ölçerek (isteğe bağlı) enjeksiyon için hazırlanan sferoidler aktivasyon düzeyini değerlendirir. Aktarım% 2 FBS ve 1 x penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş 1 ya da 2 ml αMEM ihtiva eden bir 12-gözlü ya da 6-çukurlu plaka, yukarıda tarif edildiği gibi kateter yoluyla 40-120 küreler. 6 saat süreyle inkübatör tabak yerleştirin.
    1. dan orta aktarınKuyular 1.5 ya da 15 ml tüpler içinde 6 saat sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj tüpleri.
    2. Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca 10,000 x g'de bir pipet ve santrifüj kullanılarak yeni bir 1.5 ml tüpler içinde hücresiz süpernatant aktarın.
    3. üreticinin talimatlarına göre bir ticari ELISA kiti kullanılarak PGE2 konsantrasyonu (CM anti-inflamatuar potansiyelinin iyi bir göstergesi) için yeni 1.5 ml tüpler ve tahlil açıklık CM (süpernatant) aktarın. TSG6 konsantrasyonu yayınlanmış bir protokol 14 kullanılarak belirlenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Geçerli çalışmada, asılı damla kültürleri kompakt küresel mikro-doku veya XF koşullarında aktive MKH 'sferoidler' üretmek için kullanılmıştır. Şekil 1'de araştırma yol haritası MKH kendini monte etmek için teşvik edilir sferoidler veya CM küre kaynaklı tedavi edici faktörler ile yüklenen sonra 72 saat için damla asılı asılı zaman sferoidlerde içine alınabilir ve potansiyel hem de kullanılan bu tasvir araştırma ve klinik uygulamaları. Küre üretim için gerekli ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bazı araştırmalar ve klinik uygulamalarda kullanım için uygun MSC çok onların yarar en üst düzeye çıkarmak için aktif, ve tercihen FBS olarak ksenogeneik ortam bileşenlerinden potansiyel antigenlerin gönderimini en aza indirmek için, kimyasal olarak tanımlanmış XF koşullar altında hazırlanmalıdır. Burada anlatılan protokollerin olarak,: 1) için yöntemler göstermiştir parçacıklarının oluşumuyla 3D kültür MKH'lerin aktive 2) XF koşullar altında MSC 3D aktivasyonuna ulaşırlar, 3) anti- açısından küremsi MSC aktivasyon ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden P40RR17447 hibe ve Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü'nden ödül RP150637 ile finanse edilmiştir. Projeye verdiği destek için Dr. Darwin J. Prockop'a teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MEM-&alfa; (minimal esansiyel orta alfa)ThermoFisher/Gibco12561049; 12561056; MSChazırlanması için minimal 12561072 esansiyel besiyeri
, premium selectAtlanta BiologicalsS11595; S11510; S11550; S11595-24her tür hücre için tam kültür ortamının bileşeni
L-glutaminThermoFisher/Gibco25030081; 25030149;25030164 tür hücre için tam kültür ortamının bileşeni
Penisilin / StreptomisinThermoFisher / Gibco15070063tüm hücre türleri için tam kültür ortamının bileşeni
Sterilizasyon Filtre Üniteleri, 0.22 ve mikro; m PES membranıMilliporeSigma SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11REortamı sterilizasyonu
150 mm hücre kültürü kabıNuncD8554  SIGMAhücre kültürü
Thermo Forma su ceketli CO2 nemlendirilmiş inkübatörThermo FisherModel 3110kültürlenmiş hücrelerin inkübasyonu
Erken geçiş MCS'leriThe Texas A&'da Yetişkin Kök Hücrelerin Hazırlanması ve Dağıtımı Merkezi M Sağlık Bilimleri Merkezi Tıp Fakültesi Rejeneratif Tıp Enstitüsü Scott & MSC'lerin su banyosunun 2D ve 3D kültürlerininNA
VWR89501-46837 &°C'ye kadar ısıtma ortamı; C
PipetlerEppendorf492000904manuel sıvı işleme
Pipet YardımıDrummond Scientific Company4-000-300sereolojik pipetlerin kullanımı
Costar steril serolojik pipet (5, 10, 25 ve 50 ml)Corning4487; 4101; 4251; 4490sıvı işleme
PBS (fosfat tamponlu tuzlu su), pH 7.4ThermoFisher/Gibco10010023; 10010072; 10010031; 10010049hücre kültürü işleme
%0.25 tripsin/EDTA çözeltisiThermoFisher/Gibco25200056; 25200072; 25200114Yapışma hücrelerinin kaldırılması ve hücre agregatlarının dağıtılması
15 ml konik tüpCorning/BD Falcon352097hücre santrifüjü
50 ml konik tüpCorning/BD Falcon352098hücre santrifüjü
Eppendor soğutmalı santrifüjEppendorf/Fisher ScientificModel 5810Rhücre santrifüjleme
hemositometresiFisher Scientific26716hücre sayımı
tripan mavisiSigma-AldrichT8154Hematitometrede hücre sayımı sırasında SIGMA ölü hücre dışlaması
Tanımlanmış ksenofree MSC orta-1 (XFM-1)ThermoFisher/GibcoA1067501İnsan mezenkimal kök hücrelerinin büyümesi ve genişlemesi için özel olarak formüle edilmiş kseno-içermeyen ortam
Tanımlanmış ksenofree MSC ortam-2 (XFM-2)Kök Hücre Teknolojileri5420İnsan mezenkimal kök hücreleri için tanımlanmış, kseno içermeyen ortam
HSA (İnsan serum albümini)İkizler800-120Kseno-içermeyen MSC ortamının
