Yöntem makalesi

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

DOI:

10.3791/55177

⸱

27 Mart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı hücre görüntüleme aynı anda anjiotensin II (Ang II) ile uyarılmasını takiben transfekte insan embriyonik böbrek-293 (HEK) hücreleri anjiotensin tip 1a (1a R AT) reseptörleri ve hücre içi bölmelerin zaman atlamalı görüntü yakalamak için kullanılır. HEK hücreleri geçici plazmid DNA gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş 1a R AT içeren transfekte edilir. Lizozomlar kırmızı floresan boya ile tanımlanır. Canlı hücre görüntüleri Ang II uyarıldıktan sonra bir lazer tarama konfokal mikroskop yakalanan ve zamanla üç boyutlu (3D, vokseller) yazılım tarafından analiz edilir. Canlı hücre görüntüleme reseptör kaçakçılığı soruşturma sağlar ve tespit ile ilişkili boşa önler ve özellikle, EGFP etiketli membran reseptörlerinin kaybı veya artefactual deplasman. tek tek hücreler bir süre ile izlenir Böylece, reseptörlerin hücre içi lokalizasyonu görüntülenmiş ve ölçülebilir. Görüntüler sufficientl edinilmesi gerekiry hızla hızlı vezikül hareketini yakalamak için. Bununla birlikte, hızlı bir görüntüleme hızlarda toplandı, fotonların sayısı azalır. Uzlaşmalar da görüntüleme hız kazanmak amacıyla voksel boyutu gibi görüntüleme parametrelerinin seçimi yapılmalıdır. canlı hücre görüntüleme önemli uygulamaları ama bir kaç isim protein kaçakçılığı, göç, çoğalmasını, hücre döngüsü, apoptoz, otofaji ve protein-protein etkileşimleri ve dinamiklerini incelemek için vardır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

genel amacı, reseptör agonisti ile muamele edildikten sonra zaman ve belirli bir alt-hücresel organel reseptör ko alan sayısal kanıtı elde etmektir. Bu nedenle, burada acil hedefi zaman atlamalı konfokal lizozomlar görüntülerini ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde reseptör (HEK) elde edildi reseptörün yayınlamak için 3 boyutlu görüntüleme verileri transfeksiyonu takiben ve daha sonra bir araya getirmek ve analiz kapsayan bir transmembran yakalamak için lizozomlar. transmembran reseptör fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda nasıl düzenlendiği belirlemenize yardımcı olabilir reseptör ligandı tarafından aktive edildiğinde endositoz sırasında lizozomlar veya diğer organellerin yaptığı bir transmembran reseptör eşzamanlı kaçakçılığının soruşturulmasına.

1a R esas olarak HEK293 1 REC çoğunluğu, ancak örnek hücre sistemleri Ang II ile tedavi sonrası lizozomlar bozunabilen varsayılırligand Ang II kütle lizozom 2, 3, 4, 5 bozulmuş ise eptors özellikle plazma membran daha sonra geri dönüşüm için multiveziküler geri kazanım endozomlarda lokalizedir. Daha yakın zamanda, Li ve diğ. Förster rezonans enerji transferi (FRET) ve floresan süresi görüntüleme mikroskobu (FLIM) teknikleri kullanılarak ortaya AT 1a R colocalizes LAMP1 ile (~ 10 nM ölçekte) reseptörünün en azından bir kısmı için hedeflenen ve düşer düşündüren bir lizozomal membran proteini lizozomlarında 6 ile. Bu yazarlar lizozomal inhibitörü klorokin klorokin bir etkisi lizozomlarında ile geç endosomes veya autophagosomes füzyon engellemek için olduğunu düşündüren önceki raporlar ile uyumludur 1a R-LAMP1 dernek AT bloke ettiğini kaydetti. Diğer dolaylı yaklaşımlar 1a R l AT belirlemek içinlizozomlarda ocalization, lizozomlarda 3, 4, 5, 6, 7, 8 1a R varlığına anlaması için bir lızozomal inhibitörü bafilomisin kullanmışlardır.

