Method Article

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

DOI:

10.3791/55148

⸱

March 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monotopik proteinler, bir zar yüzeyine bağlandıklarında işlevlerini yerine getirirler ve bu tür etkileşimler, spesifik lipid bileşimine ve işlevi yerine getirmek için yeterli alanın mevcudiyetine bağlıdır. Nanodiskler, kontrollü boyut ve lipit içeriğine sahip bir zar yüzeyi sağlamak için kullanılır. Bağlı ekstrinsik proteinlerin yokluğunda, sodyum fosfotungstat lekeli nanodiskler, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile yandan bakıldığında madeni para yığınları olarak görünür. Bu nedenle bu protokol, istiflemeyi kasıtlı olarak teşvik etmek için tasarlanmıştır; Sonuç olarak, istiflemenin önlenmesi, zar bağlayıcı proteinin nanodiske bağlanması olarak yorumlanabilir. Bir sonraki adımda, protein-nanodisk komplekslerinin TEM görüntüleri, daha yüksek çözünürlüklü kriyoEM çalışması için bir temel olarak düşük çözünürlüklü yapılar elde etmek için standart tek parçacıklı yöntemlerle işlenebilir. Ayrıca, nanodiskler TEM veya denatüre olmayan jel elektroforezi için uygun numuneler sağlar. Yöntemi göstermek için, nanodiskler üzerinde 5-lipoksijenazın Ca2 + ile indüklenen bağlanması sunulmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

araştırmalarda, çok dikkat lipit etkileşimi, çeşitli yer içsel veya dışsal da zar proteinleri, odaklanmıştır. Lipid etkileşen proteinleri ile çalışma ya deterjanlar gibi lipidler, bir yerine seçilmesi 1 amphipols veya küçük proteinler 2, ya da çözünür ve aktif proteini tutan bir membran yerine bulmak içerir. Lipoik membran yerine lipozomlar ve nanodiscs (ND) 3, 4 içerir.

Nanodiscs doğal kanda meydana gelen, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), proteinin bir parçası, Apo-1 mühendisliği tarafından geliştirilen yakın yerli membran platformudur. Apo A-1 kısa amfipatik α-helikslerin 243 kalıntı uzun zincirli ve bir lipit içermeyen çözünebilir bir biçime sahiptir. İn vitro lipid varlığında, protein Apo-1 iki kopya kendiliğinden hydr çevrelemek için yeniden zamanbir lipid iki katmanlı yamanın 5 ophobic asil zincir bölümü. ApoA-1 Engineered Bunlar genellikle membran iskele proteinleri (MSP) olarak adlandırılır ve artan sayıda plazmid ya da arıtılmış, proteinler gibi ticari olarak temin edilebilir. 6 uzun veya daha kısa 7 membran iskele proteinler Apo AI 1 sonuç tekrarlar veya α-sarmal silmeler. Bu da bu mümkün 7 8 mil 17 çapı 6 nm civarında diskleri izin vermektedir. Nanodiscs 3, 9 başvurularının farklı türleri vardır. En yaygın olarak kullanılan uygulama, daha önce 3, 9 yorumlanan bütünsel zar proteini 8 stabilizasyonu için bir yakın yerel membran ortamı sağlamaktır. Daha az keşfedilen kullanımı çalışma için nano ölçekli zar yüzeyi temin etmektirperiferal membran proteinleri 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Protokolün Bölüm 1 Aşağıdaki fosfolipidler ve membran iskele protein oluşan nanodiscs yapmak için prosedürü görüntüler.

