Method Article

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/55164

⸱

February 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir tüp kurdunun, Hydroides elegans'ın kalsifikasyonunu gözlemlemenin yanı sıra ilk kalsifiye materyalin yerini belirlemede ve karakterize etmede yararlı olan çeşitli mikroskopi yöntemlerinin kullanımını gösteriyoruz. Canlı mikroskopi ve elektron mikroskobu, biyomineralizasyonun incelenmesinde önemli olan fonksiyonel ve materyal bilgileri sağlamak için birlikte kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalsiyum karbonatın biyolojik üretiminin ilk olayını karakterize etmek, mikroskopi yaklaşımlarının bir kombinasyonunu gerektirir. İlk olarak, hücre içi pH dağılımı ve kalsiyum iyonları zaman içinde canlı mikroskopi kullanılarak gözlemlenebilir. Bu, daha ileri elektron mikroskobu çalışmaları için ilgilenilen özelliğe sahip yaşam evresinin ve dokunun tanımlanmasına izin verir. Yaşam evresi ve ilgilenilen dokular tipik olarak pH ve Ca sinyallerinde daha yüksektir.

Burada, H. elegans kullanarak, taramalı elektron mikroskobu (SEM) üzerinde biyolojik bir örnekte kalsiyum karbonat yapılarının varlığını karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz, element bileşimini görselleştirmek için enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi (EDS) kullanarak, kristal yapıların varlığını belirlemek için elektron geri saçılma kırınımını (EBSD) kullanarak ve malzemenin bileşimini ve yapısını analiz etmek için transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak. Bu protokolde, TEM analizine uygun boyuttaki numuneleri izole etmek için odaklanmış bir iyon demeti (FIB) kullanılır. FIB sahaya özgü bir teknik olduğundan, önceki tekniklerden elde edilen bilgilerin, Ca sinyallerinin en yüksek olduğu ilgili bölgeyi belirlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomineralizasyon zarif sipariş mineral 1 üretimi ile sonuçlanan hücre faaliyetlerinin bir paketi köprü etkinlikleri kompleks dizisidir. meydan dinamik hücresel süreci ve optik ve elektron mikroskopisi yöntemleri bir arada kullanarak sofistike mineral yapıları hem karakterize etmektir. Hücre içi pH yükselmesi dolayısıyla, artan bir pH değerine sahip döneminde ortaya tanımlayan kalsifikasyon 2, 3 meydana olması muhtemeldir zaman ortaya Caco 3 kristallerin oluşumunu desteklemektedir.

Etti Serpulidae gelen tüp kurtları okyanus 4 ortak calcifiers bulunmaktadır. Özellikle biyolojik kirliliğe 5, 6, aynı zamanda deniz araştırmaları için popüler bir omurgasız modelidir. Bu çalışmada, hidrotermal bölümlerinde kalsifikasyon süreci During Biyomineralizasyon görülmektedir. Metamorfoz hızlı işlem kalsiyum karbonat yapıları 7, 8 çıkmasını içerir.

Biz tubeworm yapılabilir nasıl iç pH ölçümleri göstermek ve yaşam evreleri ve kalsifikasyon hakkında dokular nasıl taranabilir. ilgi hayat aşaması tanımlandıktan sonra, kireçlenme sorumlu doku elektron mikroskopisi yöntemleri kullanılarak daha yüksek bir çözünürlükte karakterize edilebilir. Floresan mikroskobu kullanarak, metamorfik indüksiyondan sonra görünmesi kalsiyum karbonat için gereken zamanı belirler. hayatın benzer bir sahne daha sonra element bileşimi dağıtımı için SEM-EDS ile görüntülendi ve biriken mineral, iki farklı elektron mikroskopi yöntemleri, özellikle SEM-EBSD ve FIB-TEM kullanılarak analiz edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Canlı Görüntüleme ile Yaşam Evresi ve İlgilenilen Doku Taraması,