Canlı hücre görüntüleme hücre hacmi ve GFP kimerik reseptörün kaybı / karartma / yeniden dağılımı üzerindeki tespitin potansiyel etkilerini önler. Önceki çalışmalar, ko veya lizozomlar veya reseptör bağlayıcı suretlerle ile etiketlenmiş, canlı hücreleri kullanılarak reseptörün eş oluşumunu belirlemek için, sabit hücre bel bağlar β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. dönen disk konfokal veya lazer noktası tarama conf kullanan diğer GPCRs Canlı hücre görüntülemeGaasp veya HYD dedektörleri ile donatılmış Öçal mikroskoplar 30 s aralıklarla 9, 10, z-yığınlarının görüntülü bireysel hücrelerin reseptör içselleştirilmesi ve ticaretini gözlemlemek için araştırmacılar sağladı. Canlı hücre z-yığınları hızla toplanır Ancak bile, analiz sadece 2D 10 yani her yığının içinde tek bir düzlemde seçimden sonra ortaya çıkabilir. Bu soru içselleştirilmiş GPCR veya tirozin kinaz reseptörü çalışmak için yeterli olabilir, AT 1a Rs zamanla boyutunu ve konumunu değiştirmek ve böylece doğal yeterli her zaman bir noktada temsili tek dilim kullanarak örnek daha zor kesecikler birikir. Iyice hücre yoluyla ve boyut ve konumda farklı veziküller her ICSI'nin tespit etmek 1a R AT etiketli rota belirlemek için, 3D görüntüleme ve 3D analizi için bir yöntem bu değişiklikleri izlemek ve olmaya taktığı Bu lizozomlar gibi çeşitli hücre içi bölmelerin etiketleme ile birlikte kullanılır.

Müfettişler doğrudan hücre ve Ang II uyarımı aşağıdaki hücre içi bölmelere onun transferi içine AT 1a R hareketini görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme için bu protokolü kullanabilirsiniz. Hücre içi bölmeleri floresan protein kuruntulardan ya da diğer floresan işaretleri ile etiketlenir. Bu protokol, aynı zamanda, vahşi tip reseptörlere karşı mutasyona karşılaştırma ya da farmakolojik tedavi aşağıdaki değişiklikleri tespit etmek için, 200 nm'lik bir çözünürlüğü en az sub-hücresel organellerde reseptörleri lokalize bir ilk yaklaşım olarak kullanılabilir. Bu canlı hücre görüntüleme için donatılmış bir konfokal mikroskop gerçekleştirilebilir çünkü tekniğin erişilebilir. Bu yaklaşımın göreli kolaylığı, artan uzmanlık ve moleküler etkileşimleri 6 tespit FRET / flim / BRET teknikleri yürütmek için gerekli ekipman ile çelişmektedir"xref"> 11. Bu ölçümler, yüksek çözünürlüklü (~ 10 nm) ve sub-hücresel organeller içerisinde lokalizasyonu anlaşılmaktadır protein-protein etkileşimlerini tanımlamaktadır. Bunlar daha ileri teknikler takip ve ileri moleküler ilgi etkileşimleri yerine hücre içi bölmeleri sayesinde reseptörlerin geçişini tanımlamak için kullanılır ve doğrudan hücreye 11 içinde belirli zamanlarda ve yerlerde protein-protein etkileşimleri göstermektedir. görüntü elde etme yavaş olduğu FLIM, alıcı konsantrasyonu bağımsız bir FRET tekniği, genellikle sabit bir numune üzerinde gerçekleştirilir. Buna karşılık, bu oran FRET hızlı görüntüleme ve etkileşim proteinlerin yüksek çözünürlüklü ko sağlar. Oran FRET dezavantajı görüntüleme widefield epi-floresan görüntüleme hız kazanmak ve düşük çözünürlükte ve organellerin 12 aksine sonuçlanan tüm hücre içerecek şekilde kullanmaktadır olduğunu. Biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret) başka bir şeydirzaman 11 üzerinde moleküler yakınlığı edinilmesini ölçmek için GPCRs uygulanmıştır ileri tekniği. Bu teknikte, bir protein florofor moleküler bölünür ve her yarım, söz konusu iki proteinin birine bağlandı. Ne zaman faiz bağlama iki protein birbirlerine, kimerik etiketinin parçaları floresan ve zamanla sayısal artan floresan elde etmek monte yeniden.