Numune hazırlama çoğu yöntemleri bir darboğaz olduğunu. Yöntem özgü örnekleri belirli bilgileri eklemek olabilir, ama aynı zamanda sonuçların karşılaştırılması zorlaştırmaktadır. örnekler modelli ve çok sayıda farklı yöntem doğrudan kullanılabilir, bu nedenle, daha basit bir. Nanodiscs kullanımı ile bir avantajı, lipozomlar (örneğin, numuneler, doğrudan bu protokolde olduğu gibi, TEM ve denatüre edici olmayan jel elektroforezi her ikisi için de kullanılabilir) ile karşılaştırıldığında nanodisc küçük boyutudur.

veziküller ve lipozomlar, uzun zar etkileşen proteinlerin fonksiyonunun anlaşılması için kullanılmıştır. Yapısal çalışmalar ve görselleştirme için lipozomlar içinde bir transmembran proteini yapısal kararlılığının bir örnek kullanılabilir 18'dir. Ancak, bir lipozom membranı üzerinde yerleştirilmiş monotopic membran proteini herhangi bir yüksek çözünürlüklü 3D yapı bildiğimiz kadarıyla, henüz yayınlanmıştır. Altın nano parçacıklar veya antikorlar TEM 19 kullanılarak lipozomlar veya veziküller bağlayıcı proteinleri görselleştirmek için kullanılabilmektedir. bu problar çok özel olsa da, bunlar membran bağlanma bölgeleri örterek ya da esnek parçalar ile ilgi alanları maskeleyerek-membran birleştirme proteinleri engelleyebilir. Altın etiketli veya antikor-kompleks proteinler muhtemelen jel üzerinde analiz edilebilir, ancak bu deneyde maliyetini arttıracaktır.

lipozomlar mükemmel bir platform olmasına rağmen, bir pop emin olamazulation lipozom başına protein belirli bir oranı, nanodiscs 20 kullanımı ile keşfedilebilir bir özelliği vardır. bir lipozom içinde, kofaktör ve alt tabakalar çözünür iç sıkışıp edilebilir. zar-çözünen maddeler membran taklitlerinin her iki tür için aynı kaderi paylaşacak. iki tabakalı alanı nanodiscs daha küçük olduğu Bununla birlikte, maddenin daha az miktarda nanodisc membranlar doyurulması için gereklidir.

atom yapısı belirlenmesi yoluyla anlama protein işlev araştırmanın pek çok alanında için gerekli olmuştur. Protein yapı tayini için yöntemler röntgen 21 arasında; nükleer manyetik rezonans (NMR) 22, 23; ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) sirojenik sıcaklıkta 24 cryoEM. cryoEM tarafından çözünürlüğü son zamanlarda büyük ölçüde kaynaklanmaktadır doğrudan elektron de kullanımına, geliştirilmiş26, 25 dedektörler. Makromoleküller yakın bir yerli devlet ince, vitreus buz 27 görüntülenmiş. 200 kDa - Bununla birlikte, biyolojik moleküllerin düşük kontrast nedeniyle, bunlar 100 boyut aralığında tespit etmek zor olur. Uygun büyüklükte numuneler için, veri toplama yapılan ve tek parçacık yeniden yöntemi, bir yapı 28 elde etmek üzere uygulanabilir.

Ancak, TEM ile protein yapısının belirlenmesi çok aşamalı bir süreçtir. Genellikle negatif leke TEM 29 phosphotungsten (PT) 30 veya uranyum 31 gibi ağır metallerin tuzları kullanarak örnek monodispersiteye değerlendirilmesi ile başlar. Olumsuz lekeli makromolekülün düşük çözünürlüklü bir modeli İmar genellikle yapılır ve moleküler yapı 29 hakkında önemli bilgiler verebilir. Paralel,cryoEM başlayabilir kullanarak veri toplama. eser oluşum yanlış yorumlanmasından kaçınmak için negatif leke TEM verilerini değerlendirirken dikkatli olunmalıdır. Belirli bir artefakt fosfolipidler PT leke etkisi ve yan 33 bakıldığında jeton yığınları benzeyen, uzun çubukların oluşumu ile sonuçlanan, 32 lipozomlar. Bu tür "rouleau" veya "yığınları" (bundan sonra "yığınları" olarak belirtilir) nanodiscs 35 daha sonra da HDL 34 için erken gözlenen ve bulundu.

