Bu protokol, kistik fibrozisli (KF) deneklerden alınan kültürlenmiş dokuda CFTR fonksiyonunu ve CFTR modülatör yanıtlarını ölçmek için bir testi tanımlar. Biyopsi kaynaklı bağırsak organoidleri, CF organoidlerinde kusurlu (veya güçlü bir şekilde azalmış) bir yanıt olan ve CFTR modülatörlerine maruz bırakılarak geri yüklenebilen bir yanıt olan cAMP güdümlü bir şekilde şişer.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir
Bu makalede
Özet
Özet
Son geliştirilen kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatörü (CFTR) modüle edici ilaçlar, kistik fibrozisli (KF) hastalarda mutant CFTR kanalının yüzey ekspresyonunu ve/veya fonksiyonunu düzeltir. Bu ilaçlardan fayda görebilecek deneklerin belirlenmesi, CFTR mutasyonlarının geniş heterojenliği ve bireysel ilaç etkinliğine katkıda bulunan diğer bilinmeyen faktörler nedeniyle zordur. Burada, bireysel CFTR fonksiyonunu ve CFTR modülatörlerine in vitro yanıtı ölçmek için basit ve nispeten hızlı bir testi açıklıyoruz. Üç boyutlu (3D) epitelyal organoidler, standart organoid besiyerinde rektal biyopsilerden büyütülür. Bir kez kurulduktan sonra, organoidler gelecekteki analizler için biyo-bankaya yatırılabilir. Test için, 30-80 organoid, bazal membran matrisindeki 96 oyuklu plakalara ekilir ve daha sonra ilaçlara maruz bırakılır. Bir gün sonra, organoidler kalsein yeşili ile boyanır ve forskolin kaynaklı şişme, 37 ° C'de konfokal canlı hücre mikroskobu ile izlenir. Forskolin kaynaklı şişme tamamen CFTR'ye bağımlıdır ve farklı ve hatta aynı CFTR mutasyonlarına sahip bireylerin ilaç tepkileri arasında ayrım yapılmasına izin vermek için yeterince hassas ve hassastır. İn vitro şişme yanıtları, tedaviye klinik yanıt ile ilişkilidir. Bu test, CFTR mutasyonlarından bağımsız olarak ilaca duyarlı bireylerin tanımlanması için uygun maliyetli bir yaklaşım sağlar. Ayrıca gelecekteki CFTR modülatörlerinin geliştirilmesinde de etkili olabilir.
Giriş
CF bir epitel anyon kanalı kodlar kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) geninde mutasyon neden olur. CF dünya çapında 1 yaklaşık 85.000 kişiyi etkilemektedir. 2000'den fazla CFTR mutasyonları (tespit edilmiştir www.genet.sickkids.on.ca ). Bu çeşitlilik, kısmen görülen hastalık fenotipleri (çok geniş bir yelpaze açıklar www.CFTR2.org ) 2, 3. CFTR mutasyonu altı sınıfları CFTR proteini ifade ve işlevi üzerindeki etkisi göre tanımlanmıştır: (i) sentezi (II) bozulmuş trafik, (II....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan insan dokuları kullanılarak tüm deney Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi etik kurul tarafından onaylandı (UMCU; TcBio # 14-008). Doku toplanması, üretimi, depolanması ve organoids kullanımı için bilgilendirilmiş onam Wilhelmina Çocuk Hastanesi (WKZ) -UMCU hastaların elde edildi.
| ekipman | tüketilir | Araçlar |
| Laminer akış kaputu | 15 ve 50 ml konik tüp | Zeiss LSM 800 - görüntüleri ölçmek için Zen 2 (Mavi baskı) yazılım |
| CO |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1A BMM üzerinde gömülü crypts bir temsilcisi taze izolasyon gösterir. kriptler CF konunun kolorektal biyopsi alınmıştır. Genellikle, bir organoid her crypt (- C Şekil 1A) oluşturulur. Nedeniyle CFTR disfonksiyonu, kolon CF organoids çoğu kistik değil, oldukça kompakt ve projeksiyonlar ve buddings (Şekil 2A - 2B) ile vardır. Bununla birlikte, bazı CF kistik şekli (Şekil 2C), vahşi t.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, insan kolorektal organoids üretimi, genişleme işlemi, dondurma ve eritme için tam bir protokol sağlar. Insan organoid Kültürlerin biraz zaman önce 17 kurduk iken, bazen uygulamalı eğitim olmadan başka laboratuarlarda teknolojiyi kurmak zor olduğu kanıtlanmıştır. Biz bu protokoller bu eğitimi yerini alacak tahmin ediyoruz.
