Yöntem makalesi

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

DOI:

10.3791/55191

⸱

14 Ocak 2017

 ,  , 
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B-LCLs'in kurulması için basit bir kırmızı kan hücre parçalama yöntemi kan küçük bir miktar gerektiren ve dondurarak saklama için başlangıcından itibaren zaman tasarrufu, yüksek ölümsüzleşme verimliliği ile geliştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B lenfositlerinin Epstein Barr virüsü tarafından in vitro olarak ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına dönüştürülmesi için bir dizi yöntem mevcuttur. Kırmızı kan hücresi parçalama yöntemi olan B-LCL'lerin kurulması için güçlü ve basit bir stratejiye sahip yeni bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, kırmızı kan hücresi çıkarılması ile PBMC ayırma prosedürünü basitleştirdi ve %100 başarı oranıyla nispeten kısa bir sürede büyük hücre sayılarına çoğalabilen EBV ölümsüzleştirilmiş hücre hatları oluşturmak için 0,5 mL kadar az tam kan kullandı. Yöntem basit, güvenilir, zaman kazandıran ve çok sayıda klinik numunenin tedavisi için uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinlenen B hücreleri, Epstein-Barr virüsü (EBV) tarafından in vitro olarak aktif olarak çoğalan B lenfoblastoid hücre dizilerine (B-LCL'ler) dönüştürülebilir. B-LCL'ler, farklılaşma ve gelişme açısından germ hücrelerine benzer ve B-LCL'lerin somatik mutasyon oranı, ihmal edilebilir genetik ve fenotipik değişiklikle sadece %0,3 idi1. Bu nedenle, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) için vekiller olarak B-LCL'ler, EBV ile ilişkili hastalıkların genomik, transkriptomik ve proteomik çalışmalarının ilerlemesini önemli ölçüde hızlandırmıştır2,3. Ayrıca, B-LCL'ler monoklonal antikorların taranmasında da önemli bir uygulamaya sahiptir4,5.

B lenfositlerinin EBV ile ölümsüzleştirilmesi için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. En yaygın prosedürler arasında B lenfositlerinin izolasyonu ve enfeksiyöz EBV üretmek için B95-8 hücre hatlarının kullanılması yer alır. İzolasyondan dönüşüme kadar bu yöntemler üç stratejiye ayrılır. Bu çalışmada yoğunluk gradyan ayırma yöntemi olarak adlandırılan yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve EBV transformasyonu ile doğrudan6-8 lenfositler taze kandan ayrılmaktadır. Bununla birlikte, diğer teknikler taze kanın taşınması zorluğunun üstesinden gelir ve saflaştırılmış lenfositlerin dondurulması ve ardından çözülme ve EBV enfeksiyonu9-11 için bir prosedür kullanır. Dondurularak saklanmış tam kan, B lenfositlerinin izolasyonu ve transformasyonu için de kullanılabilir12,13. B lenfositlerini ayırmak için yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye ek olarak, bazı araştırmacılar B lenfositlerini12 seçmek için bir manyetik hücre sıralayıcı kullanır. Bununla birlikte, manyetik ayırma pahalı, karmaşık ve zaman alıcı bir işlemdir. Bu yöntemler B lenfositlerini yüksek başarı oranı ile ölümsüzleştirmek için faydalı olsa da, çok sayıda klinik örneğin tedavi edilmesi gerekliliği ve nispeten küçük hacimdeki kan, kalıcı hücre hattı oluşturulması için daha basit bir yöntem gerektirmektedir.

Daha az yaygın olarak kullanılan bir başka yöntem, EBV enfeksiyonu ve B-LCL'lerin kurulması için çekirdekli hücrelerin kaynağı olarak tam kanın kullanılmasıdır. Bu yöntemler, ayırma prosedürünü atlayarak tekniği basitleştirir. Hücre hatlarını elde etmek için sadece küçük bir miktar, taze14 veya dondurulmuş15,16 tam kan yeterlidir. Ne yazık ki,15,16 numaralı belgelerden ve birkaç doğrulama testimizin başarısında büyük farklılıklar vardır. Ayrıca, dönüştürülmüş koloniler, büyük kirletici safsızlıklar nedeniyle mikroskop altında neredeyse hiç tanınmaz. Bu nedenle, dönüşüm için daha güvenilir bir yöntem gereklidir.

Yukarıdaki düşüncelere dayanarak, lenfositlerin önceden saflaştırılması olmadan B-LCL'leri oluşturmak için kırmızı kan hücresi lizis yöntemi olarak adlandırılan yeni bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem uygundur, zaman kazandırır ve çok sayıda numuneye uygulanabilir. Bebeklerden ve yaşlılardan sağlıklarına önemli ölçüde zarar vermeden kolayca elde edilebilen B-LCL'leri elde etmek için 0.5 mL kadar az tam kan yeterliydi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Genetik ve Gelişimsel Biyoloji Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylandı ve protokol insan refahı için kurumsal kuralları takip eder.