membranların istif ve yeniden şekillendirme çeşitli nedenlerle oluşabilir. Örneğin, bir amonyum molibdat leke 36 TEM görüntülemede bakır gibi ko-faktörler tarafından indüklenebilir. lipozomlar membran lipitlerinin bir kısmı böylece bakır iyonlarının eklenmesinden sonra lipozomlar istifleme, EDTA metal kompleks oluşturmayı taklit bir iminodiacetic asit kafa grubu içerdiği 36 kadar. İstifleme da bağlı olarak ya da lipid çift tabakaları bir protein ile, protein-protein etkileşimi olabilir 37 (kullanılmış leke söz konusu değildir). PT tarafından fosfolipidlerin yığın oluşumu erken gözlendi; Ancak, daha sonra çalışma kaldırma veya bu eser oluşumu 38 kaldırılmasına odaklanmıştır.

Burada, TEM ile membrana bağlanma proteinlerinin çalışma için istifleme NAPT'yi kaynaklı nanodisc yararlanmak için bir yöntem önerilmektedir. Kısacası, nanodiscs üzerinde bağlayıcı protein istifleme gelen nanodiscs önleyecektir. Istifleme nedenleri açık değildir rağmen, birbirlerine (Şekil 1A) sopa diskleri neden fosfolipid ve PT fosforil grubu arasında bir elektrostatik etkileşim olduğunu 39 önerilmiştir. Protokolde arkasındaki hipotezi, bir protein, bir nanodisc bağlandığında, fosfolipid yüzeyinde en availa olmadığıdır bağlı proteini ile sterik engelleme, PT ile etkileşim için ble. Bu yığın oluşumunu (Şekil 1B) önleyecektir. İki sonuçlar çıkarılabilir. İlk olarak, istifleme önlenmesi ilgili protein ile membrana bağlı olduğu anlamına gelir. İkinci olarak, protein ND kompleksi kompleks kaba morfoloji elde etmek için standart tek parçacık işleme yöntemleri 24, 40 ile muamele edilebilir. Ayrıca, sigara denaturasyon jel elektroforezi ya da dinamik ışık saçılımı gibi yöntemlerle analiz gerçekleştirilebilir.

Bu hipotezi göstermek için, bir çok iltihaplı hastalık 41, 42 yer almaktadır membran bağlayıcı protein 5-lipoksigenaz (5LO) kullanılmıştır. Bu 78-kDa 'lık proteinin zar 43 bağlamak için kalsiyum iyonu gerektirir. Bu zar dernek çalışılmış olmasına rağmen yoğun lipozomlar kullanılaraks = "xref"> 44, 45, 46 ve membran fraksiyonları 47, bu TEM analizi ve yapı belirlenmesi için kullanılamaz.

nanodiscs hazırlanması deterjan ise sodyum kolat içinde yeniden süspansiyon haline lipid ile MSP karıştırılmasıyla başlar. 1 saat boyunca buz üzerinde kuluçkalamadan sonra, deterjan yavaş bir adsorban reçinesi kullanan bir çözme karışımından çıkarılır. Bu tür malzemenin genellikle küçük boncuk halinde şekillendirilir polistiren yapılır. Bunlar nispeten hidrofobik ve lipidler 48 oranla deterjan bağlanması için güçlü bir tercih var. hidrofobik tanelerden ayrılması ve santrifüj kullanılarak açıklık yaptıktan sonra, nanodiscs boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırılır. Saflaştırılmış nanodiscs (a titrasyonu için ya da daha fazla oranlarda) eşit molar orandaki bir monotopic membran proteini (ve olası yardımcı faktörler) ile karıştırılır ve r bırakılıreact (15 dakika). TEM ile analiz parlayan taburcu karbon kaplı ızgaralar üzerine numune ul-miktarlarda uygulayarak ve daha sonra NAPT ile negatif boyama yaparak gerçekleştirilir. alikotları TEM ızgaraların uygulandığı zaman, aynı örnek büyük bir değişiklik, denatüre edici olmayan ya da SDS-PAGE jel elektroforezi gibi göre aktivite ölçümleri çeşitli ile analiz için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanodiscs hazırlanması 1.