  1. Deniz larvalarını daha önce bildirilen yöntemlere göre yetkinlik için kültürleyin6,7,9. Tüp kurdu larvalarını gece boyunca 10 μM SNARF-1 ile filtrelenmiş deniz suyu ile mL yoğunlukta 5 larvada inkübe edin. Floresan probunu foto ağartmadan korumak için kabı alüminyum folyo ile örtün.
  2. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak larvaları gözlemleyin. Metamorfoza hazır yetkin tüp kurdu larvaları, dairesel bir hareket yerine ileri yönde yüzecektir.
  3. Yetkili larvaları 60 μm'lik bir ağa aktarın. Ağı bir Petri kabına bastırarak sıvıyı tutmak için iyi bir sızdırmazlık sağlar. Larvaları koruyarak floresan boya içeren deniz suyunu serbest bırakmak ve atmak için contayı hızla serbest bırakın.
  4. Larvaları filtrelenmiş yapay deniz suyu (FASW) ile iki kez yıkayın ve işlem sırasında larvaları kurutmamaya dikkat edin.
  5. Metamorfoz sürecini gözlemlemek için 10-4 M izobütilmetilksantin (IBMX) içeren 5 mL FASW ile 10 ila 20 larvayı ince cam tabanlı tabaklara yerleştirin.
  6. SNARF-1 sinyalini algılamak için filtre küplerini yerleştirin (Kanal 1: Ex 510/25 Em 580/30; Kanal 2: Ex 510/25 Em 640/35) ve larvaların DIC görüntüsü.
  7. Metamorfoza uğrayan larvaları 20X hedefinin altına yerleştirin, ardından canlı hayvanların net bir görüntüsünün yakalanmasını sağlamak için deklanşör süresini (100-300 ms) yeterince hızlı optimize edin.
  8. Üç kanalın tümünün bir Z-yığınını yakalamak için 1 μm mesafeyi ayarlayın, canlı bir hayvanı görüntülerken, z yönünün bir sonraki katmanına geçmeden önce üç kanalın tümü için her katmanı görüntülemek, kanallar arasında daha iyi bir korelasyon sağlayacaktır.
  9. Tüm kanallar ve katmanlar için gri tonlamalı görüntüleri mikroskop yazılımından TIF dosyaları olarak dışa aktarın: Dosya | İhracat | Dosya türü: TIF | Başlamak.
  10. ImageJ'yi kullanarak her kanal için görüntü sırasını içe aktarın: Dosya | İthalat | Görüntü dizisi.
    1. Kanal 1 λ1em'i içe aktarmak için, başlangıç görüntüsü 3'ü girin ve artırın: 4.
    2. Kanal 2 λ2em'i içe aktarmak için, başlangıç görüntüsü 4'ü girin ve artırın: 4.
  11. Her katman için λ2em'yi λ1em'e piksel piksel bölerek bileşik bir görüntü oluşturun (İşlem | Görüntü Hesaplayıcı... | Görüntü dosyası 640 nm "böl" görüntü dosyası 580 nm), yani 640/580 nm oranı.
  12. Resim Seç | Arama Tabloları | 16 renk.
  13. Analiz Et | Araçlar | Kalibrasyon çubuğu.
  14. En fazla heterojenliği içeren katmanı belirleyerek farklı katmanları inceleyin. Bu, dahili pH dağılımı ile ilgili en yararlı bilgileri sağlar.
  15. 640/580 nm oranı ile pH arasındaki ilişkiyi kullanarak, iç pH dağılımını görselleştirmek için bir çizim profili oluşturun.

2. Dahili pH Kalibrasyonu

  1. 10 μM SNARF-1 ile yaklaşık 20 larvanın gece boyunca boyanmasından sonra, kalibrasyon için 50 μM nigerisin ve 150 mM KCl oluşturmak için nigericin ve KCl'nin stok çözeltilerini ekleyin.
  2. AFSW kalibrasyonunun pH'ını, yaklaşık 5.9 pH elde edilene kadar seyreltik NaOH veya HCl ile ayarlayın. Tam pH değerini not edin. Deniz suyu bazlı 2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol (Tris) ve 2-aminopiridin9 ile kalibre edilmiş cam elektrotlu bir pH metre ile pH ölçüm yapın.
  3. 640 nm ve 580 nm'deki sinyal yoğunluğunun ölçümü için lekeli bir tüp kurdu larvasını bilinen pH'lı bir sıvı ile birlikte kuru ve temiz bir kaba aktarın.
  4. 5.9 ile 9.9 arasında değişen dört pH noktası için 2.2 ve 2.3 adımlarını tekrarlayın. Fizyolojik olarak ilgili bir dizi değeri temsil ederler.
  5. Sinyallerin hayvan vücudunun her yerinde homojen göründüğünden emin olmak için kontrol edin. Bu, hücre içi pH'ın çevresel deniz suyu ile dengelendiğini gösterir.
  6. Tüp kurdu larvalarını beş farklı deniz suyu pH ortamında görüntüleyin, 640 nm ve 580 nm'de "gri değerler" olarak gösterilen yoğunlukları kaydedin, yani λ2exc ve λ1exc.