Wnt-3A klimalı ortam oluşturulması ve organoid kültür uzun vadeli korumada başarılı olmak için en önemli reaktiflerin biridir. Nitekim, orga.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hans Clevers, organoid kültürü ve Forskolin kaynaklı şişme tahlili için patent sahibi bir mucittir. Jeffrey M Beekman, Forskolin kaynaklı şişme tahlili için patent sahibi bir mucittir. Sylvia F Boj ve Robert Vries, Organoid Teknolojisinin münhasır lisansına sahip olan Hubrecht Organoid Technology Vakfı (HUB) tarafından istihdam edilmektedir. Aksi takdirde, yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Hollandalı CF kuruluşundan (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), Wilhelmina Çocuk Hastanesi Araştırma Fonu ve CZ ve Zilverenkruis / ACHMEA HIT-CF programı tarafından desteklenmiştir. Biz S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot ve G. Berkers (Pediatrik Göğüs, Wilhelmina Çocuk Hastanesi, UMC Utrecht Bölümü), ve RHJ Houwen (Pediatrik Gastroenteroloji, Wilhelmina Bölümü teşekkür etmek istiyorum hastaları yaklaşan ve CF Biobank üretimi için biyopsi almak için Çocuk Hastanesi, UMC Utrecht).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Gelişmiş Dulbecco' s Besin Karışımlı Modifiye Eagles Medium F-12 Jambon (Ad-DF) 500 ml | Thermo Fisher Bilimsel: Invitrogen | #12634 | 4 &°C'de saklanır; C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Bilimsel: Invitrogen | # 35050 | 4 & derecede saklanır; C |
| Hepes | Thermo Fisher Bilimsel: Invitrogen | # 15630-056 | 4 & °C'de saklanır; C |
| Penisilin / Streptomisin | Thermo Fisher Bilimsel: Invitrogen | # 15140-122 | -20 ° C'de saklanır; C |
| 96 kuyulu kültür plakası | Cellstar | # 655180 | |
| 24 kuyulu kültür plakası | Cellstar | # 662160 | |
| 6 kuyulu kültür plakası | Cellstar | # 657160 | |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (-) CaCl2 < / sub> (-) MgCl< sub > 2< / sub>) (DPBS) Life | Technologies: Gibco | # 14190-094 | 4 & derecede saklanır; C |
| Dulbecco' s Modifiye Eagles Medium (DMEM) 500 ml | Thermo Fisher Bilimsel: | # 31966-021 | . 4 ° C'de saklanır; C |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT # 11113 | Wnt-3A Şartlandırılmış Orta Üretim için. -20 ° C'de saklanır; CL |
| Wnt3A hücre hattı | ATCC | #CRL-2647 | Wnt-3A Koşulu Orta Üretim için. |
| TOP/FOP plazmitleri | Millipore | #17-285 | Wnt aktivitesini ölçmek için |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | Wnt aktivitesini ölçmek için |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | Wnt aktivitesini ölçmek için |
| Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi | Promega | #E1910 | Wnt aktivitesini ölçmek için |
| Zeocin | Thermo Fisher Bilimsel: Invitrogen | #R250-01 | Wnt-3A için Hücre hattı seçimi |
| B27 takviyesi | Thermo Fisher Bilimsel: Invitrogen | # 17504-044 | -20 ° C'de saklanır; C |
| N-Asetilsistein | Sigma Aldrich | #A9165-5G | -20 ° C'de saklanır; C |
| Nikotinamid | Sigma Aldrich | #N0636 | -20 ° C'de saklanır; C |
| İnsan Epitelyal Büyüme Faktörü (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | -20 °C'de saklanır; C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | -20 ° C'de saklanır; C |
| TGFb tip I Reseptör inhibitörü (A83-01) | Tocris | # 2939 | -20 & derecede saklanır; C |
| Y-27632 dihidroklorür (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | -20 ° C'de saklanır; C |
| p38 MAPK inhibitörü (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | -20 ° C'de saklanır; C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | -20 ° C'de saklanır; C |
| İnsan Noggin (hNoggin) | PrepoTech | # 120-10C | -20 ° C'de saklanır; C |
| İnsan R-spondin 3 (hRspo-3) | R& D Sistemleri | # 3500-RS / CF | -20 ° C'de saklanır; C |
| Vankomisin | Sigma Aldrich | # 861987- 250mg | -20 ° C'de saklanır; C |
| Gentamisin | Yaşam Teknolojileri: Gibco | # 15710-049 | -20 ° C'de saklanır; C |
| Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) | Sigma Aldrich | # 431788 | 4 ° C'de saklanır; C |
| Matrigel | Corning | # 354230 | -80 ° C'de saklanır; C |
| TryplE Ekspres | Yaşam Teknolojileri: Gibco | # 12605-010 | dondurma için organoidleri dondurmak için |
| Geri Kazanım Hücre Kültürü Dondurma Ortamı | Yaşam Teknolojileri: Gibco | # 12648010 | dondurma |
| Calcein | Yaşam Teknolojileri: Gibco | #C3100MP | -20 ° C'de saklanır; C |
| Forskolin | Ar-Ge D Sistemleri | # 1099-50 mg | -80 ° C'de saklanır; C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | -80 ° C'de saklanır; C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | -80 ° C'de saklanır; C |
| Reaktiflerin / Malzemenin Adı< / güçlü> | Çözücü< / güçlü> | Stok Konsantrasyonu< / güçlü> | Nihai Konsantrasyon< / güçlü > |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penisilin / Streptomisin | 10K U / ml 10K ve mikro; g / ml | 100 U / ml 100 ve mikro; g/ml | |
| Zeosin | 100 mg / ml | 125 ve mikro; g/ml | |
| B27 takviyesi | 100x | 1x | |
| N-Asetilsistein | MiliQ H2O | 500 mM | |
| Nikotinamid | DPBS | 1 M | 10 mM |
| İnsan Epitelyal Büyüme Faktörü (hEGF) | DPBS %0,1 BSA | 0,5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 & mikro; M | 10 nM |
| TGFb tip I Reseptör inhibitörü (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihidroklorür (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 ve mikro; M |
| p38 MAPK inhibitörü (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 ve mikro; M |
| Primosin | 50 mg / ml & nbsp; | 100 ve mikro; g / ml | |
| İnsan Noggin (hNoggin) | DPBS% 0.1 BSA | 100 ve mikro; g/ml | 100 ng/ml |
| İnsan R-spondin 3 (hRspo-3) | lot başına değişir | 300 ng/ml | |
| Vankomisin | 10 mg/ml | 50 &mikro; g/ml | |
| Gentamisin | 10 mg/ml | 50 &mikro; g / ml | |
| Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) | MiliQ H < alt > 2 < / alt >O | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 & mikro; g / ml | 3.3 ng / ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | değişken |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | değişken |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | değişken |
Kaynaklar
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