EB Virüs hazırlanması 1.

  1. 1. günde, 6 mL B95-8 hücreler ve kültür çözülme tam RPMI 1640 ortamı, bir% 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin ve antibiyotikler (100 ug / ml streptomisin, 100 U / ml penisilin) ​​ile desteklenmiş T25 kültürü şişesi. 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübatörde kültür şişesi yerleştirin.
  2. 2 gün, mikroskop altında hücre morfolojisi gözlemlemek. Onlar parlak ve yuvarlak olduğunda Hücreler iyi durumda. 10 ml tam RPMI 1640 ortamı ekleyin.
  3. 4. günde, 10 ml taze tam RPMI 1640 ortamı ekleyin ve sonra T75 kültür şişesine aktarın.
  4. 8. günde, 20 ml tam RPMI 1640 ortamı ilave edin.
  5. Yani taze orta, açlık eklemeden 8 gün boyunca hücreleri korumak.
  6. günde 16, hücreleri gözlemlemekmikroskop altında gözlenmiştir. 15 ml bir santrifüj tüpüne, 12 ml / tüp hücreleri toplamak.
  7. 1 saat boyunca -80 ° C'de dondurularak korumak ve daha sonra hızlı bir şekilde 37 ° C'de eritin. Virüs partikülleri hücrelerin serbest kadar 3 kez tekrarlayın.
  8. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 240 x g'de santrifüjleyin.
  9. -80 ° C de 0.22 mikron filtre, kısım, 12 ml / tüp ve mağaza süpernatanın filtre.

Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tampon ile Tüm Kanı 2. Tedavi

  1. 15 ml tüp EDTA · K 2 tarafından Antikoagüle 0.5 mL tam kan ekleyin.
  2. Bütün kan (kullanmadan önce 0,22 um filtre ile filtre edildi ve oda sıcaklığına kadar çözündürüldü) 1 ml kırmızı kan hücre parçalama tamponu kondu ve iyice karıştırın. 4 dakika boyunca oda sıcaklığında karışım yerleştirin. durdurma reaksiyonu hızlı 7 mL 1x PBS - O 5 ekleyin.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 240 x g'de santrifüjleyin. Beyaz kan hücrelerinin, tüpün alt çökelecektir.
  4. supernatant atmak ve 7 ml 1640 temel orta ekleyerek yağış yıkayın. Oda sıcaklığında 240 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj. İki kez tekrarlayın.
  5. (% 20 fetal bovin serumu ve 10 ug / ml fitohemaglutinin (PHA) ihtiva eden, RPMI 1640 ortamı) 300 uL dönüşüm ortamı içinde hücre pelletini.

3. EBV enfeksiyonu

  1. Hücre süspansiyonu 20 ug / mL, siklosporin A, 60 ul (CSA) ekleyin.
  2. Hızla 37 ° C'de EBV bir kısım Çözülme. hücre süspansiyonu 240 mcL EBV ekleyin.
  3. İyice karıştırın ve oyuk başına, 96 çukurlu bir levhaya 200 uL hücre süspansiyonu yerleştirin. , Buharlaşmayı önlemek 96 oyuklu plakanın çevresindeki her bir oyuğa 200 uL 1x PBS ekleyin. 37 ° C'de bir% 5 CO2 inkübatörü içinde plaka koyun.

B-LCLs'in 4. Genişleme ve Kryoprezervasyon

  1. EBV enfeksiyonu sonrası ilk ay haftada bir kez orta yarısı değiştirin. Sadece kalın layeHücre fragmanları R 7. günde (Şekil 2) mikroskop altında görülebilir. EBV enfeksiyonu Bir ay sonra, lenfoblastoid hücre kümeleri mikroskobu (Şekil 2) altında hücre parçalarının kalın bir tabaka altında görebilir.
  2. Hücre kümeleri açıkça mikroskop (Şekil 2) altında görünür olana kadar her 3 günde bir orta yarısı değiştirin. Tipik haliyle, bu işlem, 10 ila 20 gün sürer.
  3. Karıştırma işleminden sonra, hücreler pipetleme ve 24 yuvalı plakaya aktarılır. sarı döner iken tam RPMI 1640 ile kültür ortamı hacmi ikiye katlayın. Bu işlem, hücre büyümesinin hızına bağlıdır.
  4. Daha sonra, T25 kültür şişelerinde hücreleri transferi. 15 ml - orta hacmi 10 genişler kadar sarıya döner olarak kültür ortamı hacmi ikiye katlayın.
  5. dondurmadan önce orta 24 saat değiştirin. 240 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje hücre süspansiyonu. FR 10 x 10 6 / mL - 5 bir yoğunlukta bir hücre sayacı ve dondurularak ile hücre sayımı% 90 FBS ve% 10 dimetilsülfoksit (DMSO) ihtiva eden Özen stok çözeltisi. -80 ° C'ye kadar ve dakika başına 1 ° C bir hızda dondurma ve daha sonra doğrudan sıvı azot içine aktarın.