  1. Ekspresyon ve membran iskele protein 8 saflaştırılması, 35
    1. E. coli BL21 içinde His-etiketli MSP1E3D1 (DE3) şişelerde T1R pRARE2 gerginlik ifade eder. 37 ° C'de 50 ug / ml kanamisin ile desteklenmiş LB ortam maddesi ile 50 mL'lik bir gece boyunca başlatıcı kültür hazırlayın. 50 ug / ml kanamisin ile takviye edilmiş müthiş bir broth ortamına 2 L gece boyunca başlatıcı kültür ile seyreltilir.
    2. Yaklaşık 3 18 ° C 'de 3 saat boyunca, 0.5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile, protein ifadesini uyarmak ulaştığında 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk kadar 37 ° C' de hücreler büyütün.
    3. liziz tamponu (100 mM NaCI,% 10 gliserol, 100 mM Tris-HCI, pH 8.0) içinde hazırlayın. Kullanmadan önce hemen 1 mM TCEP ekleyin.
    4. 18 ° C 'de indüksiyon 3 saat sonra, 4500 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj ile hücreler hasatve 4 ° C'de. Süpernatantı atın hasat hücreleri tartmak ve hücrelerin gramı başına 2 ml lizis tampon oranında lizis tamponu onları yeniden askıya.
    5. Lyse darbeli sonikasyon (tekrarlama oranı: 4 s AÇIK, 4 s KAPALI) tarafından hücreler% 80 genlik 3 dakika boyunca.
    6. 49.000 x g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca lizatları santrifüjleyin. Bu santrifujlemeden elde pelet atılır.
    7. Tercihen 4 ° C'de muhafaza otomatik bir sıvı kromatografi sistemine bağlı bir 5 ml Ni içine süpernatant + kenetleme sütun enjekte edilir.
    8. His-etiketli MSP dışındaki tüm proteinleri kaldırmak için aşağıdaki 3 - elüsyon adım (adım 1.1.9) önce, tamponlar 1 ile sütun yıkayın. arıtma süreci takip etmek 280 nm'de protein içeriği izlemek; 280 nm'de UV kayıt her yıkamadan sonra geri başlangıca gitmeli.
      1. 40 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 10 mM imidazol,% 1 Triton pH 8.0: yıkama tamponu 1 ile yıkayınız.
      2. 40 mM Tris-HCI, 300 mM: yıkama tamponu 2 ile yıkayınNaCl, 20 mM imidazol, ve 50 mM sodyum kolat, pH 8.0.
      3. 40 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 50 mM imidazol, pH 8.0: yıkama tamponu 3 ile yıkayınız.
    9. 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0 ile MSP yıkayın.
    10. Jel filtrasyonu 8, 35, standart tampon (0.5 mM EDTA, 100 mM NaCI, 20 mM Tris-HCI, pH 7.5) MSP tampon değiştirme; parti başına verim yaklaşık 7 mg L-olmalıdır -1.
  2. Fosfolipid stok çözeltisi hazırlanması