3. Oransal Görüntüleme Verilerinin Analizi

  1. Rastgele beş konumdan veya bir elektronik tablo üzerindeki bir ilgi alanından ölçülen gri değerleri girin.
  2. Beş nokta kalibrasyonunun hücre içi pH'ı belirtmek için doğrusal bir ilişki gösterdiğini kontrol edin (örneğin, y = 0.30x - 1.47; y = gri değer; x = pH; R² = 0.934).
  3. Adım 1.13'te ölçülen 640/580 nm yoğunluk oranını kullanarak denklemden hücre içi pH değerlerini hesaplayın.

4. Elektron Mikroskobu için Numune Koruma, Dehidrasyon ve Montaj

  1. % 4 paraformaldehit ile ilgilenilen yaşam evresini koruyun. Bu çalışmada, tüp kurtlarını bağlandıktan 2-4 gün sonra sabitleyin, analize kadar hayvanları fiksatif halde tutun.
  2. Bir davlumbazda çalışarak, dehidrasyon işlemi sırasında doku büzülmesini en aza indirmek için numuneyi 30 dakika boyunca% 1 osmiyum tetroksit sulu çözeltisi ile sabitleyin.
  3. Numuneyi kademeli bir etanol serisi ile kurutun: 5 dakika boyunca% 50 etanol, 5 dakika boyunca% 70 etanol, 5 dakika boyunca% 85 etanol, 5 dakika boyunca% 95 etanol ve son olarak iki kez 5 dakika boyunca mutlak etanol.
  4. Çeker ocakta çalışarak, numuneye 1:1 oranında etanol ve heksametildisilazan (HMDS) çözeltisi ekleyin ve sıvının tamamen buharlaşmasına izin verin.
  5. Çeker ocakta, numuneye %100 HMDS ekleyin ve sıvının tamamen buharlaşmasını sağlayın.
  6. Bir elmas bıçak kullanarak, kültür kabına birkaç tüp kurdunu çevreleyen birkaç kesik atın. Kapak kapalıyken, tabağı kırmak için tabağın altını alüminyum bir saplamaya tutun.
  7. Diseksiyon mikroskobu altında, sağlam bir tüp kurdu içeren kırık bir parça bulun.
  8. Alüminyum bir saplamaya gümüş boya uygulayın ve parçayı saplamaya dikkatlice sabitleyin. Şarjı azaltmak için plastik parçanın kenarlarını boyayın.

5. SEM-EDS Kullanarak Kalsiyum Açısından Zengin Bir Bölgenin Bulunması

  1. Numune saplamasını numune tutucusuna sabitleyin.
  2. Mikroskopla birlikte verilen mastara karşı tüm düzeneğin yüksekliğini ölçün, kilitleme rondelasını gevşeterek ve numune standart yüksekliğe gelene kadar direği döndürerek yüksekliği ayarlayın veya yüksekliği kaydedildiği gibi girin.
  3. Mikroskop değişim odasına hava verin ve oda kapısını açın. Numune tutucuyu değiştirme çubuğunun ucuna kaydırın. Ardından odayı kapatın ve boşaltın.
  4. Sürgülü vanayı açın ve değişim çubuğunu mikroskop odasına doğru kaydırın. Numune tutucuyu mikroskop tablasına tam olarak oturtmak için değiştirme çubuğunu sonuna kadar kaydırın. Değiştirme çubuğunu çıkarın ve sürgülü vanayı kapatın.
  5. Numune boyutlarını girin ve numuneyi elektron sütununun altına yerleştirmek için sahneyi Ana konuma gönderin.
  6. VP-SEM modunda hazne vakum seviyesini 20-30 Pa'ya ayarlayın. Elektron hızlandırma voltajını 20 kV'a ayarlayın ve yüksek voltajı açın.
  7. Sahneyi 10 mm'lik bir numune çalışma mesafesine yükseltin. Canlı bir yem alın ve numuneyi bulun. Görüntüyü optimize edin, astigmatizmayı ayarlayın ve gerektiği gibi odaklanın.
  8. SEM-EDS programını açınız ve EDS-SEM modu seçeneğini seçiniz. Bir EDS haritasını çalıştırmak için menü seçeneğini seçin.
  9. SEM-EDS programındaki hız ölçer aracılığıyla izlendiği gibi 3 °C'lik bir işlem süresinde ~%30'luk bir ölü zaman elde etmek için kondansatör lensi ve diyafram ayarlarını değiştirin. Işın ayarlarında herhangi bir değişiklik yaptıktan sonra ışın ve diyafram hizalama prosedürlerini çalıştırın.
  10. Tek bir organizma tüm görüş alanını dolduracak şekilde bir büyütme seçin. Sapma düzeltme seçeneğini etkinleştirin ve SEM-EDS programında bir görüntü yakalayın.
  11. 50-100 ms'lik bir bekleme süresi kullanarak organizmanın tüm görüş alanını doldurduğu harita verilerini elde edin. Veriler, organizma içinde Ca'nın belirgin lokalizasyonunu gösterene kadar (yaklaşık 15 dakika) haritayı çalıştırın.
  12. Nokta niceleme verilerini elde etmek için, işlem süresini 6 olarak değiştirin ve elektron probunu ~%30'luk bir ölü zaman elde edecek şekilde ayarlayın. Hizalama adımlarını çalıştırın ve görüntüyü gerektiği gibi optimize edin.
  13. SEM-EDS programında Point and ID (Nokta ve ID) seçeneğini seçiniz ve başka bir görüntü elde ediniz. Tek nokta aracını kullanarak, EDS haritasında Ca açısından zengin görünen alanlara ve karşılaştırma için Ca eksik alanlara tıklayın. Her noktayı 30 saniyelik canlı bir süre için tarayın.

