Yöntem makalesi

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

DOI:

10.3791/55177

⸱

27 Mart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı hücre görüntüleme aynı anda anjiotensin II (Ang II) ile uyarılmasını takiben transfekte insan embriyonik böbrek-293 (HEK) hücreleri anjiotensin tip 1a (1a R AT) reseptörleri ve hücre içi bölmelerin zaman atlamalı görüntü yakalamak için kullanılır. HEK hücreleri geçici plazmid DNA gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş 1a R AT içeren transfekte edilir. Lizozomlar kırmızı floresan boya ile tanımlanır. Canlı hücre görüntüleri Ang II uyarıldıktan sonra bir lazer tarama konfokal mikroskop yakalanan ve zamanla üç boyutlu (3D, vokseller) yazılım tarafından analiz edilir. Canlı hücre görüntüleme reseptör kaçakçılığı soruşturma sağlar ve tespit ile ilişkili boşa önler ve özellikle, EGFP etiketli membran reseptörlerinin kaybı veya artefactual deplasman. tek tek hücreler bir süre ile izlenir Böylece, reseptörlerin hücre içi lokalizasyonu görüntülenmiş ve ölçülebilir. Görüntüler sufficientl edinilmesi gerekiry hızla hızlı vezikül hareketini yakalamak için. Bununla birlikte, hızlı bir görüntüleme hızlarda toplandı, fotonların sayısı azalır. Uzlaşmalar da görüntüleme hız kazanmak amacıyla voksel boyutu gibi görüntüleme parametrelerinin seçimi yapılmalıdır. canlı hücre görüntüleme önemli uygulamaları ama bir kaç isim protein kaçakçılığı, göç, çoğalmasını, hücre döngüsü, apoptoz, otofaji ve protein-protein etkileşimleri ve dinamiklerini incelemek için vardır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

genel amacı, reseptör agonisti ile muamele edildikten sonra zaman ve belirli bir alt-hücresel organel reseptör ko alan sayısal kanıtı elde etmektir. Bu nedenle, burada acil hedefi zaman atlamalı konfokal lizozomlar görüntülerini ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde reseptör (HEK) elde edildi reseptörün yayınlamak için 3 boyutlu görüntüleme verileri transfeksiyonu takiben ve daha sonra bir araya getirmek ve analiz kapsayan bir transmembran yakalamak için lizozomlar. transmembran reseptör fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda nasıl düzenlendiği belirlemenize yardımcı olabilir reseptör ligandı tarafından aktive edildiğinde endositoz sırasında lizozomlar veya diğer ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birinci gün

1. Hücre Yayımlama

  1. Tam Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) hazırlayın. fetal bovin serumu (% 10) ile desteklenmiş tam DMEM 500 ml yapmak için DMEM 450 mL fetal sığır serumu, 50 mL, penisilin / streptomisin, 5 ml L-glutamin 5 ml, penisilin / streptomisin (% 1) ve L-glutamin (% 1).
  2. Tohum insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri, geçit sayısı 6-11 / 50.000 de hiç tam DMEM içinde 8 iyi odacıklı coverglass sisteminde.
  3. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de odacıklı slayt koruyun.

gün İki

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deney Örnek setinde, HEK hücreleri pEGFP-N2 plazmit 13 klonlanmıştır (1a R-GFP AT) anjiyotensin tip 1a reseptör yapısı (E1,2,3-1A R) ile transfekte edildi. HEK Time-lapse görüntüleri elde ve bir film (Canlı Hücre Görüntüleme 1 ve Canlı Hücre Görüntüleme 2 film bakınız) olarak çalındı. Film ve fotoğraf ligand uyarılmasından sonra, 1a AT R-EGFPs plazma membranında lokalize olduğunu gösteriyor, fak.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan ön deneyler 24 dakika gibi kısa bir sürede boyunca, lizozomlar AT 1a R-GFP teslim kayda değer bir değişiklik meydana geldiğini göstermektedir. Genel olarak, lızozomlara içselleştirilmiş reseptörlerin teslim gibi erken 15-20 dakika olarak meydana gelebilir. Bu deney 1a R AT içselleştirilmiş toplu büyük perinükleer endozomlardan hedeflenmektedir hipotezi ile tutarlıdır. R lizozomlarında geldiğinde 1a AT en azından bazı Li ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir dai.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda sunulan araştırma çalışmaları Kathryn Sandberg hibe R01 HL121456-01A1 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri P30-CA051008 tarafından finanse edilmektedir Georgetown Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Mikroskopi ve Görüntüleme Paylaşılan Kaynak (MISR) bir Leica SP8 Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor kullanılabilirliği ile ek desteklenmiştir. Biz minnetle Leica SP8 görüntüleme Peter Johnson tarafından asistanlığı ve Carl Zeiss Mikroskopi LLC Alma Arnold tarafından sağlanan görüntüleme yardımı ile Georgetown Üniversitesi'nde Thomas Coate, Biyoloji Bölümü laboratuarında Zeiss LSM880 kullanımını kabul. B....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anjiyotensin II (Ang II)Sigma-AldrichA9525 
Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-04437 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu 
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-AldrichF244237 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Penisilin Streptomisin (Pen Strep)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-12237 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco (yaşam teknolojileri)25030-08137 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
İnsan Embriyonik Böbrek (HEK)-293 hücreAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) CRL-1573Geçit numarası 5 - 12
Nunc Lab-Tek II odacıklı 1.5 Alman Kapak CamıSistemi Sigma-Aldrich155409
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifiThermoFisher Scientific11668019Store 4 & derece; C 
Opti-MEM, Azaltılmış Serum OrtamıGibco- ThermoFisher Scientific31985-07037 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
PBS 10x Fisher BioReagentsBP3994 37° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Dulbecco'nun Modifiye Eagle ortamı (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific31053-02837 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
LysoTracker Red DND-99moleküler problar -ThermoFisher ScientificL7528Aliquotes'u karanlıkta -20 ° C'de saklayın; C . 
Volocity Ver. 6.3 Görüntü Analiz yazılımıPerkinElmerGörselleştirme ve Kantitasyon ModülleriGörüntü yığınlarının 3D görüntü analizi için
Leica SP8 AOBSLeica Microsystemslazer tarama konfokal mikroskopGörüntü toplama için
Zeiss LSM 880Carl Zeisslazer taramalı konfokal mikroskopGörüntü toplama için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Anjiyotensin Resept r Trafi iHEK 293 H creleriGFP Etiketli Resept rlerLizozom Kolokalizasyonu3B G r nt AnaliziZaman Atlamal G r nt lemeResept r nnternalizasyonuFloresan Mikroskopi

İlgili makaleler