    1. Bir cam behere 25 mg / mL'lik bir konsantrasyonda kloroform içinde çözülmüş 1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfokolin (POPC) 305 ul ekleyin ve hafif bir nitrojen akımı ile tasfiye ederek kloroform buharlaşması . bir vakum kurutucu içinde yağ gece boyunca kurutun. Not: Bu adım cam kabın altındaki lipid ince bir film bırakır lipid, çözücünün kaldırmak için yapılır.
    2. çözüm şeffaf hale gelinceye kadar tüp vorteks 100 mM sodyum kolat içeren MSP standart tampon 200 uL lipid pasta yeniden süspanse; Bu 50 mM POPC konsantrasyonuna sahip bir çözüm sağlayacaktır.
      Not 2 (lipit: deterjan) 8 Genel olarak, bu noktada, deterjan lipidin mol oranı 1 olmalıdır. Bu lipid, deterjan karışımı yaklaşık 2 ay için -80 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  3. Deterjan çıkarılması için hidrofobik tanelerin hazırlanması
    1. 50 mL'lik bir tüp içinde tanelerin 5 g (kuru ağırlık) yerleştirin.
    2. ultra saf su 40 mL, sonra% 100, 30 mL metanol ile boncuk yıkayın.
    3. 10 ml MSP standart tampon maddesi ile boncuk yıkayın. Son olarak, 4 ° C 'de MSP standart tampon maddesi 15 mL boncuk saklayın.
  4. Nanodisc sulandırma
    1. Bir mikrofüj tüpüne MSP1E3D1 (0.124 mM) 190 ul dağıtmak ve fosfolipid stok çözeltisi (50 mM P 61.5 mcLAynı tüp OPC). 1 saat boyunca ıslak buz üzerinde sulandırma karışımı inkübe edin. Not: 130 (MSP1E3D1: POPC) 1 bir mol oranına eşittir.
    2. Otomatik birleştirme işlemi başlatmak için yeniden oluşturma karışımının mL'si başına boncuk 0.5 g bir konsantrasyonda hidrofobik boncuk ekleyin. 4 ° C sıcaklıkta 16 saat için bir döner bir inkübatörde inkübe edin.
    3. İnkübasyondan sonra, 13.000 x g'de 10 dakika 4 ° C'de santrifüj çökeltilerini ve agrega kaldırma. pelet atın ve süpernatant kaydedin.
    4. 280 nm'de absorbans stabil hale gelene kadar MSP standart tampon maddesi ile (otomatik bir sıvı kromatografi sistemine monte) boyut çıkarım kromatografi kolonuna dengelenmesi. sütuna süpernatan enjekte edilir ve zirve fraksiyonları toplayın.
    5. 280 nm 'de pik fraksiyonlarda nanodiscs konsantrasyonlarını ölçmek. Nanodisc konsantrasyonunun hesaplanması için MSP1E3D1 (ε = 29.910 cm-1 M-1) molar sönüm katsayısı kullanarak. NOT:nanodisc için lipid sayısı radyo-etiketli lipitlerin ve fosfat analizi 4 bir kombinasyonu ile ya da tek başına fosfat analizi ile ölçülebilir.