6. SEM-EBSD Kullanarak Kalsiyum Açısından Zengin Bölgelerin Kristalografik Bilgilerinin Tanımlanması

  1. İlgilenilen numuneyi içeren plastik parçayı düz numune saplamasından çıkarın ve gümüş iletken yapıştırıcı kullanarak 45° önceden eğilmiş bir saplamanın eğimli yüzüne yapıştırın.
  2. Saplamayı numune tutucuya vidalayın ve saplamanın açılı yüzünü (numuneyle birlikte) numune tutucunun önüne doğru konumlandırın. Değişim odasını kullanarak numune tutucuyu mikroskobun haznesine yerleştirin.
  3. Oda vakumunu 30 Pa'ya ve elektron hızlandırma voltajını 20 kV'a ayarlayın. Numuneyi elektron sütununun altına gönderin ve numune yüzeyini normalden elektron demetine yaklaşık 25° yerleştirmek için aşamayı 70° eğin. Yüksek voltajı açın.
  4. Sahneyi ~18 mm'lik bir çalışma mesafesine yükseltin. Sahneyi hareket ettirmek ve bir örneği bulmak için hareket topunu kullanın. İlgilenilen belirli özellikleri çerçevelemek için büyütmeyi artırın. Işını hizalayın ve görüntüyü gerektiği gibi optimize edin.
  5. SEM-EDS programını EBSD modunda açınız. İlgilenilen fazlar olarak kalsit ve aragoniti seçin. EBSD kamerayı 154 mm mesafeye yerleştirin. Kamera koşullarını 1 x 1 gruplama ve 100 ms kare süresine ayarlayın. Hızlı ışınlı bir raster kullanarak bir arka plan edinin.
    NOT: Elektron probuna bağlı olarak farklı bir kare hızı gerekebilir; Yaklaşık% 90'lık bir sinyal elde etmek için probu veya kamera kare hızını ayarlayın.
  6. SEM-EDS programında bir görüntü yakalayın. Nokta analiz aracını kullanın ve o noktadaki ışını taramak için görüntünün üzerinde bir yere tıklayın. Herhangi bir Kikuchi deseni tespit edilip edilmediğini görmek için kamera penceresini gözlemleyin.
  7. Potansiyel kalsifikasyon bölgelerini taramak için görüntünün farklı alanlarına tıklayın ve Kikuchi bantlarının mevcut olup olmadığını görmek için her noktada kamera penceresini gözlemleyin. Desenler varsa ve veritabanında seçilen aşamalardan herhangi biriyle eşleşirse, bunlar otomatik olarak dizine eklenir.