Burada, Ang II uyarımı ve Ang II uyarımı aşağıdaki lizozomlar için 1a R AT içselleştirilmiş teslim potansiyel değişim üzerine hücrede AT 1a R ticaretini incelemek için görüntü ölçümü ile birleştiğinde canlı hücre görüntüleme için basit bir teknik sunuyoruz. Bu teknik için nihai kullanımı yabani tip ve mutasyona uğramış reseptörleri karşılaştıran membran kaçakçılığı farklılıkları karakterize etmektir. Bu farklılıklar AT 1a R leadi fizyolojik faaliyetlerini mekanizmasını (ler) etkisini belirlemeye yardımcı olacaktırkan basıncının düzenlenmesi ng.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birinci gün

1. Hücre Yayımlama

  1. Tam Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) hazırlayın. fetal bovin serumu (% 10) ile desteklenmiş tam DMEM 500 ml yapmak için DMEM 450 mL fetal sığır serumu, 50 mL, penisilin / streptomisin, 5 ml L-glutamin 5 ml, penisilin / streptomisin (% 1) ve L-glutamin (% 1).
  2. Tohum insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri, geçit sayısı 6-11 / 50.000 de hiç tam DMEM içinde 8 iyi odacıklı coverglass sisteminde.
  3. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de odacıklı slayt koruyun.

gün İki

2. lipozom Transfeksiyon

  1. Taze bir biyogüvenlik düzeyi 2 kabinli steril koşullar kullanılarak 1a R-GFP plazmid ve lipozom çözümleri AT olun.
  2. Bir konsantreler elde etmek için düşük serum ortamında 178 uL 900 ng plazmid DNA, 2 ul seyreltik / ml stok çözeltisi,yaklaşık olarak 10 ng / uL plasmid DNA iyonu.
  3. stokunun 01:40 seyreltme oluşturmak için azaltılmış serum medya 175.5 uL lipozom stok solüsyonu 4.5 mcL sulandırmak.
  4. plazmid çözüm lipozom çözüm ekleyin ve transfeksiyon çözüm karıştırmak için aşağı 20 kere yukarı pipet ve 1 ml pipet kullanarak karıştırın.
  5. Oda sıcaklığına (25-27 ° C) 30 dakika süreyle inkübe karışımı.
  6. Bu karışımın, birlikte, bir 1 ml pipet ile yavaş yavaş ortamını çıkarın ve yavaşça 400 mcL 37 ° C'ye önceden ısıtılmış olan 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ilave edin.
  7. Yavaşça PBS çıkarın ve 200 uL / ​​oyuk, düşük serum ortamı 37 ° C'ye kadar ön-ısıtılmış ile değiştirin.
    NOT: nedeniyle pipetleme tarafından uyarılan katıksız strese lamel Hücrelerin dekolmanı önlemek için hücrelerin yıkarken tüm adımlarda dikkatli olun.
  8. 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de hücreler koruyun.
  9. Bir kereKuluçka süresi her bir transfeksiyon karışımı 80 ul ekleyin ve inkübe hücreleri 4.0-4.5 saat için değil,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de en fazla 5, H, üzerindedir.
  10. Transfeksiyon Kuluçka süresi tamamlandıktan sonra, yavaş yavaş, 1 mL pipet kullanılarak odalarından ortamını çıkarın ve yavaşça% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 24 saat boyunca hücrelerin tam DMEM 300 uL / ile değiştirin ve inkübe .

Üçüncü gün

3. serum açlığı

  1. yavaşça 1 ml pipet kullanarak Ortamı çıkarın ve yavaş fenol kırmızısı olmadan serum içermeyen DMEM 300 uL ile değiştirin.
  2. 10-12 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de bölme koruyun.