Monotopic Proteininin 2. 5-lipoksijenaz 35

  1. bir gecede starter kültür hazırlayın. 100 ug / ml ampisilin ile LB ortamında 50 mL Supplement. 5-lipoksijenaz geni (ALOX5) plasmid içeren E. coli BL21 (DE3) 'e sahip ortamı aşılamakta. 42 mM Na-2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, 9 mM NaCI, 19 mM NH4CI, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM CaCl2,% 0.2, D-glikoz, 0.1 ihtiva eden sentezleme ortamı içinde bir gece boyunca starter kültür seyreltilir % 5 uM FeSO 4 ve 100 ug / ml ampisilin. 600 OD ~ 0.5 25 ° C kadar hücreleri büyür. 20 ° C'de 35 16 saat 0.2 mM IPTG ile protein sentezlenmesinin neden.
  2. 7.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika süre ile santrifüjleme ile hasat ve supernatant atın. proteaz inhibitörü ve 0.5 ihtiva eden (ve 1 mM TCEP, 100 mM NaCI,% 10 gliserol, 100 mM Tris-HCI, pH 8.0) içinde liziz tamponu içinde hasat hücreleri ve tekrar süspansiyon hasat hücreleri içeren tüpün alt kısmında bulunan pelet tartılır mg / ml hücre gramı başına liziz tamponunda 2 mL bir oranda 35 lizozim.
  3. % 80 genlik, 5 x 15 sn boyunca sonikasyon ile Hücreleri,. 7.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile hücre debrisini uzaklaştırmak. Çözelti 35 proteinleri çökeltmek için% 60 doygunluk - 30 amonyum sülfat çökeltme gerçekleştirin. 16.000 x g'de 15 dakika 4 ° C'de santrifüj. Not: 5LO pelet hızla dondurulmuş ve 6 ay boyunca -80 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  4. 40.000 x g'de 15 dakika 4 ° C'de lisis tamponu ve santrifüj 20 mL pelletini.
  5. üzerinde supernatant inkübe 30 dakika süre ile 4 ° C'de bir ATP agaroz sütunu. 0.5 M NaCl ihtiva eden liziz tampon maddenin bir sütun hacim ile bir kez kolon yıkayın. 10 uM FeSO 4 ve 20 ug / ml katalaz ihtiva eden liziz tamponu içinde 20 mM ATP ile 5LO yıkayın. ATP 35 kaldırmak için jel filtrasyon kromatografisi gerçekleştirin.
    NOT: 5LO kararsız ve ürün arıtıldıktan hemen sonra kullanılmalıdır. Aksi takdirde, amonyum sülfat çökeltmesi aşama (aşama 2.1.3 sonra nota bakınız) durmasına önerilir.

Nanodisc-protein kompleksinin 3. hazırlanması

  1. kompleks, 100 uL toplam hacim hazırlayın. MSP, standart tampon maddesi içinde 1 mM Ca2 + mevcut 0.8 uM, ikinci ve 0.8 uM 5LO karıştırın (20 mM Tris-HCI, pH 7.5; 100 mM NaCI, 0.5 mM EDTA, 1.5 mM CaCl2) ve 10 dakika boyunca inkübe buzda. NOT: Numune bir aya kadar C 35 ° 4 de saklanabilir.
Numune ove_title "> 4. Analiz