7. FIB-SEM Kullanarak TEM Numune Hazırlama

  1. İletken bir tabaka oluşturmak için hazırlanan SEM örneğini platin veya benzeri bir malzeme ile püskürtün.
    1. Önceden sabitlenmiş, susuz kalmış ve monte edilmiş numuneleri püskürtme kaplayıcının muhafazasına yerleştirin ve hazneyi aşağı pompalamaya başlamak için gücü açın.
    2. Hazne vakumu 40 mTorr veya daha az okuduğunda, gaz anahtarını açın ve 200 mTorr'luk bir hazne basıncına ulaşmak için argon gazı akışını artırın. 80 mTorr'luk bir son oda basıncı elde etmek için gaz akışını ayarlayın.
    3. Voltaj anahtarını açın ve 15 mA'lık bir akıma ulaşmak için voltajı artırın. Numune yüzeyini iyon ışınlaması hasarından koruyan kalın bir katman (~60 nm) oluşturmak için zamanlayıcıyı ve kaplamayı uzun bir süre (~10 dakika) ayarlayın. Sabit bir 15 mA akımı korumak için voltajı düzenleyin.
    4. Bitirdikten sonra, vakumu serbest bırakmak için kaplayıcıyı kapatın ve numuneyi çıkarın.
  2. Hazırlanan, püskürtme kaplı s'nin tabanını vidalayınampaletin M4 vida direğine.ample'siamp tutucu. El sıkılaşana kadar sıkın, kilitleme somununu gevşetin ve ardından tertibatın yüksekliğini değiştirmek için numune tutucu direğini döndürün. Lazer yükseklik ölçeri kullanın ve yüksekliği, cihazla birlikte verilen standardın 1 mm (= videoda gösterildiği gibi 0.04 inç) içinde olacak şekilde ayarlayın.
  3. FIB-SEM'deki tüm tabanca valflerini kapatın ve ardından ösentrik aşama hava kilidine hava girin. Basınç ortamla eşitlendiğinde, hava kilidini kaydırarak açın ve numune tutucuyu değişim çubuğunun uçlarına takın. Değiştirme çubuğunun ucundaki düğmeyi "kilit" konumuna çevirin. Hava kilidini kapatın ve hava kilidi odasını boşaltın.
  4. Ösentrik aşama hava kilidi boşaltıldıktan ve basınç FIB-SEM odasınınkiyle eşleştiğinde, sürgülü vanayı açın ve değişim çubuğunu içeri iterek numuneyi yerleştirin. Numune tutucuyu cihaz eucentric aşamasına oturtmak için değiştirme çubuğunu sonuna kadar kaydırın, ardından değiştirme çubuğunu "kilit açma" konumuna çevirin. Değiştirme çubuğunu tekrar dışarı kaydırın ve sürgülü vanayı kapatın.
  5. Numuneyi iyon ışını sütununun altına yerleştirmek için sahneyi hareket ettirin. Sürgülü vanaları açın ve FIB'nin canlı iyon kaynaklı ikincil elektron görüntüsünü elde edin. İyon hasarını en aza indirmek için düşük büyütme ve hızlı tarama kullanın. Normal gözlem ışınının odağını sıfırlayın ve s'nin Z yüksekliğini yükseltin.tage örnek odakta olana kadar. Bu noktada numune, hem iyon hem de elektron demetlerinin aynı konuma odaklandığı çapraz nokta konumundadır.
  6. SEM'den gelen ikincil elektron görüntüsünü kullanarak, numuneyi hareket ettirmek için iztopunu kullanarak numunenin ilgilendiği alanı bulun. İlgi alanları, daha önce EDS haritalaması ile belirlenen Ca bakımından zengin alanlardır. İlgilenilen özellikleri pencerenin çerçevesiyle aynı hizada elde etmek için sahneyi gerektiği gibi döndürün.
  7. FIB pencere arayüzünde, ek bir 2X dijital yakınlaştırma ile 1.000X büyütmede numunenin hızlı bir anlık görüntüsünü yakalayın ve ilgilenilen alan üzerine ~8 μm x 2 μm'lik bir biriktirme şablonu çizin. Biriktirme kutusunun büyütme boyutu, farklı boyutlardaki özellikleri barındıracak şekilde ayarlanabilir. Püskürtme koşullarını, 5 dakika boyunca 0,5 μs'lik bir bekleme süresi kullanarak 40 kV, 0,09 nA ışın kullanarak karbon biriktirecek şekilde ayarlayın.
  8. Karbon birikiminden sonra, 40 kV, 0.7 nA ışın kullanarak tungsten biriktirmek için biriktirme koşullarını değiştirin ve ~ 2-3 μm tungsten kapağı oluşturmak için 5 dakika biriktirin.
  9. Gözlem ışınını kullanarak bir FIB anlık görüntüsü yakalayın ve tungsten kapağının etrafına dört kutudan oluşan bir desen çizmek için mikro örnekleme püskürtme aracını kullanın. Üst ve alt kutuları yaklaşık 15 μm x 8 μm olacak şekilde ayarlayın; Sağ kutu 10 μm x 5 μm ve sol kutu 6 μm x 5 μm veya ilgilenilen alanı çevreleyecek kadar büyük.
    1. 40 kV, 19 nA ışın ve 50 μs'lik bir bekleme süresi ve her kutu için 3-4 tarama çerçevesi kullanarak kesmek için üretim koşullarını değiştirin. Sonra deseni üretin. İmalattan sonra, koruyucu C ve W katmanları ile ilgili alan, üst, alt ve sağ taraflardaki tüm bitişik malzemeler çıkarılmış bir adaya benzeyecektir.
  10. Numune yüzeyini elektron sütununa normal ve iyon sütununa dik bir açıyla yerleştirmek için aşamayı 58° eğin. FIB'yi kullanarak örnek "adanın" arka tarafını bulun ve 1.000X büyütme ve 2-4X dijital yakınlaştırmada bir anlık görüntü yakalayın.
