Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Dikey dilim hazırlıkları iyi yetişkin memeli retina devresi ve sinyal iletimi incelemek için kurulmuştur. Bu hazırlıklar içinde kesit düzlemi fotoreseptör ve bipolar hücreler gibi radyal yönelimli nöronların çalışma için idealdir, retina yüzeyine dik. Ancak, yatay hücreler, geniş alan amacrine hücreleri ve ganglion hücrelerinin büyük dendritik milleri bu hücrelerde belirgin azalma sinaptik aktivite bırakarak, çoğunlukla kesiliyor. ganglion hücrelerinin ve yerinden amacrine hücreleri retina bir bütün monte hazırlanmasında incelenebilir ise, yatay bir hücre ve iç nüklear tabakada bulunan amacrine hücreleri sadece zayıf bütün retina dokusu elektrotlar için erişilebilir.
Maksimum erişilebilirlik ve sinaptik bütünlüğünü sağlamak için, biz fare retinanın yatay dilim hazırlık geliştirdi ve fotoreseptör ve yatay arasındaki sinaps sinyal iletimi okuduHücreler. Yatay kesit yatay hücre dendritler bozulmamış ve fonksiyonel koni sinaptik girişi için bir ön koşul olarak, elektrot hedefleme yatay hücre gövdeleri (1) kolay ve açık görsel kimlik ve genişletilmiş yatay hücre dendritik alanları (2) korunmasını sağlar.
yatay dilimler arasından yatay hücrelerin karanlıkta tonik sinaptik aktivite göstermiştir, ve bunlar içe akım ve azalmış sinaptik aktivitenin bir azalma ile ışık çakmaları yanıt vermiştir. İmmünositokimyasal kanıtlar yatay hücrenin dendritik alanında hemen hemen tüm kozalakları onun çevresel dendritler ile sinaps kurmak olduğunu gösterir. Yatay dilim hazırlık nedenle de seçilmiş sinaps boyunca genişletilmiş retinal nöronların fizyolojik özelliklerini yanı sıra duyusal sinyal aktarımını ve entegrasyonu incelemek için uygundur.
Giriş
Görsel bilgi fotoreseptör aktivasyon dinamik bir uzay-zamansal desen olarak kodlanmıştır, ve fotoreseptör ve ikinci dereceden nöronlar arasındaki şerit sinaps görsel bilgilerin aşağı transferini belirler. Memeli retina dikey dilim hazırlama yani fotoreseptör ve bipolar hücreler arasında, ve bipolar hücre ve amacrine hücre, 1, 2, 3, 4, bazı tipleri arasında dikey yollardaki sinyal işleme incelemek için çok değerli bir araçtır.
Bununla birlikte, yatay kesit her sinaptik temasların ölçüde kaybına yol açan bir çok retina nöronlarının dendritik alanlarının ciddi kesme neden olur. Özellikle dış retina, yatay hücreler nedeniyle yanal yayılan genişletilmiş dendritik alanları ve akson terminali sistemlerine 5 etkilenir. dikey olarakDilim Hazırlık, yatay bir hücrenin dentritlere konik fotoreseptör terminalleri yüzlerce sinaptik girişi böylece bir kaç seyrek temas düşürülür. Bu bireysel sinaps özelliklerini incelemek için yeterli olabilir, ancak hiçbir şekilde fotoreseptör şerit sinaps senkronize aktivasyonu altında yatan sinyal işleme yetenekleri temsil tarafından öyle.
Bu nedenle sağlam ve fonksiyonel yatay hücre dendritler hemen hemen tüm koni fotoreseptör sinaptik girdi bırakır yatay dilim hazırlık geliştirdi. Kesit çalışır düzlemi ideal yatay hücreleri ve amacrine hücreleri arasındaki iç nükleer tabaka ile kesme, retina yüzeyine paraleldir. Bu nedenle dış retina yatay dilim içeren oluşturulur, presinaptik sahada, postsinaptik sahada, iç ve dış bölümlerin yanı sıra sinaptik terminallerinden ve yatay hücrelerin ve bipolar hücrelerle fotoreseptörler. Bu preparat, ayrıca t uygunduro kendi dendritik alanında tüm koni fotoreseptör yatay hücre dendritler içine koordineli sinaptik girişleri araştırmak. Böylece daha iyi bir postsinaptik tepki içine fotoreseptör aktivasyon matris görsel bilgi aktarımı için çok önemlidir fotoreseptör şerit sinaps, işleyişini anlamak yararlı olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm işlemler Federal Almanya Cumhuriyeti tarafından verilen hayvan deneyleri için kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.