gün Dört

4. Canlı Hücre Görüntüleme

  1. Leke hücre içi bölmeler (bu durumda lizozomlar).
    1. Abonihai boya konsantrasyonu için her bir oyuğa ut 30 dakika, hücrelerde lizozomlar görüntüleme 1 uM floresan boya stok çözeltiden 22.5 uL ilave önce (fenol kırmızısı olmadan serum içermeyen DMEM 499,5 ul seyreltilmiş 0.5 uL 1 mM flüoresan boya) 75 nM.
    2. % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C sıcaklıkta 25-30 dakika boyunca inkübe edilir ve akabinde yavaşça boya kaldırmak yavaşça fenol kırmızısı olmadan taze serumsuz DMEM 300 uL ekleyin.
  2. Görüntüleme için mikroskop hazırlayın.
    1. otomatik mikroskop başlatma sırasında lensin zarar görmesini önlemek için sahne aşağı ayarlayın.
    2. mikroskop gücü, tarayıcı gücü, lazer gücü ve daha sonra lazer emisyonu açın ve son olarak görsel gözlem için metal halide lamba (konfokal mikroskop üreticisi talimatlarına bakınız).
    3. görüntüleme yazılımı programını açın ve argon (488 nm) lazer ve güç up yazılım sırayla% 30-50 kadar. Güç bağlıdır NotLazerin yaşı. deneyler içinde sabit ayarları korumak için çok önemlidir.
    4. Kırmızı-yayan lazer açın (örneğin 568 nm veya 594 nm).
    5. 12-bit derinliğine ayarlayın görüntüleme biçimi.
    6. argon lazer çizgisi 488 nm ve 1 Airy diski birimine 568 nm veya 594 nm lazer için iğne deliği ayarlayın. GFP çok zayıfsa, 2 Airy diski birimleri ayarını kullanın, ancak uygun kanalları maç.
    7. dikroik filtre setleri kullanırken, GFP ve floresan boya için uygun emisyon dalga boylarını seçin. Kırmızı yayan floresan boya için 680 nm - Ya, 499-580 GFP için nm ve Em 599 emisyon dalga boyu (Em) ayarlayın.
    8. Bu yoluyla kanama ve geçit meydana gelmez edin. sırayla her lazer kapatın ve her biri için hem de emisyon kanalları kontrol edin. Argon lazer kapalı olduğunda, yeşil emisyon sıfır olmalıdır. Yeşil yayan lazer kapalı olduğunda, kırmızı emisyon kanalı sıfır olmalıdır.
      NOT: En güvenli yöntem ayrı parça olarak her (dizisine görüntü içinential).
    9. İstenirse bir aydınlık kanalı ekleyin. bu ko ölçümleri çarpık çünkü diferansiyel kontrast görüntüleme (DIC) kaçının.
    10. Canlı görüntüleme seçeneğini hat sıralı ziyade çerçeve sıralı için.
  3. Görüntüleme için hücreleri seçin.
    1. Böyle bir 63X / 1.4 NA petrol görüntü hücrelere hedefi (veya 40X / 1.4 NA) olarak, 1.4 Sayısal açıklık (NA) objektif yararlanın. hedefi ortalamak ve objektif üzerine yüksek viskozite, düşük otofloresans daldırma petrol bir damla ekleyin.
    2. mikroskop aşamasına inkübatör transfekte hücrelerle odası aktarın. Düz slaytlar tutmak ve oda iyi oturmuş ve hareketi ölçülü olduğundan emin olmak için dikkatli olun.
    3. petrol damla sadece slayt alt dokunana kadar objektif yukarı hareket ettirin; Sağ odak düzlemi bu pozisyona yakındır. Otomatik mikroskoplar, bu pozisyonu yanı sıra ayni kullanmak için indirdi konumunu kaydetmekgörüntüleme deney ainder örnekleri değiştirilmesinin kolaylaştırılması gayesi.