  11. Numune "adasının" arka tarafının altına, göründüğü yerin en sonunda ~ 15 μm x 2 μm'lik bir püskürtme deseni çizin. Kutuyu 4 nA'lık bir kiriş kullanarak 3 dakika boyunca veya kiriş numune "adasının" altından geçene kadar imal edin.
  12. Ösantrik aşamayı mevcut konumdan -58° eğin (sıfıra geri). FIB arayüzünde "Prob In" seçeneğine tıklayarak tungsten mikroörnekleme probunu yerleştirin. Sahne alanı kontrol panelinde "MS"yi seçin ve probu numunenin üzerinde hareket ettirmek için iztopunu kullanın.
  13. FIB'den 1 kx büyütme ile canlı bir besleme alın ve probu, uç doğrudan mikro numunenin tungsten kapağının sağ tarafının üzerinde olacak şekilde konumlandırın. SEM'den canlı bir SE görüntüsünü izlerken, probu tungsten kapağına temas edene kadar indirmek için sahne panelinin Z kontrol düğmesini kullanın. Temas kurulduğunda bir sesli uyarı duyulacaktır.
  14. 1.000X büyütme ve 2X dijital yakınlaştırmada 40 kV, 0,01 nA ışın kullanarak FIB'yi kullanarak bir anlık görüntü yakalayın. Probun ucuna, mikronumunenin tungsten kapağıyla temas ettiği yere 2 μm x 2 μm'lik bir kutu çizmek için biriktirme aracını kullanın.
    1. 40 kV, 0.09 nA ışın, 2 dakika ve 0.5 μs'lik bir bekleme süresi kullanarak tungsten biriktirmek için koşulları ayarlayın. Sonra deseni üretin.
  15. Mikro numune "kolunun" sol ucuna (hala numunenin büyük kısmına bağlı olduğu yerde) ~2 μm x 5 μm'lik bir püskürtme deseni çizin. Deseni 40 kV, 0.7 nA ışın kullanarak 2 dakika boyunca veya bip sesi mikro numunenin toplu numuneden ayrıldığını gösterene kadar üretin.
  16. Ekli mikro sampile probu toplu numuneyi temizleyene kadar kaldırmak için Z kontrol düğmesini kullanın, ardından probu geri çekin. Ötesantrik aşamayı Ev veya Değişim konumuna gönderin.
  17. Yan giriş tutucusuna bakır bir yarım ızgara yerleştirin ve tutucuyu yan giriş aşaması boşaltma odasına yükleyin. Hazneyi boşaltın ve yan giriş tutucusunu takın. Tutucuyu FIB konumuna getirin.
  18. Sahne alanı kontrol panelinde Yan tuşuna basın ve FIB monitöründe yarım ızgarayı görünür hale getirmek için hareket topunu kullanın. Yarım ızgaranın temiz alanına gidin ve yüzeyi odaklamak için Z düğmesini kullanın.
  19. Probu yerleştirmek için Prob In'e basın, s'ye basıntage kontrol paneli ve mikrosample yarım ızgara üzerinde. Mikro numune ızgaraya temas edene kadar probu indirin.
  20. FIB'de 1.000X büyütme (2X yakınlaştırma) ile bir görüntü yakalayın. Biriktirme aracını kullanın ve mikro numunenin alt tarafına ~10 μm x 3 μm'lik bir desen çizin. 3 dakika boyunca 0,5 μs'lik bir bekleme süresi kullanarak 40 kV, 0,7 nA ışın ile tungsten biriktirin.
  21. Püskürtme aletini kullanın ve probun ucunun üzerine 1 μm x 3 μm'lik küçük bir desen çizin. Probu mikro numuneden kesmek için 3 ms'lik bir bekleme süresinde 40 kV, 0,7 nA ışın kullanarak deseni üretin. Probu serbest bıraktıktan sonra geri çekin.
  22. 5.000X büyütmede bir FIB görüntüsü yakalayın ve mikro numunenin üstünde ve altında 7 μm x 4 μm'lik iki püskürtme deseni çizin ve kutular arasında ~1 μm boşluk bırakın. Mikro numunenin sol ve sağ taraflarını kesmeyecek şekilde desenleri ortalayın. Her iki modeli de 40 kV, 4 nA ışın ve 3 μs'lik bir bekleme süresi kullanarak 2 dakika boyunca üretin ve raster yönünü mikro numunenin merkezine doğru ayarlayın.
  23. 5.000X'te FIB gözlem ışınını kullanarak başka bir görüntü yakalayın. Önceki püskürtme kutularını ~6,5 μm x 1 μm olarak yeniden boyutlandırın, ~0,5 μm'lik bir boşluk bırakmak için birbirine yaklaştırın ve 40 kV, 0,7 nA ışın kullanarak üretin.
  24. Yan giriş aşamasını 0,5° eğin ve başka bir FIB görüntüsü yakalayın. Püskürtme kutularını 6 μm genişliğinde olacak şekilde yeniden boyutlandırın. Üst deseni mikro numunenin üst tarafına yerleştirin ve 40 kV, 0.7 nA ışın kullanarak üretin. -0.5° eğin ve alt püskürtme deseni ve mikrosamp'ın alt tarafı ile tekrarlayın.ample.
  25. Desen genişliğini ~0,5 μm daha da azaltın. 0,5° eğin ve 40 kV, 0,09 nA ışın kullanarak mikro numunenin üst tarafını püskürtün. Alt taraf -0.5° eğimle tekrarlayın.
  26. Sahneyi 2,2° eğin ve 10.000X'te bir FIB görüntüsü elde edin. Püskürtme modellerini 5 μm genişliğe yeniden boyutlandırın ve ışın koşullarını 5 kV, 0,03 nA olarak değiştirin. Üst deseni mikro numunenin üst tarafına, üst kenarın tam üzerine yerleştirin ve imal edin. -2,2° eğin ve alt taraf ve alt desenle tekrarlayın.
  27. Mikro numune elektron şeffaf hale gelene kadar (~100 nm kalınlık) 5 kV frezeleme adımını tekrarlayın. Bitirdikten sonra, tabanca valflerini kapatın ve yan giriş tutucusunu çıkarın.