NOT: retinal doku bu prosedürün uzun aşamalarında oksijen yoksun olacağı için, tüm adımları olabildiğince hızlı yapılmalıdır. Fareler koyu adapte diseksiyon önce en az 3 saat olmalıdır. Retina, hazırlama adaptasyona önlemek ve dilimleme sönük kızıl ışık altında gerçekleştirilmelidir.
Medya ve Diğer Kimyasallar 1. Hazırlık
- Ames Orta 6 hazırlayın. Diseksiyon sonra, her zaman Ames 'Orta retina dokusu batırmayın.
- Ames Ortama 2.2 g ve damıtılmış su, 250 ml 298 mg HEPES içinde çözülür. HEPES konsantrasyonu 5 mM olacaktır. Tüm parçacıkların çözünene kadar hafifçe karıştırın.
- karbojen, oda sıcaklığında kabarcık Ames Orta (% 95 oksijen,% 5 araçen az 5 dakika boyunca bon dioksit). çözümün bir cam Pasteur pipeti ile Tedarik carbogen. Gaz regülatör çıkışına uygun boru aracılığıyla Pasteur pipeti bağlayın.
- çözeltiye 475 mg sodyum-bikarbonat ekleyin. köpüren sonra bikarbonat eklenmesi kalsiyum karbonat çökmesini önler.
- Düşük jelleşme sıcaklığı agaroz hazırlayın. Agaroz vibratome kesit sırasında retina dokusunun gömmek için gereklidir.
- 9 mi Ames Ortamda 180 mg agaroz ve damıtılmış su, 1 ml içinde çözülür. tüm katılar çözülene kadar yavaşça agaroz çözeltisi ısıtmak için bir mikrodalga kullanarak. 5 Isı - 10 sn aralıklarla taşmasını önlemek için. Çözelti berrak ve saydam olmalıdır.
- Mağaza prosedür süresince 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde agaroz eritilir.
2. Vibratome kurma
Not: tüm kesit ile gerçekleştirilmiştirVibratome Malzeme tabloda listelenmiştir. Verilen ayarlar yalnızca vibratome bu tür bakın. Nöral doku vibratome kesit ilgili daha fazla ayrıntı için 7 başvurmak bakınız.
- bıçak tutucu içine vibratome enjektör bıçağı yerleştirin.
- "Vibrocheck" cihazı ile bıçak dikey sapmayı ölçün. o kesim düzlemine paralel olana kadar bıçak yatırmak için bıçak tutucu ayar vidasını kullanın. bıçağın gerçek konumlama bölümü yüzeyi üzerinde jaluzi etkilerini önlemek için ve yüzeyi üzerinde yaşayan hücreleri içeren düz bölümü üretilmesi için gereklidir.
- Aşağıdaki ayarlara vibratome ayarlayın: genlik, 1.00; hız, 0.20; kalınlık, 180-200 um.
Fare Retina 3. Diseksiyon
- hava geçirmez bir kapta yaklaşık 1 ml izofluran buharlaşma yoluyla yetişkin C57BL / 6 fare uyuşturan. Anestezi işlemi tamamlandığında, servikal dislokasyon ile hayvan euthanize.Fare, aksi takdirde dilim kalitesi bozulacaktır, daha eski 3 ay olmamalıdır.
- göz altında kavisli bir forseps koyarak göz topu çıkarın. Yavaşça optik sinir gösterecektir göz topu yukarı kaldırarak. Bir bahar makas ile optik siniri kesip ve 2 ml Ames Orta içeren 35 mm petri göz topu aktarın.
- Stereo mikroskop sahnede tüm sonraki adımları uygulayın. Aşağıdaki prosedürler (- 3.9 3.4 adım) için en uygun görsel kontrol sağlayan bir değere büyütme ayarlayın.
- sivri forseps ile sklera veya 20 G iğne geçiş de kornea delinme. Bu adım sırasında, başka bir forseps ile göz topu sabitleyin. delme cihazı ile retinaya zarar vermemek için dikkatli olun.