    4. loş hücreleri seçin. 1a R-GFP AT aşın ifade eden hücreleri hücrede reseptörün yanlış yönlendirmek ve normal işlevini bozabilir olacaktır.
    5. plazma zarı tarafından tanımlanan hücre hatları, görünür ve tercihen de diğer hücreler ile üst üste olmadığını kontrol edin.
    6. Odak ve görüş alanında hücreyi merkezi.
    7. konfokal moduna geçin.
    8. Bir hızlı görüntüleme modu seçin. bir odak kontrolü el ve sahne XY kontrolü diğer, odaklanma ve monitörde görsel faiz hücre merkezi.
    9. hücre yoluyla aşağı yukarı odaklanarak tarafından ilgi hücre de yayılır ve onun alt veya ventral yüzü lamel ile yakından bitişik olduğunu doğrulayın.
  4. Görüntüye z aşamalı parametrelerini 3D hücre ayarlayın.
    1. Z-yığını üst ve alt iletişim (veya eşdeğeri) için Açık düğmesini seçin ve c alt odakell sonra "başlamak" tuşuna basın. Sonra, hücre ve basın üstüne odaklanmak "sonunda." Tüm hücre z yığın dahil olduğunu yeniden kontrol edin.
    2. 1.0 mikron Z-adım boyutunu ayarlamak.
  5. Set görüntüleme ayarları.
    1. son piksel boyutu x 0.279 mm 0.14 mikron XY boyut x 0.14 mm yaklaşık 0.279 mikron olacak şekilde, objektif bağlı Zoom 2 seçin.
    2. Bu deneyde HEK hücreleri için, hücrelerin parlaklığına bağlı olarak, voksel başına yaklaşık 1 ms tarama hızını ayarlamak ve 2 ortalamasını veya çizgi ile 2 birikimleri seçin.
    3. Lazer yoğunluğunu ayarlayın ve GFP ve floresan boya görüntüleme için kazanç. Genel olarak, counterstains nedenle Photomultiplier dedektörü (PMT) ve GASP ve HYD dedektörleri GFP kanal için gerekli olan ise değil galyum arsenit fosfür (Gaasp) ya da Hibrid dedektörler (HYD) bu ikinci renk kanalı için kullanılmalıdır çok daha parlak olacak ve. HYD veya Gaasp tespit edersenizors dikkatli gösterirler ve son derece düşük bir güçte lazer ile başlar, floresan boya kullanılır.
    4. Tarama ve tarama sıklığı Set süresi, örneğin, her 30-60 s 25 dakika boyunca veya daha uzun lizozomlar AT 1a R-GFP hedefleyen görmek için.
    5. zamanla odak düzlemi istikrarı korumak için otofokus ayarlayın.
  6. Görüntüleme deney başlar.
    1. 5 ug / uL (4,7793 mM) önceden 100x Ang II stok hazırlayın ve 998 uL ortamı (10 uM) bu 2.1 mcL ekleyin.
    2. hemen önce görüntüleme (nihai konsantrasyon 100 nM) için de ihtiva eden 300 uL ligand (Ang II) 'in bir 100x stok çözeltisi 3 uL eklenmesiyle ligand uyarımı başlayın.
    3. İstenilen zaman ve frekans için 3D başlangıç ​​ve görüntüyü tıklatın.
    4. mikroskop çalışmaya bitirmeden önce, analiz sırasında arka plan çıkarma daha sonra kullanılmak üzere bir z-yığını toplamak. foton sayma modunda, bu değilArka plan olduğundan gerekli esas 0. aydınlatma ile açık ve tüm diğer görüntüleme koşulları aynıdır, ancak örnek ile örnek bir resim çekmek. Analiz edilen Arkaplan Çıkarma (aşağıda) bakınız.