8. Bir TEM Üzerinde Seçilen Alan Kırınım Modelini Elde Etme

  1. Cihazı analize hazırlamak için her iki Dewar şişesini de sıvı nitrojen ile doldurun ve hızlanma voltajını 300 kV'a ayarlayın.
  2. FIB kullanarak numune hazırlandıktan sonra, yan giriş tutucusunu FIB-SEM'den çıkarın ve pim konumunu, tutucu uzunluğu 300 kV TEM'inkine uyacak şekilde ayarlayın. Numune oryantasyonunu sağlamak için tutucunun ucunu doğru gözlem konumuna çevirin ve bir kez daha standart TEM tutucu ile karşılaştırın.
    1. Alternatif olarak, takılı lamelli yarım ızgarayı FIB-SEM tutucusundan çıkarın ve standart TEM tutucusuna yerleştirin.
  3. Numune tutucuyu TEM'in değişim odasına yükleyin ve odayı boşaltın. Değişim odasına hava girdiğinde alet tabancası valfinin kapalı olduğundan emin olun. Değişim odası aşağı pompalandığında, sesli bir alarm çalacaktır. Numune tutucuyu saat yönünde çevirin ve vakumun numune tutucuyu ilk durma konumuna çekmesine izin verin.
  4. Alet vakumunun toparlanmasına izin verin ve ardından tabanca valfini açın. Odağı sıfırlayın ve yaklaşık 10.000X büyütmeye yakınlaştırın.
  5. Işını fosfor ekranın merkezine kaydırmak için hizalama düğmelerini kullanın. Işını daraltın ve genişletin ve tüm ışın hareketinin eş merkezli olduğundan emin olun. Kondenser damgasısını gerektiği gibi ayarlayın.
  6. Numune tutucuyu saat yönünün tersine çevirin ve vakumun tutucuyu tamamen kolona çekmesine izin verin. S'yi kullanıntage gezinmek ve bulmak için hareket düğmeleriample.
  7. Numune üzerindeki büyütmeyi artırın ve numune odaklanana kadar Z yüksekliğini ayarlayın. Optik göz merceklerini gerektiği gibi kullanın.
  8. Kamerayı takın ve fosfor ekranı çıkarın. Kameranın aşırı doygunluğunu önlemek için ışını gerektiği gibi genişletin. Odak ve kamera parametrelerini ayarlayın, ardından bir görüntü yakalamak için çekime başlayın.
  9. Bir kırınım deseni elde etmek için, önce ilgilenilen özelliği ortalayın. Objektif açıklığı çıkarın ve kırınım açıklığını yerleştirin.
  10. Kontrol panelindeki DIFF düğmesine basarak kırınım lensi moduna geçin ve ışını küçültmek için DIFF kontrol düğmesini kullanın.
  11. Kırınım deseninin merkezinin kamerayı veya fosfor ekranını yakmasını önlemek için karartıcıyı gerektiği gibi yerleştirin. Desenin bir görüntüsünü yakalamak için kamerayı almaya başlayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda, tüp kurdunun metamorfozu sırasındaki kalsifikasyon sürecinin bazı gözlemleri yer almaktadır. Şekil 1'de metamorfoz sonrası yaka bölgesine yakın pH değerlerinin diğer dokulara göre daha yüksek olduğu görülmektedir. Şekil 2i, homojen Ca dağılımına sahip bir tüp kurdunu göstermektedir, bu da önemli bir kalsifikasyon olayının başlamadığını düşündürmektedir; Şekil 2ii, daha uzun süre kalsifiye olmuş bir tüp kurdunu göstermektedir, bu ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı optik görüntüleme, çok hücreli bir organizmadaki hücresel olayları gözlemlemek için yararlı bir yöntemdir. Burada, mineralizasyon bölgelerindeki iyon akışını ölçmek için dahili pH ve kalsiyum iyonu göstergeleri kullanıldı. Bu bölgelerde, kalsifikasyonu 2,3 sağlamak için pH veCa2+ konsantrasyonunu yükseltmek için aktif iyon pompalama gereklidir. Bir organizmayı incelemek için floresan molekülleri uygularken, kullanılan konsantrasyonun ihmal edileb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Clemson Broadcast Productions'a, J. Bright'ın ses kaydına, A. D. McQuiston'ın anlatımına, Ses tatlandırıcısına, K. Murphy'ye, G. Spake'in videografisine, T. Messervy'nin grafik sanatlarına, T. Messervy ve E. Rodgers'ın video düzenlemesine çok teşekkür etmek istiyor. Teknik yardım ve bilimsel danışmanlık, S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane ve R. Dineshram'ın tavsiyelerinden esinlenmiştir. Bu çalışma, HKSAR-RGC tarafından sağlanan üç GİF hibesi ile finanse edilmiştir (Hibe Numaraları: 705511P, 705112P ve 17304914).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Heksametildisilazanan & nbsp;Elektron Mikroskobu Bilimleri16700(EM)