bileşeni rHSA (rekombinant İnsan serum albümini)Sigma-AldrichA9731  Ksenoiçermeyen MSC ortamının
Toplam RNA izolasyonu Mini KitQiagen74104Toplam RNA ekstraksiyonu
QiashredderQiagen79654Toplam RNA ekstraksiyonu öncesi numune homojenizasyonu
RNAse-free DNase Set Qiagen79254Toplam RNA ekstraksiyonu sırasında sütun üzerinde DNA eliminasyonu
β-merkaptoetanol Sigma-AldrichM6250  RLT tamponunda RNA'ların ALDRICH inhibisyonu
VorteksVWR97043-562karıştırma örneği
SpektrofotometreBioradNARNA konsantrasyonu ve kalitesi
Yüksek kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiThermoFisher/Uygulamalı Biyosistemler4368814toplam RNA'nın cDNA'ya transkripsiyonu
Gen Ekspresyon TestleriThermoFisher/Uygulamalı Biyosistemlergerçek zamanlı PCR için primer/prob kombinasyonunudeğiştirir
Hızlı Evrensel PCR Master MixThermoFisher/Applied Biosystems4352042; 4364103; 4366073; Gerçekzamanlı PCR reaksiyonu için 4367846 ana karışımı
Gerçek zamanlı PCR sistemi (ABI Prism 7900 HT Dizi Tespit Sistemi)ABI PrizmNAgerçek zamanlı PCR
1.5 ml santrifüj tüpüEppendorf22364111Hücre santrifüjleme, numune toplama ve saklama
(-80 &°C; C) dondurucuThermo FisherModel Thermo Forma 8695numune saklama
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA KitiR& D Systems,numune DMEM'deki sitokin konsantrasyonunun tahminini
KGE004B (Dulbecco' s modifiye edilmiş Eagle medium)ThermoFisher/Gibco10566-016; 10566-024; 10566-032makrofaj kültür ortamı
J774 fare makrofajlarıATCCTIB-67fare makrofaj hücre hattı
12 kuyulu plakaCorning3513 in vitro< / em> makrofaj stimülasyonu
LPS (lipopolisakkarit)Sigma-aldrichL4130 in vitro< / em> makrofaj stimülasyonu
Fare TNF-a ELISA kitiR& D SistemleriMTA00Bnumunedeki sitokin konsantrasyonunun tahmini
Fare IL-10 (interlökin 10) ELISA kitiR& D SystemsM1000Bnumunedeki sitokin konsantrasyonunun tahmini
RPMI-1640 ortamıThermoFisher/Gibco11875-085splenosit kültür ortamı
BALB/c fareleriJackson Laboratuvarı651in vivo sferoid iletimi; Splenosit Hazırlama
Anti-Fare CD3e Fonksiyonel Sınıf SaflaştırılmışeBioscience145-2C11 in vitro< / em> splenosit stimülasyonu
70 & mu; m süzgeç Corning352350Splenosit hazırlığı
Kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi (1x)Affymetrix eBioscience00-4333splenosit izolasyonu sırasında kırmızı kan hücrelerinin çıkarılması
Fare IFN-γ (interferon gama) ELISA kitiAr-Ge D SystemsMIF 00hücrelerinde sitokin konsantrasyonunun tahmini
 ATCCCRL-17403D MSC'lerin kanser hücre hatları üzerindeki etkisini inceler in vitro
DNA tabanlı hücre proliferasyon test kitiThermoFisherC7026hücre sayısı ölçümü
NaClSigma-AldrichS5150lizis reaktifinin bileşeni
EDTA (etilendiamintetraasetik asit)ThermoFisherFERR1021kalsiyum şelatörü, lizis reaktifinin bileşeni
Rnase AQiagen19101RNA bozunması
Filtre tabanlı çok modlu mikroplaka okuyucuBMG TeknolojisiNAMikroplaka tahlilleri (ELISA, hücre miktar tayini, etc.)
HBSS (Hanks dengeli tuz çözeltisi), kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısıyok ThermoFisher/Gibco14175079in vivo enjeksiyonlarından önce MSC sferoidlerinin yeniden üretilmesi
İzofluranMWI Veteriner Tedavisiin vivo enjeksiyonları için anestezi 502017 Tedarik
Oksijen, sıkıştırılmış gazPraxairNAİzofluran ile kullanım için
Thermo Forma BSL-2 kabiniThermo FisherModel 1385Steril hücre kültürü
Güvenlik I.V. kateter/iğne stiletto, 20 G, 1 inçTerumoSR*FNP2025Shperoidlerin periton boşluğuna verilmesi
Steril mikropipet uçlarıEppendorfsıvı/hücre kullanımınıdeğiştirir
büyüme ortamı (CCM) FBS'nin (fetal sığır serumu) beyaz hazırlanmasıSIGMA Bileşeni, , , örnek LNCaP prostat kanseri , DNA içeriğine dayalı DNA ölçümü için

Kaynaklar

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357(2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html (2016).
  16. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  17. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  18. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  19. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  20. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  21. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  22. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  23. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution? Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  24. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  25. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  26. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mezenkimal K k H crelerAs l Damla Tekni iKondisyonlu Medyum Toplamantraperitoneal EnjeksiyonGen Ekspresyon TaramasAnti inflamatuar Fakt rlerPGE2 AnaliziTSG6 Ekspresyonu

İlgili makaleler