gün Beş

5. Görüntü Analizi

  1. Tiff formatında ihracat görüntüler.
    1. Sağ menüleri görmek ve Ver'i seçin veya Dosya tıklatın görüntü dosyası adını tıklayın | ihracat | ithalat.
    2. RAW, 12-bit veri [değil 'Kırmızı Mavi Yeşil' yayın kalitesinde görüntüler için kullanılan (RGB) dönüşüm] ihracat emin sonraki analizler için tiff ihracat. jpeg formatında ihraç etmeyin.
    3. X, Y, Z, voksel boyutları ve görüntü analizi sırasında daha sonra kullanmak için Z-adım yüksekliği dikkat edin. Örneğin, bir 40X / 1.4 kullanarak. NA objektif lens bu değerler x 0.138 mm 1 mikron z-adım boyutu (temsilcisi sonuçları bölümündeki verileri görmek) 0.138 mikron olabilir.
  2. analiz için görüntü yığını oluşturun.
    1. Görüntü Aç kantitasyonu yazılımı (Şekil 2)
    2. İthal tek dizilerin (Şekil 2, ok # 1) tek bir dosya görüntü oluşturmak için "Seçilen Sıra Görüntüler | | Yeni Yarat Eylem" kullanın.
    3. kanal sayısı, Z-bölümlerin sayısı ve zaman noktalarının sayısını girin.
    4. Görüntü düzlemleri sırasına örneğin, select * .tiff dosyalarının, yapısına bağlı olarak, kanallar, z-düzlemi ve zaman puan. Son görüntü yığını doğru orijinal görüntünün renk kanalları, z-yığını ve zaman noktalarını temsil ettiğini kontrol edin.
    5. Görüntü adını seçin (Şekil 2, solda dosya adını vurgulanan ok # 2). Sağ görüntü ve / veya görüntü alanına tıklayın ve listenin alt tarafındaki seçenekler arasından "Özellikler" i seçin. (X) (Y) ve (Z) boyutu için mikron piksel, doğru görüntü özellikleri yukarıda belirtildiği girin.
  3. Önce görüntü analizi için çıkarma arka plan. Arka plan düzeltmesi herhangi bir görüntü analiz yazılımı gerçekleştirilebilir. İki seçenekten birini kullanarak çıkarma arka plan.
    1. 1. Seçenek: Select "Eylem | Yeni Oluştur | Arka Plan Çıkarma" (Şekil 2, ok # 1). "| Background çıkarma Araçlar" altında "Karanlık Referans" Görüntü olarak yukarıda açıklanan görüntüleme oturumun sonunda elde edilen kazanılmış arka plan görüntüsü kullanın.
    2. 2. Seçenek: hiçbir örnek yoktur görüntüler koyu alanlarını inceleyin sahte fluorofor, rastgele parlak piksel veya başka bir fenomen olabilecek herhangi bir olağanüstü parlak piksel görmezden, o bölgedeki piksellerin ortalama veya maksimum parlaklık bulmak. Seç "Eylemler | Arka Plan Çıkarma | Yeni Oluştur". Ofset olarak (negatif yapılan) bu piksel parlaklığı kullanın.
  4. Renk Kayıt için kontrol edin ve gerekirse düzeltin.
    1. gibi GFP içeren veziküller ve floresan boya (Şekil 3) kırmızı veya yeşil renk kanalını kapatmak ve ya geçerek düzeltme ihtiyacını değerlendirmek kolokalize görüntülü mikro boncuklar, ya da, bir pozitif kontrol kullanma. Kayıt bile 1 piksel kapalıysa Görme, bu gözle açıktır.
    2. Seçerek kayıt düzeltme oluşturmak "Eylemler | Yeni Oluştur | Kayıt Düzeltme" (Şekil 2, ok # 1) ve ayarlamalar yapmak için iletişim kutusunu kullanın. Tamamlandığında yeni bir klasör öğesi "Kayıt Düzeltme" başlıklı görünür.
    3. (Eylemler bitişik Aracı düğmesini) | resim adını tıklayarak ilgi resimlerden biri veya daha fazlası için kayıt uygulayın (Şekil 2, solda dosya adını vurgulanan 2. ok) ve daha sonra seçerek "Doğru Kayıt Araçlar".
  5. Aşağıdaki 1a R-GFP vezikül ve tüm hücre yoğunluğuna AT analiz ölçüm sırası oluşturunAng II ile tedavi.
    1. Bir görüntü seçin (Şekil 2, solda dosya adını vurgulanan 2. ok) serbest bölge aracını (Şekil 2, 3 ok #) kullanarak tek bir hücrenin etrafında faiz (ROI) ve çizin bir bölge. (2D üst soldaki açılır menüsünden) Genişletilmiş Odak modunu kullanın kırpma aracı sadece 2B görselleştirme çalışır hücreyi gözlemlemek.
    2. Resmi sağ tıklayın ve "Seçimi Kırp" seçin ve yeni bir resim öğesi oluşturulur.
    3. Onun adının üzerine tıklayarak kırpılan hücreyi seçin ve sonra yukarıdaki "Ölçme" sekmesini seçin (Şekil 2, # ok 4).
    4. Tanımlamak ve GFP için içselleştirilmiş veziküller ölçmek, sürükle "bulma" dizisi kutusu içine (Şekil 2, ok # 5) (Şekil 2, 6 ok #) kapsamında "Nesneler bul" için.
    5. GFP kanala Kanal "Nesneler bul" olarak ayarlayın.
    6. Açık ayarları (iletişim kutusunda tekerlek simgesi, ok # 6) ve set4; kullanarak Eşik: "SD ve" 0 um 3 Minimum nesne boyutu "" 6. Set "alt limit.
      NOT: SD alt limiti bireysel deneyler bağlıdır. Doğru nesneler farklı zaman noktaları (Şekil 2, 7 ok #) incelenerek eşiklenir yapılan görsel onay. "Ölçüm | Geri Bildirim Seçenekler" iletişim kutusu (Şekil 2 ok # 8) eşiklenir nesneler görüntülenmiştir seçilen yolu seçmek için kullanılır.
    7. "Nesneleri Bul" iletişim kutusunda "Tedbir" tıklayın (Şekil 2 ok # 6) ve ölçüm kanalları ve türünü seçin. Tipik olarak, "Bütün kanallar" ve "Şiddet ve Hacim Ölçümleri" seçeneğini seçin.