5. 3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolyum bromürde (MTT) deneyi 17

  1. % 10 fetal sığır serumu ihtiva eden 1640 ortamı ile bir B-LCLs'in tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. De üzerinde 96 oyuklu plaka başına tohum 3 x 10 4 hücre, oyuk başına 100 uL.
  2. 16 saat - 12 ve 37 ° C 'de CO2 inkübatör% 5 plaka koyun.
  3. Hücreler büyüdükten edildiği çukurlara MTT (5 mg / ml) ilave edilir ve 37 ° C'de 4 saat boyunca ışıktan uzak tutulur.
  4. 168 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj hücre plakası.
  5. Süpernatantı ve oyuk başına 100 uL DMSO ilave edin.
    NOT: Dikkatli olun. iğne şeklindeki boya kristalleri dokunmayın.
  6. kristalleri tamamen çözünmesi için düşük hızda 10 dakika için plakayı sallayın.
  7. 570 nm ölçün emmeBir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dönüşüm işlemi sırasında hücrelerin morfolojik değişimler ışık mikroskobu (Şekil 2) tarafından görüntülenmiştir. Hücre parçaları yalnızca kalın tabaka alyuvar lisiz yöntemi görebilir ise küçük hücre kümeleri, 7 günlük enfeksiyon sonrası yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile açık bir şekilde görülebildi. Bununla birlikte, lenfoblastoid hücre kümeleri 30 gün enfeksiyondan hücre parçalarının kalın bir tabaka altında görebilir. daha sık orta değişiklikle, hücre enkaz azalır ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu, kırmızı kan hücrelerinin lize kandan insan B hücrelerini ölümsüz için yeni bir yöntemle geliştirilmesi rapor etmekte ve B-LCLs'in MTT testi ile değerlendirildi oluşturulan kendi hücredeki mevcudiyetini göstermektedir. Sonuçlar alyuvar lisiz yöntemi ile kurulan B-LCLlerin hücre canlılığı yoğunluk gradyan ayırma yöntemi çok daha yüksek olduğunu göstermiştir. Kırmızı kan hücresi parçalama yöntemin başlıca avantajı, basit ve yüksek başarı oranına ve hücre yaşayabilirliği ile kalıcı bir hücre hattı kurmak için kan (0...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Bilimler Akademisi'nin (KFZD-SW-205), Çin Bilimler Akademisi'nin stratejik biyolojik kaynaklar teknolojisi destek sisteminin (CZBZX-1) ana projeleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SantrifüjTechcompCT6TSantrifüjleme
Otomatik Hücre Sayacı Countstar  IC 1000 Hücre sayımı için 
Epoch Mikroplaka SpektrofotometresiBioTek InstrumentsSN263839Absorbansı ölçmek için
96 kuyulu hücre kültürü kümesiCorning Incorporated3599Polistiren plakalar
24 kuyulu hücre kültürü kümesiCorning Incorporated3524Polistiren plakalar
25 cm2 hücre kültürü şişesiNest707001Polistiren ve nbsp;
FBSGibco10270B-LCL'lerin Bileşeni Orta
RPMI Orta 1640Gibco31800-022B-LCL'ler için orta
L-Glutamin   Amresco0374B-LCL'lerin bileşeni
ortam 100x streptomisin penisilin çözeltisi BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309B-LCL'lerin orta
Ficoll paque artıGE  Sağlık Hizmetleri17-1440-03in vitro lenfosit izolasyonu için
PHA-MSigmaL8902Lenfosit proliferasyonunu uyarmak için
Cyclosporin ACayman  Kimyasal12088T hücrelerinin sitotoksisite etkisini inhibe etmek için
Kırmızı hücre lizis tamponuTiangenRT122-01Kırmızı kan hücresini parçalamak için
MTT Amresco0793Hücre canlılığının tespiti için
DMSOSigmaD2650Hücreleri dondurmak için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
  2. Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118(2006).
  3. Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
  4. Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
  5. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  6. Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
  7. Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
  8. Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
  9. Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
  10. Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
  11. Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
  12. Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
  13. Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
  14. Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
  15. Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
  16. Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
  17. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
  18. Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
  19. Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
  20. Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
  21. Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EBV TransformasyonuTam Kan lemePeriferik Kan Monon kleer H creleriSiklosporin A TedavisiMTT Canl l k AnaliziKriyoprezervasyon ProtokolEBV Viral retimiH cre K lt r Geni letme

İlgili makaleler