  1. Jel elektroforezi
    1. Denatüre edici olmayan elektroforez
      1. 5 yükleme tamponu uL (50 mM BisTris, 6 N HCI, 50 mM NaCI,% 10 (ağırlık / hacim) gliserol ve% 0.001 Ponceau S, pH 7.2) 49 ile numune 15 uL karıştırın ve 4 üzerinde yük -% 16 Bis-Tris jel elektroforezi gerçekleştirmek için.
      2. Işık katod tamponu ile katot tankı doldurun (50 mM Trişin, pH 6.8; 50 mM Bis Tris ve% 0.002 Coomassie G-250) ve tampon (50 mM Bis Tris, 50 mM Trişin, pH 6.8) ile çalışan anot tankı. 150 V sabit bir gerilim kullanılarak ayrımı başlayın
      3. Coomassie ön jel sonuna ulaştığında elektroforetik ayrımı durdurun.
      4. Standart bir Coomassie mavi protokolü ile jel Leke.
    2. denatüre elektroforez
      1. ((SDS içeren yükleme tamponu 10 uL,% 0.05, numunenin 40 uL karışımı / V) bromfenol mavisi a; 0.2 M Tris-HCI,pH 6.8; % 20 (h / h) gliserol; % 10 (ağırlık / hacim) SDS; elektroforez gerçekleştirmek için% 20 Tris glisin jeli - 10 mM 2-merkaptoetanol) ve 4 üzerine yerleştirin.
      2. Çalışan tampon katot ve anot tankları doldurmak (25 mM Tris-HCI, pH 6.8; 200 mM glisin ve% 0.1 (w / v) SDS). 150 V sabit bir gerilim kullanılarak ayrımı başlayın
      3. Yükleme boya ön jel sonuna ulaştığında elektroforetik ayrımı durdurun.
      4. Standart bir Coomassie mavi protokolü ile jel Leke.
  2. NAPT çözeltisinin hazırlanması
    1. (Ağırlık / hacim) asidik çözelti, bir% 2 vermek üzere, oda sıcaklığında çalkalama ile 50 mL su içinde fosfotungstad sodyum tuzu, 1 g çözündürülür.
    2. 1 M NaOH ile 7.4'e pH ayarlayın. 0.22 mikron şırınga filtresi kullanılarak partiküllerini. Oda sıcaklığında ya da 4 ° C'da, çözelti saklayın.
  3. TEM analizi için numune hazırlanması
    1. Glow-deşarj karbon kaplı bakır ızgaralar (430 mA, 20 s için 00 göz) numunenin yüze çekilmesinden önce hidrofilik ızgaraları işlemek için. ızgara örnek (nanodiscs göre 0.8 uM) 3.5 uL yerleştirin ve 30 s için inkübe edilir. Not: uygulanan hacimli bir numunesi konsantrasyonuna bağlı olarak, 2,5 ila 5 uL değişebilir. 1 uM - nanodiscs için uygun konsantrasyon aralığı 0.5 olduğunu.
    2. Filtre kağıdı kullanarak fazla solüsyonu kapalı kurulayın.
    3. Hemen 30 sn için% 2 NAPT bir damla ızgara leke. Fazla solüsyonun kapalı kurulayın ve kuru hava ızgara bırakın.
    4. TEM ile ızgaraları değerlendirin. 120-200 keV gerilimi hızlanan bir mikroskop istifleme boyutlarını tahmin etmeye yeterlidir. NOT: Bu protokolü için, kalibre edilmiş bir transmisyon elektron mikroskobu kullanılmıştır 200 keV alan emisyon tabanca ile donatılmıştır.
    5. TEM görüntüleri kaydetmek. Uzun yığınları gösteren görüntüler için daha fazla işlem yoktur; Fotoğraflar bir kaç içerebilir dışsal proteinle nanodiscs kompleksi göstermektedirkısa yığınlar, ancak çoğu parçacıkların kompleksi bulunmaktadır. Tutanak birkaç görüntü ve süreç sınıf ortalamaları ve düşük çözünürlük, kompleksin 3 boyutlu model elde etmek için standart yöntemlere göre bu.
      NOT: negatif leke verilerinin toplanması için, ızgaralar, en az üç farklı günde yapılmıştır. Negatif boyama işleminden önce her gün için, taze örnek inkübasyonlar (adım 3.1 gibi) yapılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

önerdiğimiz metot olup, bağlama monotopic membran proteini için membran yüzey sağlamak için nanodiscs hazırlanması bağlıdır. Nanodisc çift katlı lipid içine gömülü herhangi bir transmembran proteini olduğu gibi, nanodiscs burada "boş nanodiscs" (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir. Bu iki MSP1E3D1 iskele proteinleri ve POPC 8 yaklaşık 260 molekül bir kompozisyon için 256 kDa bir hesaplanmış molekül ağırlığına sahiptir. Bu protein kullanılarak: sulan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boş nanodiscs yeniden oluşturulması, protein nanodisc komplekslerinin hazırlanması ve bu komplekslerin TEM için negatif boyama: Yöntem, üç bölüme ayrılabilir. Her bölüm tekniği, kritik adımlar ve kullanışlı değişiklikler sınırlamaları ile ilgili ayrı ayrı ele alınacaktır.

Boş nanodiscs sulandırıldıktan. üretim ve nanodiscs kullanımında kritik adımlar ve sınırlamalar.