    8. 2 μ SD 0 ve "Minimum Nesne boyutu": Aşağıdaki parametreleri kullanarak - adımlarla (5.5.8 5.5.4) Yukarıdaki tekrarlayın, tüm hücre tespiti için eşikleme ve filtreler tanımlamak için ve toplam GFP yoğunluğunu ölçmek içinikinci "Nesneleri Bul" iletişim kutusunda m 3 (9 ok # Şekil 2) GFP kullanarak hücreleri tanımlamak için
    9. Nüfusun 2 altında dizi kutusuna "Filtreleme" altında Drag "Filtre Nüfus" (ikinci "Nesneler bul" kutusu, Şekil 2, ok # 9). Seç "Hacim (um> 100 3).
    10. Görme yalnızca bir nesne tespit olduğundan emin olun. Tüm hücre eşiklendi edilmeli ve tüm diğer nesneler uzakta süzülür. Hücre, örneğin, küçük ise "Filtre" parametresi (ler) ayarlanması gerekebilir.
    11. Ölçüm standardize edildikten sonra, ( "Protokolü Restore") tıklayarak görüntüyü sağ tarafından protokolü kaydetmek ve yeniden amacıyla "Kaydet Protokolü" seçeneğini seçin. protokol de görüntü olarak aynı alt dizininde bir rekor sağlamak için ihraç edilebilir.
    12. Seçerek "Ölçüm Yap" devam edin "Ölçümler | Ölçüm Item" (Şekil 2 , tıklayarak görüntüyü # 8) veya sağ ok ve "Ölçüm yap" ve "Tüm zaman noktalarında" seçeneğini seçin.
    13. Doğru ölçüm adını girin (görüntüden yapıştırmak kopyalamak uygun) ve analiz kodu veya tarih (kayıt tutma için yararlı bir ek) ve "Tüm zaman noktalarında" seçeneğini seçin. Yeni bir çalışma sayfası öğesi görüntü altında oluşturulur. özlü dosya adlarını tutun.
  6. Analiz ve veri ihracat.
    1. çalışma dosya adını tıklayın ve "Analiz" sekmesini seçin. Doymuş vokseller "için Analizi sınırla:" İlk seçerek tarafından mevcut olup olmadığını belirlemek Nüfus 2 (hücre) seçin.
    2. Sağ "Analiz sekmesi" altında "bu verileri analiz:" altında iletişim kutusunda alanı tıklatın "Max ([GFP renk kanalı])" seçeneğini seçin; "Tarafından özet:" altında "Mean ([GFP renk kanalı]" seçeneğini seçin ve altında "verileri Organize:" ve "Satır" "timepoint" ve cli seçinck "Tamam".
      NOT: Veri doymuş piksel (12-bit, 16-bit ya da 4.096 örneğin 65.536) içeriyorsa, analizi (o kese içeriği hafife olacak) doğru olmayacaktır. Analiz için bu hücre göz ardı. doymuş değilse, bir sonraki adıma geçin.
    3. Sonra, "Raw" sekmesi altında ve sonra "Analiz" sekmesine ve sağ tıklayarak veri bulmak "için Analizi sınırla:" altında daha sonra bütün hücre için veziküller veya Nüfus 2 Nüfus 1'i seçin.
    4. Altında "bu verileri analiz:" (GFP renk kanalı) "Sum" seçeneğini seçin; altında "tarafından özet:" "Sum" seçeneğini seçin; ve "Satır" "timepoint" seçeneğini ya da "Bağıl Time" ve ardından "Tamam" a tıklayın: ve altında "verileri Organize". Analiz seçimleri kaydedilir ve tekrar kullanılabilir.
    5. Seçip kopyala / boş e-tabloya görüntü kantitatif yazılımı doğrudan yapıştırın ya da dat sağ tıklayarak tablo verileri dışa.csv dosyası olarak bir kurtarış ve seçme. tüm hücre yoğunluğu ölçümü böylece tespit ve veziküller ayırmak için emin olun nüfusun her vezikül ölçümleri ile dahil edilecektir.
      NOT: veri komplo sonra, veziküller içinde bulunan toplam GFP floresan artış hızla yükselir. o olursa photobleaching, zamanla total hücre GFP yoğunluğu kaybı olarak algılanır.
  7. Lizozomlarında GFP hediye analiz ölçüm dizisi oluşturun.
    1. SD ve "alt limit" için: set bul Objects (Nüfus 1), kırmızı kanala ve tekerlek 6 (Şekil 2) set "Eşik kullanarak" ok # ile gösterilen bu iletişim kutusu içinde simgesi Kanal "Nesneler bul" 0,017 mikron 3 6. Seti "Asgari nesne boyutu".
      NOT: SD alt limiti bireysel deneyler bağlıdır. Doğru nesneler sınavı ile yapılmalıdır eşiklenir ediliyor görsel onayining farklı zaman noktalarında. "Ölçüm | Geri Bildirim Seçenekler" iletişim kutusu (Şekil 2 ok # 8) eşiklenir nesneler görüntülenmiştir seçilen yolu seçmek için kullanılır.
    2. Nesneler "Bul" in "Tedbir" Click "iletişim (Şekil 2 ok # 6) ve ölçüm kanalları ve türlerini seçin. Tipik olarak," Tüm kanallar "ve" Şiddet ve Hacim Ölçümleri "seçilir.
    3. Nüfus 2 için, o aynı kullanım ayarları 1a R-GFP (5.5.9) AT ifade bütün transfekte hücre belirtmek için kullanılır.
    4. (Flüoresan boya pozitif veziküller ile transfekte edilmemiş hücreler de dahil olmak üzere), çok hücreli varsa, analiz ilk aşamasında hücre kırpma önemlidir. Seçenek olarak ise, "bölümlere" kullanımı 1a R-GFP AT eksprese eden transfekte hücre içinde lizozomlar belirlenmesini sınırlamak için kullanılır. Lizozomlar sadece GFP hücre içinde tespit edilmeli vedeğil yakın, untransfected hücrelerden.
    5. Yukarıdaki gibi analiz ve ihracat verileri.