Osmiyum Tetroksit %2 Sulu ÇözeltiElektron Mikroskobu Bilimleri19192
IBMX 3-İzobutil-1-metilksantinThermoFisher ScientificPHZ1124
Nigericin, Serbest AsitThermoFisher ScientificN7143-5MG
35 mm çaplı çanak, delik boyutu 27 mm, Cam No.0, KaplamasızThermoFisher ScientificD110400
5- (ve-6) -Karboksi SNARF-1, Asetoksimetil Ester, AsetatThermoFisher ScientificC-1271
BDH Potasyum Klorür, ACS SınıfıVWRBDH0258-500G
Paraformaldehit
reaktif sınıfı, kristalin		Hacimsel Analiz için SigmaP6148
1 M Hidroklorik AsitWako Saf Kimyasal Industries, Ltd083-01095
Hacimsel Analiz için 0.05 M Sodyum Hidroksit ÇözeltisiWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd199-02185
CalceinSigmaC0875
FASWIwaki Co. Ltd.Rei-sea Marine Karışık
Selüloz Ester Membranları; 47 mm çap, 0.45 & mADVANTECA045A047A
etanolWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd051-00476
DOE (1994) SOP06 iletamponlar
Sodyum KlorürWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd191-01665
Potasyum KlorürWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd163-03545
Magnezyum Klorür HeksahidratWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd135-00165
Kalsiyum KlorürWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd039-00475
Sodyum SülfatWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd197-03345
Hidroklorik AsitWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd089-08415
2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol (tris)Wako Saf Kimya Sanayi, Ltd207-06275
2-aminopiridinWako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd011-02775
Orion 5 yıldızlı Plus pH metreThermo Scientific
PrpHecT ROSS Mikro Kombinasyon pH Elektrodu 8220BNWPTermo Bilimsel
Aksivizyon, Sürüm 4.6, Axio Observer Z1Zeiss
ImageJNIH, Bethesda, MD, ABD
HRTEM H500Hitachi
SU6600 VPSEMHitachi
NB5000 Odaklanmış İyon ve Elektron Işını (FIB-SEM) sistemiHitachi 
için yapay deniz suyu, cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
  2. de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
  3. de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
  4. Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
  5. Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14(1998).
  6. Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
  7. Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
  8. DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
  9. Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97(2015).
  10. Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
  11. Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
  12. Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
  13. Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
  14. Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  15. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
  16. Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
  17. Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Calcium Carbonate CalcificationLive Optical MicroscopyElectron Microscopy TechniquesIntracellular pH ImagingScanning Electron MicroscopyEnergy Dispersive Xray SpectroscopyElectron Backscatter DiffractionTransmission Electron MicroscopyFocused Ion BeamMarine Tubeworm Larvae

Related Articles