- Adım 3.3 yapılan küçük deliğe yaylı makas yerleştirin ve korneanın etrafında bir daire kesip. keserken Yine, forseps ile göz topu sabitleyin. c amacıyla yüzeye çok yakın değil kesi tutunretina içine ut.
- Dikkatle forseps ile kornea, lens, vitreus cismin çıkarılması. vitreus gözün arka kısmına sadece ince şeffaf bir tabaka ihtiva eder. Bununla birlikte, camsı cisim tamamen kaldırılır kesit vibratome için gereklidir.
- Petri kabı, bir aşağı retina üzerine delik bakar bir şekilde göz yuvasını yerleştirin. açıklığın jantının skleral doku, sadece oluşmalıdır. Dairesel kesim (adım 3.4) Göz yuvası ekvatora çok yakın yapılmış ise, retina dokusu da kesi mevcut yakın olacaktır. Adım 3.8 retinayı zarar vermemeye sonra dikkatli olun.
- forseps ile sklerasına tut ve dikkatli bir şekilde birbirinden doku gözyaşı. Aşama sırasında retina yırtılmasına değil esastır. Gerekirse, forseps ile doku skleral kısmını steadying ve özenle diğer forseps ile retina soyularak ora serrata retina ayırın. forseps kapalı tutun; yeniden ele asladokuya beri forseps ile tina çok yumuşak ve yolu hemen verecektir.
NOT: Bu aşamada, retina ve Göz yuvası geri kalanı sadece optik sinir başında bağlanacaktır. - yaylı makas ile optik sinir başında eki sitesini kesin. Retina artık serbestçe Ames Ortama doku tek parça olarak kayan olmalıdır.
- pozisyon içine işlemek için, forseps ile kenarları boyunca retina tutarak kavisli bir neşter bıçak kullanarak yaklaşık 23 mm 6 küçük dikdörtgenler - 4 içine retina kesti. dikdörtgenler içinde retina dokusunun sıkışmaması. retina, çok uzak olmayan çevre orta kesimlerinde parçalara ayırın.
- 35 mm plastik petri büyük çaplı plastik bir Pasteur pipeti ile Retinal parçalar, transfer alt olan 1 mm den daha az ızgara boyutu olan bir gözlü yapı ile ikame edilmiştir. Bir bardak ya da Erlenin üst üçte içinde Petri kabı düzeltmek ve Ames Orta met retina parçaları daldırınkarbojen bbled.
Agaroz Retina Adet 4. gömülmesi
- Ames Orta bazı ile birlikte 35 mm plastik Petri kabı içine 3 retina adet - dikkatle 2 transfer. Transfer için büyük çaplı plastik Pasteur pipet kullanın en uygundur. Bu adımda, Retinal parçalar tam yönelimi önemli değildir.
- Bir cam Pasteur pipeti kalan Ames Orta mümkün olduğu kadar çıkarın. En kısa sürede sıvı kaldırıldı olarak adım 4.3 ile devam edin. retinal doku kuru izin vermeyin.
- Hemen agaroz eritilir, 2 ml (37 ° C) Retinal parçalar içermektedir. Adım 3.10 belirtilen büyüklüğü göz önüne alındığında, parçalar agaroz içinde kıvrılıp olmayacaktır.
- Sıvı agaroz içinde yavaşça petri alt retina parçaları itin. Ganglion hücre tabakası aşağı dönük olmalıdır. Tam konumun yargı için bir stereo mikroskop kullanın. Konumlandırma için, retina pi koluKüçük bir spatula ile eces. Agaroz hızla katılaşır çünkü mümkün olduğunca hızlı ve hassas retina yerleştirin.
- Retinal parçalar, cam çanak tabanına paralel düzenlemek; Aksi takdirde bölümler teğet veya eğik olacaktır. Bireysel parçalar birbirine temas etmemelidir, ama aynı zamanda çok uzak olmamalı. Aynı yatay seviyede retina adet veya daha az yer çalışın.
- en az 2 dakika süreyle - (6 ° C 4) buzdolabı içine gömülü retina adet cam petri koyun. Bu hızla daha sonraki işlemler için agaroz donacaktır. En kısa sürede agaroz polimerize olduğu gibi bir sonraki adıma geçin.