Boş nanodiscs hazırlanması için, MSP-to-lipit oranını optimize esastır. En yaygın MSP ve (bir deterj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, desteklerinden dolayı İsveç Araştırma Konseyi, Stockholm İl Konseyi ve KI fonları teşekkür ederiz. MSP ifadesi ve saflaştırılması Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Bilim Core Tesisleri'nde (http://PSF.ki.se) yapıldı. Yazarlar ayrıca, teknik uzmanlık paylaşımı için ve onların zamanında yardım için Dr. Pasi Purhonen ve Dr Mathilda Sjöberg teşekkür etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Transmisyon elektron mikroskobu: JEOL2100FJEOL
CCD kameraTiez Video ve Görüntüleme İşleme Sistemi GmbH, Almanya
Kızdırma deşarjıBaltec
TEM ızgarası: 400 ağTAABGM016 / C
Boyut dışlama kromatografisi: Agilent SEC-5Agilent Technologies5190-2526
Superdex 200 HR 10/300GE Healthcare Yaşam Bilimleri17-5172-01
Plazmid: MSP1E3D1Addgene20066
Bakteriler: BL21DE3NEBC2527H
Bakteriler: BL21 (DE3) T1R pRARE2Protein Bilimi Tesisi, KI, Solna
Saflaştırma Matrisi: ATP agarozSigma AldrichA2767
Saflaştırma Matrisi: HisTrap HP-5 mLGE Healthcare Life Sciences17-5247-01
Lipid: POPCAvanti polar lipidler850457C25 mg/mL kloroform içinde
Hidrofobik boncuklar: Biyo-Boncuklar, SM-2 ReçineBio-Rad1523920
13 mm şırınga filtresi: 0.2 μ mPall yaşam bilimleriPN 4554T
Boya: Sodyum fosfotungstat tribazik hidratSigma Aldrich31648
2-merkaptoetanolSigma AldrichM3148-250ML
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)Bio-Rad161-0301
Proteaz inhibitörü kokteyliSigma Aldrich4693132001
TCEPSigma Aldrich646547
Deterjan: Sodyum kolat hidratSigma AldrichC6445-10G
Sodyum Kolat500 mM Sodyum kolat. MiliQ suyunda tekrar süspanse edin ve -20 ° C'de saklayın.
Lipid Stoku50 mM POPC, 100 mM sodyum kolat, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. 4 &°C'de saklayın; Bir hafta boyunca C; veya
Mağaza -80 > Çözeltiyi azotla temizledikten sonra bir ay boyunca C.
MSP standart tampon20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
4 ° C'de saklayın.
İndenaturaing Olmayan Elektroforez Anot TamponuThermo Fisher ScientificBN200150 mM Bis-Tris, 50 mM Trisin, pH 6.8
İnatüre Olmayan Elektroforez Katot TamponuThermo Fisher ScientificBN200250 mM Bis-Tris, 50 mM Trisin, pH 6.8, %0.002 Coomassie G-250
İnattüre Olmayan Elektroforez 4x Örnek yükleme TamponuThermo Fisher ScientificBN200350 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, %10 (a/h) gliserol, %0.001 Ponceau S
İnaturalama Elektroforezi Çalıştırma TamponuEv içi tarif: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glisin, %0.1 (a/h) SDS
İndenaturalama Elektroforezi 5x Numune yükleme TamponuEv içi tarif: %0,05 (a/h) Bromofenol mavisi, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, %20 (h/h) gliserol, % 10 (a / h) SDS, 10 mM 2-merkaptoetanol
Müthiş et suyuTripton - 12.0 g, Maya Özü - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2< / sub>PO <> sub4< / sub> ve 0.72 M K < sub > 2 < / sub>HPO< sub>4< / sub>, Gliserol - 4 mL.
Tripton, maya ekstraktı ve gliserol 900 mL'ye kadar hazırlandı ve ayrı ayrı otoklavlandı. KH2PO4 ve K2HPO4 ayrı ayrı hazırlandı ve otoklavlandı. Her ikisi de ortamı kullanmadan önce karıştırıldı.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116(2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187(2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910(2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyNanodisc PreparationMembrane Protein BindingNegative Stain TEMSize Exclusion ChromatographyNon denaturing Gel ElectrophoresisPhosphotungstate StainingMonotopic Protein AnalysisNanodisc StackingProtein Nanodisc Complex

Related Articles