      Not: eşiklenir hücreleri ve veziküllerin bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deney Örnek setinde, HEK hücreleri pEGFP-N2 plazmit 13 klonlanmıştır (1a R-GFP AT) anjiyotensin tip 1a reseptör yapısı (E1,2,3-1A R) ile transfekte edildi. HEK Time-lapse görüntüleri elde ve bir film (Canlı Hücre Görüntüleme 1 ve Canlı Hücre Görüntüleme 2 film bakınız) olarak çalındı. Film ve fotoğraf ligand uyarılmasından sonra, 1a AT R-EGFPs plazma membranında lokalize olduğunu gösteriyor, fak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan ön deneyler 24 dakika gibi kısa bir sürede boyunca, lizozomlar AT 1a R-GFP teslim kayda değer bir değişiklik meydana geldiğini göstermektedir. Genel olarak, lızozomlara içselleştirilmiş reseptörlerin teslim gibi erken 15-20 dakika olarak meydana gelebilir. Bu deney 1a R AT içselleştirilmiş toplu büyük perinükleer endozomlardan hedeflenmektedir hipotezi ile tutarlıdır. R lizozomlarında geldiğinde 1a AT en azından bazı Li ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir dai...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda sunulan araştırma çalışmaları Kathryn Sandberg hibe R01 HL121456-01A1 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri P30-CA051008 tarafından finanse edilmektedir Georgetown Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Mikroskopi ve Görüntüleme Paylaşılan Kaynak (MISR) bir Leica SP8 Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor kullanılabilirliği ile ek desteklenmiştir. Biz minnetle Leica SP8 görüntüleme Peter Johnson tarafından asistanlığı ve Carl Zeiss Mikroskopi LLC Alma Arnold tarafından sağlanan görüntüleme yardımı ile Georgetown Üniversitesi'nde Thomas Coate, Biyoloji Bölümü laboratuarında Zeiss LSM880 kullanımını kabul. Bu yazıda içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anjiyotensin II (Ang II)Sigma-AldrichA9525 
Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-04437 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu 
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-AldrichF244237 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Penisilin Streptomisin (Pen Strep)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-12237 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco (yaşam teknolojileri)25030-08137 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
İnsan Embriyonik Böbrek (HEK)-293 hücreAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) CRL-1573Geçit numarası 5 - 12
Nunc Lab-Tek II odacıklı 1.5 Alman Kapak CamıSistemi Sigma-Aldrich155409
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifiThermoFisher Scientific11668019Store 4 & derece; C 
Opti-MEM, Azaltılmış Serum OrtamıGibco- ThermoFisher Scientific31985-07037 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
PBS 10x Fisher BioReagentsBP3994 37° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Dulbecco'nun Modifiye Eagle ortamı (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific31053-02837 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
LysoTracker Red DND-99moleküler problar -ThermoFisher ScientificL7528Aliquotes'u karanlıkta -20 ° C'de saklayın; C . 
Volocity Ver. 6.3 Görüntü Analiz yazılımıPerkinElmerGörselleştirme ve Kantitasyon ModülleriGörüntü yığınlarının 3D görüntü analizi için
Leica SP8 AOBSLeica Microsystemslazer tarama konfokal mikroskopGörüntü toplama için
Zeiss LSM 880Carl Zeisslazer taramalı konfokal mikroskopGörüntü toplama için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
  3. Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
  4. Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
  5. Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).
  6. Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).
  7. Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
  8. Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
  9. Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
  10. Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
  11. Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).
  12. Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613(2016).
  13. Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
  14. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  15. Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
  17. Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Anjiyotensin Resept r Trafi iHEK 293 H creleriGFP Etiketli Resept rlerLizozom Kolokalizasyonu3B G r nt AnaliziZaman Atlamal G r nt lemeResept r nnternalizasyonuFloresan Mikroskopi

İlgili makaleler