Retina Adet 5. montajı
- Dikkatle petri retina parçaları içeren agaroz bloğu kaldırmak. camdan agaroz blok kaldırmak için bir spatula veya benzeri bir cihazı kullanın. Nedeniyle yapışkan kuvvetleri, bu oldukça zor olduğu ortaya açabilirsiniz. Ancak, kırılma önlemekagaroz blok. Oda sıcaklığında bu ve sonraki tüm adımları uygulayın.
- Bir cam lamel üzerinde agaroz blok yerleştirin ve bir neşter bıçağı ile boyutunu ayarlayın. Retinal parçalar, her bir yanı üzerinde agaroz 2 mm - 1 bırakın. bloğun son boyutu yaklaşık 1.066 mm olmalıdır (10 mm'lik bir blok olarak, kenar uzunluğu 6 mm yüksekliğine karşılık gelir).
- bir anlık yapıştırıcı kullanarak vibratome numune tutucu agaroz blok Tutkal. alt tutucu yapıştırılmıştır ise Retinal parçalar, yüzeyi 10 mm yüksekliğinde bloğun üst ve yönlendirilmiş paralel yer almalıdır.
- vibratome tampon tepsisine önce kabarmış Ames 'Orta dökerek hemen bloğu örtün.
Yatay Vibratome Bölüm 6. hazırlanması
- kesit başlayın. retina dokusunun parçaları dilim görünür kadar ilk başta, elle dilimleme kalınlığı ayarlayın. Sonra adım 2.3 ayarlara değiştirin. BeriAgaroz blok başına 3 dilim - fare retina en fazla 2 olacak, sadece yaklaşık 200 mikron kalınlığındadır.
- bir cam çubuk ile tampon tepsisinden bölümleri çıkarın ve 35 mm petri 2 ml Ames Orta aktarabilirsiniz.
- Hemen 37 ° C (% 5 CO 2/55% O 2) bir kuluçka makinesi içinde deposu bölümleri. bölümleri çevreleyen agaroz inkübatör katı kalacak ve retina zarar vermeden bölümleri işlemek için kullanılabilir. Oda sıcaklığında oksijenli Ames 'Orta kıyasla ilgili bir atmosfer içinde 37 ° C'de muhafaza ederken daha dilim kalitesi elde edilir. Bölümler hemen kullanılabilir ya da iyi fizyolojik sonuçlar inkübatör 4 saat kadar saklanabilir.
- 6 - agaroz ve tekrar Bölüm 4 sonraki retina parçaları göm.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Fare retina yatay dilim, yatay hücre gövdeleri kolayca çokgen hücre gövdesi (Şekil 1A) çıkan çok sayıda primer dendritler ile eşsiz bir morfolojiye göre tespit edilebilir. dilim yüzeyine yakın yatay hücre gövdeleri patch-kelepçe elektrotlar için rutin erişilebilir. Kayıtları sırasında, hücreler yakın sağlam fare retina 8 (Şekil 1B) akson taşıyan yatay hücrelerin morfolojisi andıran Komplike dendritik arborization, ifşa, bir ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Dikey dilimleri tersine, yatay bir hücre ve amacrine hücreleri gibi radyal olarak yönlendirilmiş nöronların dendritik morfolojisi iyi korunmuştur. Bütün retina hazırlıkları ile karşılaştırıldığında, bu hücre tipleri Mikroelektronlar için kolayca erişilebilir ve her ikisi de elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri ile ele alınabilir. Burada, dış retina üzerinde duruldu; Bununla birlikte, benzer bir yaklaşım, özellikle iç retina 10 amacrine hücreler için rapor edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 ve FE464/11-1 tarafından A.F. tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Andrea Nerz'in mükemmel teknik yardımına teşekkür etmek istiyor.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodyum Bikarbonat | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Karbojen | Hava Sıvısı, | ||
| Agaroz | Sigma | A9045 | |
| 35 mm Petri kabı (plastik), | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Cam Petri çanak | Kemolin | 50-1470-40 | |
| İzofluran | Dispanser üniversite hastanesi | ||
| Vibratom enjektör bıçağı | Biyosistemler | 39053250 | |
| Vibratom | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Mikrodalga | |||
| Su banyosu | |||
| Forseps | |||
| 20 G iğneler | |||
| Yaylı makas | |||
| Kavisli neşter bıçakları | |||
| Stereo mikroskop | |||
| Plastik Pastör pipeti | |||
| Cam Pastör pipeti |
Kaynaklar
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , Plenum Press. New York. (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108(2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
